3.3. Empirical multiplex RT-PCR tes

3.3. Empirical multiplex RT-PCR tests

Both RT-PCR with each individual primer pair and multiplex RT-PCR with four primer pairs were independently tested using 46 influenza viral samples. In singlexplex RT-PCR assays, it was found that several conventional primers with multiple degenerate codes are likely to tolerate mismatches, leading to co-amplification with other lineage groups (data not shown). To alleviate the problem, four primer pairs named as 3(PB2), 4 (PB2), 7(PA), and 9(NP) were manually modified to apply the DPO system (Table 1).

After the validation of each primer pair, multiplex RT-PCR tests were performed with four possible combinations of eight segments. The segment combinations are as follows: (1) PB2 + PA + PB1 + M; (2) NP + PB2 + PB1 + PA; (3) NP + PB2 + PA + PB1; (4) PB2 + PB1 + NA8 + M; (5) NP + PB1 + NA8 + HA3; (6) PA + NS + PB1 + M; (7) PB2 + NA8 + NP + M; (8) PA + NA8 + PB1 + HA3. Seven viral samples from distinct lineage groups were selected for multiplex RT-PCR using the eight sets. During the tests, the seven viral samples were replaced with different viruses in the same lineages. The PCR results are presented in Fig. 3 (PCR results using 46 samples are available on request). In Fig. 3, M segment (15: 211 bp, 16: 180 bp) of all influenza viruses were successfully amplified with other primers in SET 1, 4, 6, and 7. Also, the four segment amplifications in SET 2, 4, 5, and 8 were appreciably observed without cross-reactivity with other influenza hosts.

Selected multiplex RT-PCR results based on primers listed in Table 1. PCR ...
Fig. 3.
Selected multiplex RT-PCR results based on primers listed in Table 1. PCR product size was determined using a 100 bp marker (Bioneer Corp., Deajeon, South Korea). Influenza viral samples from different hosts are listed in the box (more detailed information, see Appendix Table 1).
Figure options
Due to the limited number of influenza virus samples, primer sensitivity and specificity could not be fully evaluated. However, through comparison of the in silico and in vitro results, multiplex RT-PCR results with candidate primers could be estimated, and in most cases their results were consistent.

4. Discussion
Even though the mechanisms of genomic reassortment in AIVs remain unknown and the analysis of an entire genome is a time-consuming process, identification and monitoring of newly emerging influenza virus are critical to detecting the pandemic potential of AIVs. To this end, we introduced a multiplex RT-PCR using a DPO system to identify the influenza viral segments as a rapid and cost-effective approach. Moreover, since choosing appropriate primer regions and sequences is the most important factor affecting PCR, we tackled the process of designing EIV-specific primers with various analytical methods. To validate the procedures, H3N8 EIV-specific primers designed in this study were tested by in silico and subsequent in vitro experiments.

In this study, most of the EIV-specific candidate primers through primer4clades bound either directly to or near a conserved region with a few mismatches or several degenerate codes in each segment. Thus, more concrete steps were required to validate primer specificity. For this, BLAST and fuzznuc, functionally complementary tools to evaluate specificity in primer binding sites, were employed. These approaches worked well in most cases, and they were especially useful for filtering out problematic primers with degenerate codes by evaluating matches between primer sequences and target sequences and estimating the cross-reactivity possibility with other hosts. However, since BLAST treats degenerate codes (e.g., Y, R, A, K, M, etc.) as ‘mismatches’, sequences with many degenerate codes could be removed at an initial validation step. In that case, it was difficult to estimate the exact primer coverage and evaluation scores. For instance, primer sequences with degenerate codes, 1(PB1), 5(PA), 9(NP), and 12(NA) did not meet the requirement of satisfying values in the total score, query cover, and E-value in Table 1. To overcome the limitation, fuzznuc was used as an alternative and complementary method because it considers degenerate codes and mismatches using regular expression syntax. Through the two processes, we selected final 16 primer pairs, which specifically bind to equine influenza virus with less degeneracy.

