Conductivity as used herein refers

Conductivity as used herein refers to 10 the ability of a solution, such as a buffer solution, to influence electrostatic
interactions, for example binding to or release of, of the contaminants with the matrix. The conductivity may be adjusted by varying ionic concentration of the buffer composition. Generally low conductivity buffers are preferable. By low conductivity
it is understood that the conductivity is ต่ำกว่า 10 mS/cm, preferably ต่ำกว่า 5 mS/cm, 15 and most preferably ต่ำกว่า 3 mS/cm. ในหนึ่งใน รูปลักษณะ, the conductivity of
the buffer is ระหว่างประมาณ 8 mS/cm ถึงประมาณ 0.5 mS/cm, ระหว่างประมาณ 5 mS/cm to
about 1 mS/cm, ระหว่างประมาณ 4 mS/cm ถึงประมาณ 1.5 mS/cm, ระหว่างประมาณ 3 mS/cm
ถึงประมาณ 2 mS/cm.


20 ในหนึ่งใน รูปลักษณะ, an exemplary buffer contains 10 mM phosphate, pH 5.8 to
6.2 with a conductivity of approximately 2 mS/cm.

The คอนจูเกต is loaded at the rate of 2-120 cm/hr. Preferably at the rate of 10-120
cm/h, 20-110 cm/h, 30-100 cm/h, 40-90 cm/h, 50-80 cm/h, or 60-70 cm/h. The flow 25 rate can be adjusted so as to allow sufficient time for the contaminants to interact with
the matrix. Sample may be loaded at 300 cm/hr or higher with one or more repeated
steps of loading. If required, the crude คอนจูเกต may be membrane filtered before
loading onto the โครมาโทกราฟี column. The desired คอนจูเกต passes through the
void spaces of the mixed mode resin and is collected in the ส่วนไหลผ่าน while the 30 impurities are trapped inside the ligand activated core by hydrophobic and/or ionic
interactions. A wash is given to the column using the phosphate buffer, pH 5.8 to 6.2
to collect the remaining คอนจูเกต non-specifically adhering to the matrix. The
purified คอนจูเกต is diluted with a high conductivity dilution buffer, pH 5.8 to 6.2, and filtered through a 0.45p, and 0.22p, filters.


Table-1 โพลีแซคคาไรด์ อิสระ (PRP), Free carrier protein (TT) and EDC content after

5 purification of โพลีแซคคาไรด์ โปรตีน คอนจูเกต
โครมาโทกราฟี.



Free PRP 6.0 mg/mL

(Hib คอนจูเกต) by mixed mode
Column (a) represents the contaminants.
Column (b) represents the amount of contaminants before purification of
โพลีแซคคาไรด์ โปรตีน คอนจูเกต by mixed mode โครมาโทกราฟี.
15 Column (c) represents the residual amount of contaminants after purification of
โพลีแซคคาไรด์ โปรตีน คอนจูเกต by mixed mode โครมาโทกราฟี.
Column (d) represents the percentage of residual amount of contaminants. Column (e) represents the percentage reduction of contaminants.


20 Free PRP was determined by the method described by Tsai, C.M. et al. (1994)
Vaccine 12(8): 700-706.

Free protein in a โพลีแซคคาไรด์ คอนจูเกต vaccine may be determined by the methods
known to the persons skilled in the art. The amount of free Tetanus toxoid (free TT) in 25 Hib คอนจูเกต (PRP คอนจูเกตd to tetanus toxoid) was determined by strong anion
exchange โครมาโทกราฟี using a fluorescence detector. The molecules with weak
ionic interactions are eluted first (free TT) followed by molecules with strong ionic
interactions (Hib คอนจูเกต). The free TT was eluted by lowering the pH of the mobile phase ต่ำกว่า the pI of the tetanus toxoid. The amount of free TT was quantified by comparing the peak area of the sample with the peak area of the standard curve plotted against the concentration (.tg/mL) generated using tetanus toxoid.
5
Capillary Zone Electrophoresis (CZE) was used to quantify 1-ethy1-3-(3-
dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) by directly detecting in capillaries by UV
absorbance at 200 nm. EDC content in the sample was quantified by comparing peak
areas of the sample with the peak areas of the standard curve generated using different
10 concentrations of EDC.


