A 400-bp competitor DNA fragment wa

A 400-bp competitor DNA fragment was prepared with
complementary sequences to the R. solani AG-3 specific primers,
Rs1F2 and RsR1, on each end using a Competitive DNA Construction
Kit (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). The PCR reaction solution
was prepared as instructed by the manufacturer, followed by the
addition of primers (Rs1F2 and Rs2R1, 0.5 lM each), 1010 lg of
competitor DNA, and 4 lL of template DNA solution to each
reaction mixture in a total volume of 20 lL. PCR was performed
using a Takara PCR Thermal Cycler Dice Standard under the
following thermal conditions: initial denaturation at 95 C for
2 min, 35 cycles of denaturation at 95 C for 45 s, annealing at
65 C for 60 s, extension at 72 C for 90 s, and an extension at
72 C for 5 min. The reaction solution was subjected to electrophoresis
on a 2% agarose gel and stained with SYBR Green I
(Molecular Probes, Eugene, OR, USA). The staining band intensities
for each PCR product were measured using an image analyzing
system (Phoretix, Nonlinear Dynamics Ltd., UK). A standard plot
was prepared by plotting the band intensity ratios in the
competitive PCR assay of the amplicon from R. solani and that of
the DNA competitor against the quantity of DNA from R. solani in
each reaction.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ส่วนดีเอ็นเอคู่แข่ง 400 bp ได้พร้อม
เสริมลำดับที่ที่ R. solani AG 3 เฉพาะไพรเมอร์,
Rs1F2 และ RsR1 ในแต่ละใช้สร้างดีเอ็นเอแข่งขัน
ชุด (Takara ชีวภาพ Inc. โอสึ ญี่ปุ่น) โซลูชั่นปฏิกิริยา PCR
ถูกจัดเตรียมตามที่แนะนำ โดยผู้ผลิต ตาม
แห่งไพรเมอร์ (Rs1F2 และ Rs2R1, 0.5 lM แต่ละ), 10 lg 10 ของ
คู่แข่งดีเอ็นเอ และ 4 จะของดีเอ็นเอแม่แบบแต่ละ
ผสมปฏิกิริยาในปริมาณผลรวมของ 20 จะ ทำ PCR
ใช้เป็น Takara PCR ร้อน Cycler ลูกเต๋ามาตรฐานภายใต้การ
ต่อสภาพความร้อน: denaturation เริ่มต้นที่ 95 C สำหรับ
2 นาที รอบ 35 ของ denaturation ที่ 95 C สำหรับ 45 s การอบเหนียวที่
C 65 60 s, 72 C สำหรับ 90 s และส่วนขยายที่
C 72 สำหรับ 5 นาที โซลูชั่นปฏิกิริยาถูกยัดเยียดให้ electrophoresis
ใน agarose 2% เจ และสีกับ SYBR Green ฉัน
(Probes โมเลกุล Eugene, OR สหรัฐอเมริกา) ปลดปล่อยก๊าซวง staining
สำหรับแต่ละผลิตภัณฑ์ PCR ถูกวัดโดยใช้การวิเคราะห์ภาพ
ระบบ (Phoretix ไม่เชิงเส้น Dynamics Ltd., UK) แผนมาตรฐาน
ถูกเตรียมไว้ โดยอัตราส่วนความเข้มวงในพล็อต
แข่งขันทดสอบ PCR ของ amplicon จาก R. solani ที่
คู่แข่งดีเอ็นเอเทียบกับปริมาณของดีเอ็นเอจาก R. solani ใน
แต่ละปฏิกิริยา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ส่วน 400 bp ดีเอ็นเอคู่แข่งที่ได้รับการจัดทำ
ลำดับประกอบกับเชื้อรา R. solani AG-3 ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง
Rs1F2 และ RsR1 เมื่อสิ้นสุดการใช้งานดีเอ็นเอแข่งขันแต่ละ
ชุด (Takara Bio อิงค์โอตสึ, ญี่ปุ่น) การแก้ปัญหาการเกิดปฏิกิริยาพีซีอาร์
ได้รับการจัดทำขึ้นตามคำสั่งของผู้ผลิตตาม
การเพิ่มขึ้นของไพรเมอร์ (Rs1F2 และ Rs2R1 0.5 LM แต่ละ), 10? 10 LG ของ
ดีเอ็นเอคู่แข่งและ 4 lL ของการแก้ปัญหาดีเอ็นเอแม่แบบให้กับแต่ละ
ผสมปฏิกิริยารวม ปริมาณ 20 lL PCR ได้รับการดำเนินการ
โดยใช้ความร้อน Takara PCR Cycler ลูกเต๋ามาตรฐานภายใต้
สภาวะที่มีอุณหภูมิต่อไปนี้:? denaturation เริ่มต้นอยู่ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
2 นาที, 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 C เป็นเวลา 45 วินาที, การหลอมที่?
65 C เป็นเวลา 60 วินาที, ขยายที่? 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 90 วินาที, และส่วนขยายที่
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที การแก้ปัญหาการเกิดปฏิกิริยาถูกยัดเยียดให้ electrophoresis
บนเจล agarose 2% และย้อมด้วยสีเขียว SYBR ฉัน
(วัดระดับโมเลกุล, Eugene, OR, USA) การย้อมสีเข้มวง
สำหรับแต่ละผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกวัดโดยใช้การวิเคราะห์ภาพ
ระบบ (Phoretix เชิง Dynamics จำกัด , UK) พล็อตมาตรฐาน
ได้รับการจัดทำขึ้นโดยการวางแผนอัตราส่วนความเข้มวงใน
การแข่งขันทดสอบ PCR ของ amplicon จากเชื้อรา R. solani และของ
คู่แข่งดีเอ็นเอกับปริมาณของดีเอ็นเอจากเชื้อรา R. solani ใน
แต่ละปฏิกิริยา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

