MaC2H2-1/2 were cloned into pGEX-4T

MaC2H2-1/2 were cloned into pGEX-4T-1 (Amersham Biosciences)to fuse in frame with GST and expressed in BM Rosetta(DE3) by induction with 1 mM of isopropyl-b-D-thiogalactopyr-amoside (IPTG) for 6 h at 30 C. The recombinant protein waspurified with Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare). The EMSAwas performed using the EMSA kit (Thermo) according to themanufacturer's instructions. The probes containing A[C/G]Tderived from MaACS1 and MaACO1 promoters were labeled withbiotin using DNA 3' End Biotinylation Kit (Thermo). The sameunlabeled DNA fragment was used as a competitor. After crosslinking, the membrane was detected by the chemiluminescencemethod according to the manufacturer's protocol on a ChemiDocTMMP Imaging System (Bio-Rad). The primers used in proteinexpression and EMSA assay are listed in Supplementary Table 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

MaC2H2-1/2 โคลนลงใน pGEX 4 ที 1 (วิทยาศาสตร์ชีวภาพในระดับ Amersham) การฟิวส์ในกรอบ GST และแสดงใน BM Rosetta(DE3) โดยการเหนี่ยวนำกับ 1 มม.ของ isopropyl-b-D-thiogalactopyr-amoside (IPTG) สำหรับ 6 h ที่ 30 c Waspurified recombinant โปรตีน ด้วยกลูตาไธโอน Sepharose 4B (GE สุขภาพ) EMSAwas ที่ดำเนินการโดยใช้ชุด EMSA (เทอร์โม) ตามคำแนะนำของ themanufacturer หัววัดที่ประกอบด้วย Tderived [C/G] จากก่อการ MaACS1 และ MaACO1 ที่ชื่อ withbiotin โดยใช้ดีเอ็นเอ 3' สิ้นสุด Biotinylation Kit (เทอร์โม) ส่วนดีเอ็นเอ sameunlabeled ถูกใช้เป็นคู่แข่ง หลังจาก crosslinking เมมเบรนถูกตรวจพบ โดย chemiluminescencemethod ตามโพรโทคอลผู้ผลิตระบบการ ChemiDocTMMP ภาพ (ไบโอ-Rad) ไพรเมอร์ที่ใช้ใน proteinexpression และ EMSA ทดสอบอยู่ใน 1 ตารางเสริม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

MaC2H2-1 / 2 ถูกโคลนเข้าไปใน pGEX-4T-1 (Amersham ชีววิทยาศาสตร์) ที่จะหลอมรวมในกรอบกับ GST และแสดงใน BM Rosetta (DE3) โดยการเหนี่ยวนำ 1 มิลลิเมตร isopropyl-BD-thiogalactopyr-amoside (IPTG) เวลา 6 ชั่วโมง วันที่ 30 องศาเซลเซียสโปรตีน waspurified กับกลูตาไธโอน Sepharose 4B (GE Healthcare) EMSAwas ดำเนินการโดยใช้ชุด EMSA (เทอร์โม) ตามคำแนะนำของ themanufacturer ฟิวส์ที่มี [C / G] Tderived จาก MaACS1 และ MaACO1 โปรโมเตอร์มีป้าย withbiotin ใช้ชุด End Biotinylation ดีเอ็นเอ 3 '(เทอร์โม) sameunlabeled ดีเอ็นเอชิ้นส่วนที่ใช้เป็นคู่แข่ง หลังจากที่เชื่อมขวาง, เมมเบรนที่ถูกตรวจพบโดย chemiluminescencemethod ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตในระบบการถ่ายภาพ ChemiDocTMMP (Bio-Rad) ไพรเมอร์ที่ใช้ในการ proteine​​xpression และ EMSA ทดสอบมีการระบุไว้ในตารางที่ 1 เสริม