Gene expression analysisQuantitativ

Gene expression analysis
Quantitative PCR following reverse transcription of purified E. coli RNA was used to assess expression
of the acrA, acrB, acrD, mdtA, mdtB, ompC, and ompF genes, as well as the small RNA
micF. EPI300 harboring pCRC03UVRA or pUVRA28b was grown in LB supplemented with
kanamycin to an OD600 value of 0.5 and the cells were harvested by centrifugation. Total RNA
was purified using the RNeasy Mini kit according to the manufacturer’s specifications (Qiagen).
Purified RNA was quantified using a Take3 micro-volume plate with UV spectrophotometry
(BioTek) and supplemented with the SUPERase•In RNase inhibitor (Life Technologies).
Purified RNA was subjected to RNase-free DNase (Promega) treatment to eliminate any contaminating
DNA. 500ng DNase-treated RNA was used for cDNA synthesis using SuperScript
VILO mastermix (Invitrogen) in a 20μl reaction at 42°C for 2 h. Quantitative PCR was performed
on 1μl of a 1:8 dilution of the resulting cDNA in a 10μl reaction that contained 300 nM
PCR primers (Table 2) and SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). The
PCRs amplified a ~70–200 base region of DNA in each case (acrA 189 bp, acrB 183 bp, acrD
187 bp, mdtA 103 bp, mdtB 101 bp, ompF 92 bp, ompC 95 bp, micF 70 bp). Quantitative PCR
was performed on a CFX384 real-time PCR detection system (Bio-Rad) using the following cycling
parameters: one cycle at 95°C for 10 min as hot start, followed by 40 cycles of denaturation
at 95°C for 30 s, annealing at 47°C (acrA/B/D) or 52°C (mdtA/B) or 55°C (ompC/F) or
45°C (micF) for 30 s, and extension at 72°C for 30 s. Control PCRs were also included using a
reverse transcriptase-minus (RT-minus) template to verify that genomic DNA did not contribute
to the observed results. Expression levels under each condition were normalized to the
GAPDH housekeeping gene [23]. Melting curve analysis (65–99°C with a heating rate of 1°C

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์ยีนนิพจน์เชิงปริมาณ PCR ต่อกลับ transcription ของ E. coli บริสุทธิ์ที่ใช้ในการประเมินนิพจน์อาร์เอ็นเอของ acrA, acrB, acrD, mdtA, mdtB, ompC และ ompF ยีน อาร์เอ็นเอขนาดเล็กmicF มีปลูก EPI300 harboring pCRC03UVRA หรือ pUVRA28b ปอนด์เสริมด้วยกานามัยซินค่า OD600 0.5 และเซลล์ถูกเก็บเกี่ยว โดย centrifugation อาร์เอ็นเอทั้งหมดที่บริสุทธิ์ใช้ชุดมินิ RNeasy ตามข้อกำหนดของผู้ผลิต (Qiagen)อาร์เอ็นเอบริสุทธิ์ถูก quantified ด้วยจานปริมาณไมโคร Take3 UV spectrophotometry(BioTek) และเสริม ด้วยสารยับยั้ง SUPERase•In RNase (ชีวิตเทคโนโลยี)อาร์เอ็นเอบริสุทธิ์ถูกยัดเยียดการรักษาฟรี RNase DNase (Promega) เพื่อกำจัดขยะต่าง ๆดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอถือว่า DNase 500ng ถูกใช้สำหรับการสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ตัวยกVILO mastermix (Invitrogen) ในปฏิกิริยา 20μl ที่ 42° C สำหรับ 2 h. PCR เชิงปริมาณได้ดำเนินการใน 1μl ของการเจือจาง 1:8 ของ cDNA ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยา 10μl ที่อยู่ 300 nMไพรเมอร์ PCR (ตารางที่ 2) และ SsoAdvanced สากล SYBR Green Supermix (ไบ-Rad) ที่PCRs ขยาย ~ 70-200 ระบบพื้นฐานของดีเอ็นเอแต่ละกรณี (bp acrA 189, bp acrB 183, acrD187 bp, bp mdtA 103, bp mdtB 101, bp ompF 92, bp ompC 95, bp micF 70) PCR เชิงปริมาณทำตาม CFX384 แบบเรียลไทม์ PCR ตรวจหาระบบ (ไบ-Rad) ใช้จักรยานต่อไปนี้พารามิเตอร์: วงจรหนึ่งที่ 95° C สำหรับ 10 นาทีเป็นเริ่มร้อน ตามวงจร 40 การ denaturationที่ 95° C สำหรับ 30 s การอบเหนียวที่ 47° C (acrA/B/D) หรือ 52° C (mdtA B) หรือ 55° C (ompC/F) หรือ45° C (micF) 30 s และส่วนขยายที่ 72° C สำหรับ 30 s ได้ควบคุม PCRs ยังถูกรวมโดยใช้การแม่กลับ transcriptase-เครื่อง (เครื่อง RT) เพื่อตรวจสอบว่า genomic DNA ก็ไม่สนับสนุนเพื่อผลลัพธ์ที่สังเกต นิพจน์ระดับภายใต้เงื่อนไขแต่ละเงื่อนไขได้ตามปกติเพื่อยีนการทำความสะอาด GAPDH [23] ละลายวิเคราะห์โค้ง (65-99° C มีอัตราความร้อน 1 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน
PCR เชิงปริมาณต่อไปนี้การถอดรหัสย้อนกลับของบริสุทธิ์เชื้อ E. coli RNA ถูกใช้ในการประเมินการแสดงออก
ของ Acra, acrB, acrD, MdTA, mdtB, OMPC และยีน ompF เช่นเดียวกับอาร์เอ็นเอขนาดเล็ก
micF EPI300 เก็บงำ pCRC03UVRA หรือ pUVRA28b ถูกปลูกใน LB เสริมด้วย
kanamycin เป็นค่า OD600 0.5 และเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง รวม RNA
บริสุทธิ์โดยใช้ชุด RNeasy มินิตามข้อกำหนดของผู้ผลิต (Qiagen).
บริสุทธิ์ RNA ของปริมาณการใช้แผ่น Take3 ปริมาณขนาดเล็กที่มี spectrophotometry ยูวี
(Biotek) และเสริมด้วย SUPERase •ในการยับยั้ง RNase (เทคโนโลยีชีวิต).
บริสุทธิ์ อาร์เอ็นเอยู่ RNase ฟรี DNase (Promega) การรักษาเพื่อกำจัดการปนเปื้อนใด ๆ
ดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ 500ng DNase รับการรักษาที่ใช้สำหรับการสังเคราะห์ cDNA ใช้ยก
Vilo mastermix (Invitrogen) ในปฏิกิริยา20μlที่ 42 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมง PCR เชิงปริมาณที่ได้ดำเนินการ
ใน1μlของ 1: 8 ลดสัดส่วนของยีนที่มีผลในการเกิดปฏิกิริยา10μlที่มี 300 นาโนเมตร
ไพรเมอร์พีซีอาร์ (ตารางที่ 2) และยูนิเวอร์แซ SsoAdvanced SYBR สีเขียว Supermix (Bio-Rad)
PCRs ขยาย ~ 70-200 ภูมิภาคฐานของดีเอ็นเอในแต่ละกรณี (ACRA 189 bp, acrB 183 bp, acrD
187 bp, MdTA 103 bp, mdtB 101 bp, ompF 92 bp, OMPC 95 bp, micF 70 bp) PCR เชิงปริมาณ