400 คู่แข่ง BP ดีเอ็นเอเตรียมเสริมด้วย
ลำดับเพื่อ R . solani เฉพาะ ag-3 ไพรเมอร์
rs1f2 rsr1 และในแต่ละสิ้นสุดการแข่งขัน DNA ก่อสร้าง
Kit ( ทาการะ ไบโอ อิงค์ , โอ๊ต , ญี่ปุ่น ) การตรวจปฏิกิริยาสารละลาย
เตรียมตามคำแนะนำจากผู้ผลิต ตามด้วย
2 ( rs1f2 rs2r1 ไพรเมอร์และ 0.5 โดยแต่ละ ) , 10  10 LG
ดีเอ็นเอของคู่แข่งและ 4 จะของสารละลายดีเอ็นเอแม่แบบแต่ละ
ปฏิกิริยาผสมในปริมาณรวม 20 จะ โดยการใช้ความร้อนจาก Takara

รอบลูกเต๋ามาตรฐานภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ : เริ่มต้นที่ความร้อน ( 95  C
2 นาที 3 รอบ ( 95  C 45 S , อบอ่อนที่อุณหภูมิ 65 C
 60 s , ส่วนขยายที่ 72  C 90 s และนามสกุล ที่ 
72 C 5 นาทีปฏิกิริยาในสารละลายเอนไซม์บนเจล ( ภายใต้
2 % และย้อมด้วยสีเขียว SYBR
( โมเลกุลโพรบ ยูจีน หรือ สหรัฐอเมริกา ) การย้อมสีวงดนตรีเข้ม
สำหรับแต่ละผลิตภัณฑ์ถูกวัดโดยใช้เทคนิคภาพวิเคราะห์ระบบ ( UK พลศาสตร์ไม่เชิงเส้น
phoretix , Ltd . ) a
พล็อตมาตรฐานเตรียมวางแผนวงเข้มใน
อัตราส่วนแข่งขัน PCR assay ของ R . solani และจากและที่ของ
ดีเอ็นเอคู่แข่งกับปริมาณของดีเอ็นเอจาก R . solani ใน
แต่ละปฏิกิริยา