Frequent point mutations of influenza virus increase the degeneracy of primers. To measure the variation at each nucleotide position, Analyze Sequence Variation (SNP) analysis was conducted using each primer. No primer pairs with highly variable sites (i.e., nearly 200 score) or completely conserved sites with 0 score were observed in the primer lists (Appendix Fig. 2; Fig. 2). Four sites with relatively high variation scores (≥40) existed in number four (NP forward primer). In particular, PA reverse primer (7) had the majority of variable sites with eight. However, applied DPO system for the primer inc

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.3 ทดสอบเชิงประจักษ์ในการมัลติเพล็กซ์ RT-PCRRT-PCR แต่ละสีแต่ละคู่และมัลติเพล็กซ์ RT-PCR กับสี่คู่ไพรเมอร์ทั้งอิสระทดสอบใช้ตัวอย่างไวรัสไข้หวัดใหญ่ 46 ใน singlexplex RT-PCR assays พบว่า ไพรเมอร์แบบหลายรหัส degenerate หลายมักจะยอมรับ นำไปสู่การขยายร่วมกับกลุ่มคนเชื้อสายอื่น ๆ (ไม่แสดงข้อมูล) ที่ไม่ตรงกัน เพื่อบรรเทาปัญหา สี่คู่ไพรเมอร์ที่ตั้งชื่อเป็น 3(PB2), 4 (PB2), 7(PA) และ 9(NP) ได้ปรับเปลี่ยนการใช้ระบบ DPO (ตาราง 1)หลังจากการตรวจสอบของแต่ละคู่ไพรเมอร์ มัลติเพล็กซ์ RT-PCR ทดสอบได้ปฏิบัติกับชุดที่เป็นไปได้สี่ภาคแปด ชุดเซ็กเมนต์ที่จะเป็นดังนี้: (1) PB2 + PA + PB1 + M (2) NP + PB2 + PB1 + PA (3) NP + PB2 + PA + PB1 (4) PB2 + PB1 + NA8 + M (5) NP + PB1 + NA8 + HA3 (6) NS + M + PB1, PA (7) PB2 + NA8 + NP + M (8) PA + NA8 + PB1 + HA3 ตัวอย่างไวรัสที่เจ็ดจากกลุ่มเชื้อสายที่แตกต่างถูกเลือกสำหรับการมัลติเพล็กซ์ RT-PCR ใช้ชุดแปด ในระหว่างการทดสอบ ตัวอย่างไวรัสที่เจ็ดถูกแทนที่ ด้วยไวรัสอื่นในชาติเดียวกัน ผล PCR จะแสดงในรูปที่ 3 (ผล PCR ใช้ตัวอย่างที่ 46 มีตามคำขอ) ใน fig. 3 ส่วน M (bp 15:211, bp 16:180) ของไวรัสไข้หวัดใหญ่ทั้งหมดได้สำเร็จขยายกับไพรเมอร์อื่น ๆ ในชุดที่ 1, 4, 6 และ 7 ยัง สี่ส่วน amplifications ในชุดที่ 2, 4, 5 และ 8 ส่งข้อสังเกตโดยไม่ cross-reactivity กับโฮสต์อื่นไข้หวัดใหญ่เลือกผล RT-PCR มัลติเพล็กซ์ตามไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 1 PCR ...รูป 3 เลือกผล RT-PCR มัลติเพล็กซ์ตามไพรเมอร์ที่แสดงในตารางที่ 1 ขนาดผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องหมายของ bp 100 (corp. Bioneer, Deajeon เกาหลีใต้) ตัวอย่างไวรัสไข้หวัดใหญ่จากโฮสต์ที่แตกต่างกันอยู่ในกล่อง (รายละเอียดเพิ่มเติม ดูภาคผนวกตารางที่ 1)เลือกรูปเนื่องจากการจำกัดจำนวนตัวอย่างไวรัสไข้หวัดใหญ่ รองพื้นความไวและความไม่สามารถอย่างเต็มที่ประเมิน