ที่ได้ดำเนินการใน CFX384 เรียลไทม์ระบบตรวจ PCR (Bio-Rad) โดยใช้การขี่จักรยานต่อไปนี้
พารามิเตอร์หนึ่งรอบที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีในขณะที่เริ่มร้อนตามด้วย 40 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ
ที่ 95 ° C เป็นเวลา 30 วินาที อบที่ 47 ° C (ACRA / B / D) หรือ 52 องศาเซลเซียส (MdTA / B) หรือ 55 ° C (OMPC / F) หรือ
45 ° C (micF) สำหรับ 30 วินาทีและส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 s PCRs ควบคุมนอกจากนี้ยังรวมถึงการใช้
transcriptase ลบกลับ (RT-ลบ) แม่แบบเพื่อตรวจสอบว่าดีเอ็นเอไม่ได้มีส่วนร่วม
ในการสังเกตผล ระดับการแสดงออกภายใต้เงื่อนไขแต่ละปกติในการ
ดูแลทำความสะอาดยีน GAPDH [23] จุดหลอมเหลววิเคราะห์เส้นโค้ง (65-99 องศาเซลเซียสมีอัตราความร้อน 1 ° C

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน
ปริมาณ PCR ต่อไปนี้ถอดความย้อนกลับของบริสุทธิ์ E . coli RNA ถูกใช้เพื่อประเมินการแสดงออกของ ACRA acrb
, acrd mdta mdtb , , , , ompc และ ompf ยีน รวมทั้ง micf RNA
ขนาดเล็ก epi300 harboring pcrc03uvra หรือ puvra28b โตในปอนด์เสริม
นเป็น od600 ค่า 0.5 และเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยง
อาร์เอ็นเอทั้งหมดบริสุทธิ์โดยใช้ชุดมินิ rneasy ตามข้อกําหนดของผู้ผลิต ( เพิ่ม ) .
บริสุทธิ์ RNA เป็น quantified ใช้ take3 ไมโครปริมาณจาน
วิธียูวี ( biotek ) และเสริมด้วย superase เลส - ใช้เทคโนโลยีในชีวิต )
บริสุทธิ์ RNA ก็ยังถูกตรวจหา ADNase เลสฟรี ( promega ) การรักษาเพื่อขจัด ใด ๆที่ปนเปื้อน
ดีเอ็นเอ500ng ตรวจหา ADNase ซึ่งถือว่าเป็นใช้สำหรับการสังเคราะห์ cDNA ใช้ตัวยก
vilo mastermix ( Invitrogen ) ใน 20 μ L ปฏิกิริยาที่ 42 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ปริมาณเชื้อมีการμ
1 L ของ 8 เจือจางส่งผลให้ยีนใน 10 μปฏิกิริยา PCR ไพรเมอร์ที่ผมมี 300 nm
( ตารางที่ 2 ) ssoadvanced สากลและ supermix สีเขียว SYBR ( ไบโอ ราด )
pcrs ขยาย ~ 70 – 200 ฐานเขตของ DNA ในแต่ละกรณี ( ACRA 189 / acrb 183 BP , acrd
187 BP , mdta 103 BP , mdtb 101 / 92 ompf BP ompc 95 / 70 micf BP )
วิธีเชิงปริมาณที่แสดงในเวลาจริงการตรวจสอบระบบ ( ไบโอดีเอ็นเอ cfx384 RAD ) โดยใช้พารามิเตอร์จักรยาน
ต่อไปนี้ : หนึ่งรอบที่ 95 องศา C เป็นเวลา 10 นาที เมื่อเริ่มร้อนตาม 40 รอบ ( 95 องศา C
ที่ 30 วินาทีอบอ่อนที่อุณหภูมิ 47 ° C ( ACRA / B / D ) หรือ 52 ° C ( mdta / B ) หรือ 55 ° C ( ompc / 45 ° C หรือ F )
( micf ) 30 , และส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที การควบคุม pcrs ยังรวมถึงการใช้
reverse transcriptase ( RT ด้วย ลบแม่แบบเพื่อตรวจสอบดีเอ็นเอไม่ได้มีส่วนร่วม
เพื่อตรวจสอบผลลัพธ์ ระดับการแสดงออกในแต่ละสถานการณ์ที่เป็นปกติกับ
gapdh แม่บ้านยีน [ 23 ]จุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้ง ( 65 – 99 °องศาเซลเซียสด้วยอัตราความร้อน 1 ° C