อย่างไรก็ตาม ผ่านเทียบ silico ใน และ ในหลอดทดลองผล สามารถประเมินผลลัพธ์การมัลติเพล็กซ์ RT-PCR กับไพรเมอร์ผู้สมัคร และส่วนใหญ่ ผลสอดคล้องกัน4. สนทนาแม้ว่ากลไกของจีโนมของ reassortment ใน AIVs ยังคงไม่รู้จัก และวิเคราะห์พันธุมีทั้ง เวลามาก รหัสและการตรวจสอบไวรัสไข้หวัดใหญ่ที่เกิดขึ้นใหม่ใหม่มีการตรวจสอบศักยภาพระบาดของ AIVs เพื่อการนี้ เรานำการมัลติเพล็กซ์ RT PCR โดยใช้ระบบ DPO จะระบุส่วนไวรัสไข้หวัดใหญ่เป็นวิธีการรวดเร็ว และคุ้มค่า นอกจากนี้ เลือกรองพื้นที่เหมาะสมภูมิภาคและลำดับเป็น ปัจจัยสำคัญที่ส่งผล PCR เราเกี่ยวกับกระบวนการของการออกแบบไพรเมอร์ EIV เฉพาะด้วยวิธีการวิเคราะห์ต่าง ๆ การตรวจสอบขั้นตอน EIV เฉพาะ H3N8 ไพรเมอร์ที่ออกแบบในการศึกษานี้ถูกทดสอบโดย silico และภายหลังการทดลองในหลอดทดลองในการศึกษานี้ ส่วนใหญ่ของไพรเมอร์การสมัครเฉพาะของ EIV ผ่าน primer4clades ผูกไว้โดยตรงกับ หรือใกล้ กับเขตเมืองเก่ากี่ที่ไม่ตรงกันกับรหัส degenerate หลายในแต่ละเซ็กเมนต์ ดังนั้น ตอนคอนกรีตเพิ่มเติมจำเป็นต้องตรวจสอบความรองพื้น สำหรับนี้ ระเบิดและ fuzznuc เครื่องมือเสริมหน้าที่ประเมินความในเว็บไซต์รวมรองพื้น ถูกใช้ วิธีเหล่านี้ทำงานในกรณีส่วนใหญ่ และพวกเขาประโยชน์สำหรับกรองไพรเมอร์ที่มีปัญหากับรหัส degenerate ประเมินตรงกันระหว่างรองพื้นลำดับลำดับเป้าหมาย และประเมินความเป็นไปได้ cross-reactivity กับโฮสต์อื่น อย่างไรก็ตาม ตั้งแต่ระเบิดถือว่า degenerate รหัส (เช่น Y, R, A, K, M ฯลฯ) เป็น 'ไม่ตรงกัน' ลำดับรหัส degenerate หลายอาจถูกเอาออกในขั้นตอนการตรวจสอบเบื้องต้นได้ ในกรณีนี้ มันเป็นเรื่องยากในการประเมินความครอบคลุมและการประเมินผลคะแนนรองพื้นแน่นอน เช่น รองพื้นลำดับรหัส degenerate, 1(PB1), 5(PA), 9(NP) และ 12(NA) ไม่ตรงกับความต้องการของค่าคะแนนรวม ฝาปิดแบบสอบถาม และ E-ค่าในตารางที่ 1 ความพึงพอใจ เพื่อเอาชนะข้อจำกัด fuzznuc ถูกใช้เป็นวิธีการทางเลือก และเสริมเนื่องจากพิจารณารหัส degenerate และใช้ไวยากรณ์นิพจน์ทั่วไปที่ไม่ตรงกัน ถึงกระบวนการสอง เราเลือกคู่ไพรเมอร์ 16 สุดท้าย ซึ่งผูกโดยเฉพาะไวรัสไข้หวัดใหญ่ม้ากับภาวะลดรูปน้อยประจำจุดพันธุ์ของไวรัสไข้หวัดใหญ่เพิ่มภาวะลดรูปของไพรเมอร์ การวัดการเปลี่ยนแปลงในแต่ละตำแหน่งนิวคลีโอไทด์ วิเคราะห์วิเคราะห์ลำดับการเปลี่ยนแปลง (SNP) ถูกดำเนินการโดยใช้รองพื้นแต่ละ ไม่มีรองพื้นคู่กับไซต์ผันแปรสูง (เช่น เกือบ 200 คะแนน) หรือข้อสังเกตในรายการไพร (ภาคผนวก 2 รูป ไซต์นำทั้งหมด มี 0 คะแนน ทางรูปที่ 2) เว็บไซต์สี่ มีความผันแปรค่อนข้างสูงคะแนน (≥40) อยู่ในสี่ (NP ส่งรองพื้น) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง PA ย้อนหลังรองพื้น (7) มีส่วนใหญ่ของไซต์ผันแปรกับแปด อย่างไรก็ตาม ใช้ระบบ DPO รองพื้น inc

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.3 เชิงประจักษ์ multiplex RT-PCR ทดสอบทั้งสอง RT-PCR กับแต่ละคู่ไพรเมอร์ของแต่ละบุคคลและ multiplex RT-PCR กับสี่คู่ไพรเมอร์ได้รับการทดสอบอย่างอิสระโดยใช้ 46 ตัวอย่างเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ ในการตรวจ singlexplex RT-PCR พบว่าไพรเมอร์ทั่วไปมีหลายรหัสเลวหลายมีแนวโน้มที่จะทนไม่ตรงกันนำไปสู่การร่วมขยายกับกลุ่มเชื้อสายอื่น ๆ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เพื่อบรรเทาปัญหาสี่ไพรเมอร์คู่ชื่อเป็น 3 (PB2) 4 (PB2) 7 (PA) และ 9 (NP) มีการแก้ไขด้วยตนเองเพื่อนำไปใช้ระบบ อ.ส.ค. (ตารางที่ 1). หลังจากการตรวจสอบของแต่ละคู่ไพรเมอร์ , multiplex ทดสอบ RT-PCR ได้ดำเนินการกับสี่ชุดที่เป็นไปแปดส่วน ชุดส่วนมีดังนี้ (1) PB2 + PA + Pb1 + M; (2) NP + + PB2 Pb1 + PA; (3) NP + PB2 + PA + Pb1; (4) PB2 + + Pb1 NA8 + M; (5) NP + Pb1 + + NA8 HA3; (6) PA + + NS Pb1 + M; (7) PB2 + NA8 + NP + M; (8) PA + + NA8 Pb1 + HA3 เซเว่นไวรัสตัวอย่างจากกลุ่มที่แตกต่างกันเชื้อสายถูกเลือกสำหรับ multiplex RT-PCR โดยใช้ชุดแปด ในระหว่างการทดสอบที่เจ็ดตัวอย่างไวรัสที่ถูกแทนที่ด้วยไวรัสที่แตกต่างกันใน lineages เดียวกัน ผล PCR จะถูกนำเสนอในรูป 3 (ผล PCR โดยใช้ 46 ตัวอย่างที่มีอยู่ตามคำขอ) ในรูป 3 ส่วน M (15: 211 BP, 16: 180 bp) ของไวรัสไข้หวัดใหญ่ทั้งหมดถูกขยายประสบความสำเร็จกับไพรเมอร์อื่น ๆ ในชุดที่ 1, 4, 6, และ 7 นอกจากนี้สี่ส่วนเครื่องขยายเสียงในตลาดหลักทรัพย์ 2, 4, 5, และ 8 ถูกตั้งข้อสังเกตโดยไม่ต้องประเมินปฏิกิริยาข้ามกับครอบครัวไข้หวัดใหญ่อื่น ๆ . เลือก multiplex ผล RT-PCR ขึ้นอยู่กับไพรเมอร์ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 PCR ... รูป 3. เลือก multiplex ผล RT-PCR ขึ้นอยู่กับไพรเมอร์ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 PCR ขนาดสินค้าถูกกำหนดโดยใช้เครื่องหมาย 100 BP (Bioneer คอร์ป Deajeon, เกาหลีใต้) ไวรัสไข้หวัดใหญ่ตัวอย่างจากครอบครัวที่แตกต่างกันมีการระบุไว้ในกล่อง (รายละเอียดเพิ่มเติมดูที่ภาคผนวกตารางที่ 1). ตัวเลือกรูปเนื่องจากจำนวน จำกัด ของตัวอย่างเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่มีความไวและความจำเพาะไพรเมอร์ไม่สามารถประเมินได้อย่างเต็มที่ แต่ผ่านการเปรียบเทียบใน silico และในผลการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ, multiplex RT-PCR ผลด้วยไพรเมอร์ผู้สมัครจะได้รับการประเมินและในกรณีส่วนใหญ่ผลของพวกเขามีความสอดคล้อง. 4 อภิปรายถึงแม้ว่ากลไกของจีโนมใน Reassortment AIVs ยังคงไม่รู้จักและการวิเคราะห์ของจีโนมทั้งหมดเป็นกระบวนการใช้เวลานาน, บัตรประจำตัวและการตรวจสอบของเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ใหม่ที่เกิดขึ้นใหม่มีความสำคัญกับการตรวจสอบที่มีศักยภาพในการแพร่ระบาดของ AIVs ด้วยเหตุนี้เราแนะนำ multiplex RT-PCR โดยใช้ระบบ อ.ส.ค. เพื่อแจ้งไข้หวัดใหญ่ส่วนเชื้อไวรัสเป็นวิธีการอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ตั้งแต่การเลือกภูมิภาคไพรเมอร์ที่เหมาะสมและลำดับเป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดที่มีผลต่อวิธี PCR เราจัดการขั้นตอนการออกแบบไพรเมอร์ EIV เฉพาะด้วยวิธีการวิเคราะห์ต่างๆ ในการตรวจสอบขั้นตอนไพรเมอร์ H3N8 EIV เฉพาะการออกแบบในการศึกษาครั้งนี้ได้รับการทดสอบโดยใน silico และต่อมาในหลอดทดลอง. ในการศึกษานี้ส่วนใหญ่ของไพรเมอร์ผู้สมัคร EIV เฉพาะผ่าน primer4clades ผูกพันทั้งทางตรงหรือใกล้เขตป่าสงวนด้วย ที่ไม่ตรงกันไม่กี่หรือรหัสเลวหลายแห่งในแต่ละกลุ่ม ดังนั้นขั้นตอนที่เป็นรูปธรรมมากขึ้นก็จะต้องตรวจสอบความจำเพาะไพรเมอร์ สำหรับเรื่องนี้ระเบิดและ fuzznuc, หน้าที่เสริมเครื่องมือในการประเมินความจำเพาะในเว็บไซต์ที่มีผลผูกพันไพรเมอร์ที่ถูกว่าจ้าง วิธีการเหล่านี้ทำงานได้ดีในกรณีส่วนใหญ่และพวกเขาก็มีประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการกรองจากไพรเมอร์ที่มีปัญหาด้วยรหัสที่เลวโดยการประเมินการแข่งขันระหว่างลำดับไพรเมอร์และลำดับเป้าหมายและการประเมินความเป็นไปได้ปฏิกิริยาข้ามกับครอบครัวอื่น ๆ อย่างไรก็ตามตั้งแต่ BLAST ถือว่าเลวรหัส (เช่น, Y, R, A, K, M, ฯลฯ ) เป็น 'ไม่ตรงกัน' ลำดับด้วยรหัสที่เลวจำนวนมากจะถูกลบออกในขั้นตอนการตรวจสอบเบื้องต้น ในกรณีที่ว่ามันเป็นเรื่องยากที่จะประเมินความคุ้มครองที่แน่นอนไพรเมอร์และการประเมินผลคะแนน ยกตัวอย่างเช่นลำดับไพรเมอร์ที่มีรหัสเลว 1 (Pb1), 5 (PA), 9 (NP) และ 12 (NA) ไม่ได้ตอบสนองความต้องการของค่าความพึงพอใจในคะแนนรวมปกแบบสอบถามและ e-ค่าใน ตารางที่ 1 การเอาชนะข้อ จำกัด ที่ fuzznuc ถูกนำมาใช้เป็นทางเลือกและวิธีการที่สมบูรณ์เพราะจะมีการพิจารณารหัสเลวและไม่ตรงกันโดยใช้ไวยากรณ์แสดงออกปกติ ผ่านกระบวนการที่สองเราเลือกสุดท้ายคู่ไพรเมอร์ 16 ซึ่งเฉพาะผูกกับเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ม้าที่มีความเสื่อมน้อย. กลายพันธุ์จุดบ่อยของเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่เพิ่มความเสื่อมของไพรเมอร์ ในการวัดการเปลี่ยนแปลงในแต่ละตำแหน่งเบสวิเคราะห์ลำดับการเปลี่ยนแปลง (SNP) การวิเคราะห์ได้ดำเนินการใช้แต่ละไพรเมอร์ ไม่มีคู่ไพรเมอร์กับเว็บไซต์ตัวแปร (เช่นเกือบ 200 คะแนน) หรือสมบูรณ์เว็บไซต์อนุรักษ์กับ 0 คะแนนถูกตั้งข้อสังเกตในรายการไพรเมอร์ (ภาคผนวกรูปที่ 2. รูปที่ 2). สี่เว็บไซต์ที่มีคะแนนการเปลี่ยนแปลงที่ค่อนข้างสูง (≥40) อยู่ในบ้านเลขที่สี่ (NP ไปข้างหน้าไพรเมอร์) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง PA ไพรเมอร์กลับ (7) มีส่วนใหญ่ของเว็บไซต์ตัวแปรแปด แต่ใช้ระบบ อ.ส.ค. สำหรับ Inc ไพรเมอร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.3 . การทดสอบเชิงประจักษ์ multiplex RT-PCRทั้งเทคนิคกับแต่ละคู่และ multiplex RT-PCR รองพื้นด้วยสีรองพื้นมี 4 คู่ทดสอบอิสระใช้ 46 ไข้หวัดใหญ่ไวรัสตัวอย่าง ใน singlexplex RT-PCR ) พบว่าไพรเมอร์หลายแบบด้วยรหัสเสื่อมหลายมีแนวโน้มที่จะทนต่อความไม่นำไปสู่ CO ( กลุ่มเชื้อสายอื่น ๆ ( ข้อมูลไม่แสดง ) เพื่อบรรเทาปัญหา 4 คู่ไพรเมอร์มีชื่อเป็น 3 ( แบบเคลื่อนที่ ) , 4 ( แบบเคลื่อนที่ ) , 7 ( PA ) และ 9 ( NP ) ด้วยตนเอง ปรับเปลี่ยนให้ใช้ระบบ DPO ( ตารางที่ 1 )หลังจากการตรวจสอบของแต่ละคู่ไพรเมอร์แบบ multiplex RT-PCR จำนวน 4 ชุดที่เป็นไปได้ของแปดกลุ่ม ส่วนผสมดังนี้ ( 1 ) แบบเคลื่อนที่ + PA + PB1 + M ; ( 2 ) ปัญหา + + + PA PB1 แบบเคลื่อนที่ ( 3 ) ปัญหา + แบบเคลื่อนที่ + PA + PB1 ; ( 4 ) แบบเคลื่อนที่ + PB1 + na8 + M ; ( 5 ) ปัญหา + + + ha3 PB1 na8 ; ( 6 2 ) PA + + PB1 + M ; ( 7 ) แบบเคลื่อนที่ + na8 + ปัญหา + M ; ( 8 ) PA + + + na8 PB1 ha3 . 7 ตัวอย่างไวรัสกลุ่มวงศ์ตระกูลแตกต่างจากกลุ่มตัวอย่างที่ใช้วิธีมัลติเพล็กซ์ 8 ชุด ในระหว่างการทดสอบเจ็ดไวรัสตัวอย่างถูกแทนที่ด้วยไวรัสที่แตกต่างกันในเผ่าพันธุ์เดียวกัน การตรวจผลแสดงในรูปที่ 3 ( PCR ผลใช้ 46 ตัวอย่างตามร้องขอ ) ในรูปที่ 3 , M ) ( 15 : 211 / 16 : 180 BP ) ของไวรัสไข้หวัดใหญ่ทั้งหมดได้เรียบร้อยแล้วขยายกับไพรเมอร์ในชุดที่ 1 , 4 , 6 และ 7 นอกจากนี้ ในส่วน amplifications 4 ชุด 2 , 4 , 5 และ 8 ได้โดยไม่ได้สังเกตปฏิกิริยาข้ามกับโฮสต์ไข้หวัดใหญ่อื่น ๆเลือกการจับกลุ่ม RT-PCR ผลตามชนิดที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 เทคนิค . . . . . . .รูปที่ 3เลือกการจับกลุ่ม RT-PCR ผลตามชนิดที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 ขนาดผลิตภัณฑ์ PCR ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องหมาย 100 BP ( bioneer คอร์ป deajeon , เกาหลีใต้ ) ไข้หวัดใหญ่ไวรัสตัวอย่างจากโฮสต์ที่แตกต่างกัน มีการระบุไว้ในกล่อง ( ข้อมูล รายละเอียดเพิ่มเติมดูภาคผนวก ตาราง 1 )เลือกรูปเนื่องจากการจำกัดจำนวนตัวอย่างไวรัสไข้หวัดใหญ่ ความไวและความจำเพาะไม่รองพื้นเต็มประเมิน อย่างไรก็ตาม จากการเปรียบเทียบสำหรับและในการ multiplex RT-PCR ผลผลด้วยไพรเมอร์ ผู้สมัครสามารถประมาณได้ และในกรณีส่วนใหญ่ผลของพวกเขาที่สอดคล้องกัน4 . การอภิปรายแม้ว่ากลไกของจีโนม reassortment ใน aivs ยังคงไม่ทราบและการวิเคราะห์จีโนมทั้งหมดเป็นกระบวนการที่ใช้เวลานาน การระบุและตรวจสอบใหม่เพื่อตรวจหาไวรัสไข้หวัดใหญ่มีศักยภาพระบาดของ aivs . ด้วยเหตุนี้เราแนะนำ multiplex RT-PCR โดยใช้ระบบ DPO ระบุไข้หวัดใหญ่ไวรัสกลุ่มเป็นวิธีการอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ตั้งแต่การเลือกสีรองพื้นที่เหมาะสมกับภูมิภาคลำดับเป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดและเราจัดการกระบวนการของการออกแบบ eiv ไพร์เมอร์จำเพาะด้วยวิธีต่าง ๆ การตรวจสอบกระบวนการ ดังกล่าว eiv ไพรเมอร์ที่ออกแบบเฉพาะในการวิจัยและทดสอบ โดยสำหรับการทดลองในหลอดทดลองที่ตามมาในการศึกษานี้ส่วนใหญ่ของ eiv เฉพาะผู้สมัครผ่าน primer4clades ผูกพันทั้งไพรเมอร์โดยตรงหรือใกล้ เขตอนุรักษ์ มีไม่กี่ หรือ รหัสความไม่ทรามหลายในแต่ละส่วน ดังนั้น ขั้นตอนคอนกรีตมากขึ้น ถูก ต้อง ตรวจสอบ ไพรเมอร์ specificity นี้ , ระเบิดและ fuzznuc โดยเครื่องมือประเมิน , เสริมความจำเพาะในการใช้เว็บไซต์ , งาน วิธีเหล่านี้ทำงานได้ดีในกรณีส่วนใหญ่ และเป็นประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการกรองไพรเมอร์ที่มีปัญหากับรหัสทราม โดยการประเมินและการจับคู่กันระหว่างลำดับยีนเป้าหมายการรองพื้นและขอประทานความเป็นไปได้กับโฮสต์อื่น ๆ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากระเบิดถือว่ารหัสเสื่อม ( เช่น Y , R , A , K , M , ฯลฯ ) เป็น ' ' ความไม่ ลำดับ ด้วยรหัสเสื่อมมากจะถูกลบออกในขั้นตอนการตรวจสอบเบื้องต้น ในกรณีนี้ มันเป็นเรื่องยากที่จะประเมินแน่นอน ไพรเมอร์ครอบคลุมและคะแนนการประเมิน ตัวอย่าง เช่น ลำดับด้วยรหัสเสื่อม 1 ( PB1 ) , 5 ( PA ) , 9 ( NP ) , และ 12 ( na ) ไม่ได้ตอบสนองความต้องการความพึงพอใจของค่าคะแนนรวมแบบสอบถามที่ครอบคลุม และประโยชน์ในตารางที่ 1 ที่จะเอาชนะข้อ จำกัด fuzznuc ถูกใช้เป็นวิธีทางเลือกและประกอบเพราะเห็นความไม่เสื่อม ใช้รหัสและไวยากรณ์นิพจน์ปกติ . ผ่านกระบวนการสอง เราเลือกสีรองพื้นครั้งสุดท้าย 16 คู่ ซึ่งโดยเฉพาะผูกกับไวรัสไข้หวัดใหญ่ม้ากับความเสื่อมน้อยกว่าการกลายพันธุ์ของเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ จุดบ่อยเพิ่มความเสื่อมของรองพื้น วัดการเปลี่ยนแปลงในแต่ละตำแหน่งวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ , ความผันแปร ( SNP ) การวิเคราะห์จำนวนแต่ละรองพื้น ไม่มีรองพื้นคู่กับเว็บไซต์ตัวแปรสูง ( เช่น เกือบ 200 คะแนน ) หรือสมบูรณ์สามารถเว็บไซต์กับ 0 คะแนนจากรายการในไพรเมอร์ ( ภาคผนวกรูปที่ 2 รูปที่ 2 ) สี่เว็บไซต์ที่มีคะแนนการเปลี่ยนแปลงค่อนข้างสูง ( ≥ 40 ) มีหมายเลขสี่ ( NP ส่งต่อรองพื้น ) โดยเฉพาะป้ากลับ ไพรเมอร์ ( 7 ) ส่วนใหญ่ของเว็บไซต์ตัวแปรกับแปด แต่ใช้ระบบสำหรับพริม อ.ส.ค.