Table 2 - Molecular size distribution of Hib คอนจูเกต purified by mixed mode
โครมาโทกราฟี
Molecular
Fractionation Size

Sample


A
B
C

content
Range in KD
(A+13+C) in p.g

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Conductivity as used herein refers to 10 the ability of a solution, such as a buffer solution, to influence electrostaticinteractions, for example binding to or release of, of the contaminants with the matrix. The conductivity may be adjusted by varying ionic concentration of the buffer composition. Generally low conductivity buffers are preferable. By low conductivityit is understood that the conductivity is ต่ำกว่า 10 mS/cm, preferably ต่ำกว่า 5 mS/cm, 15 and most preferably ต่ำกว่า 3 mS/cm. ในหนึ่งใน รูปลักษณะ, the conductivity of the buffer is ระหว่างประมาณ 8 mS/cm ถึงประมาณ 0.5 mS/cm, ระหว่างประมาณ 5 mS/cm to about 1 mS/cm, ระหว่างประมาณ 4 mS/cm ถึงประมาณ 1.5 mS/cm, ระหว่างประมาณ 3 mS/cm ถึงประมาณ 2 mS/cm.20 ในหนึ่งใน รูปลักษณะ, an exemplary buffer contains 10 mM phosphate, pH 5.8 to6.2 with a conductivity of approximately 2 mS/cm.The คอนจูเกต is loaded at the rate of 2-120 cm/hr. Preferably at the rate of 10-120 cm/h, 20-110 cm/h, 30-100 cm/h, 40-90 cm/h, 50-80 cm/h, or 60-70 cm/h. The flow 25 rate can be adjusted so as to allow sufficient time for the contaminants to interact with the matrix. Sample may be loaded at 300 cm/hr or higher with one or more repeated steps of loading. If required, the crude คอนจูเกต may be membrane filtered before loading onto the โครมาโทกราฟี column. The desired คอนจูเกต passes through the void spaces of the mixed mode resin and is collected in the ส่วนไหลผ่าน while the 30 impurities are trapped inside the ligand activated core by hydrophobic and/or ionic interactions. A wash is given to the column using the phosphate buffer, pH 5.8 to 6.2 to collect the remaining คอนจูเกต non-specifically adhering to the matrix. Thepurified คอนจูเกต is diluted with a high conductivity dilution buffer, pH 5.8 to 6.2, and filtered through a 0.45p, and 0.22p, filters.Table-1 โพลีแซคคาไรด์ อิสระ (PRP), Free carrier protein (TT) and EDC content after 5 purification of โพลีแซคคาไรด์ โปรตีน คอนจูเกตโครมาโทกราฟี.Free PRP 6.0 mg/mL (Hib คอนจูเกต) by mixed modeColumn (a) represents the contaminants.Column (b) represents the amount of contaminants before purification of โพลีแซคคาไรด์ โปรตีน คอนจูเกต by mixed mode โครมาโทกราฟี. 15 Column (c) represents the residual amount of contaminants after purification ofโพลีแซคคาไรด์ โปรตีน คอนจูเกต by mixed mode โครมาโทกราฟี.Column (d) represents the percentage of residual amount of contaminants. Column (e) represents the percentage reduction of contaminants.20 Free PRP was determined by the method described by Tsai, C.M. et al. (1994)Vaccine 12(8): 700-706.Free protein in a โพลีแซคคาไรด์ คอนจูเกต vaccine may be determined by the methods known to the persons skilled in the art. The amount of free Tetanus toxoid (free TT) in 25 Hib คอนจูเกต (PRP คอนจูเกตd to tetanus toxoid) was determined by strong anion exchange โครมาโทกราฟี using a fluorescence detector. The molecules with weak ionic interactions are eluted first (free TT) followed by molecules with strong ionicinteractions (Hib คอนจูเกต). The free TT was eluted by lowering the pH of the mobile phase ต่ำกว่า the pI of the tetanus toxoid. The amount of free TT was quantified by comparing the peak area of the sample with the peak area of the standard curve plotted against the concentration (.tg/mL) generated using tetanus toxoid.5Capillary Zone Electrophoresis (CZE) was used to quantify 1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) by directly detecting in capillaries by UVabsorbance at 200 nm. EDC content in the sample was quantified by comparing peakareas of the sample with the peak areas of the standard curve generated using different10 concentrations of EDC.Table 2 - Molecular size distribution of Hib คอนจูเกต purified by mixed modeโครมาโทกราฟีMolecularFractionation Size SampleABC contentRange in KD (A+13+C) in p.g<0.20.2-0.5 943.10.5-1.0 distribution (%)749.06 79.4104.83 11.189.21 9.5 15 Molecular size distribution of purified Hib คอนจูเกต was analyzed by SepharoseCL4B โครมาโทกราฟี (WHO Technical Report Series, No. 897, 2000 pg 27-56)Three fractions of Size distribution ranges i.e., <0.2, 0.2-0.5 and 0.5-1.0 KD as shown in figure 2 were collected and PRP content was analyzed. The results indicate that79.4 % of คอนจูเกต is in the molecular size range of <0.2 KD indicating that mixed 20 mode โครมาโทกราฟี efficiently removes low molecular weight คอนจูเกต.The การประดิษฐ์นี้ is further exemplified by the following non limiting examples. It should be understood that the examples are provided to illustrate the การประดิษฐ์. From the description and the exemplified embodiments and examples, on skilled inthe art can make various modifications or adaptations to the การประดิษฐ์. Such 25 modifications or adaptations are deemed to be within the scope and the spirit of the การประดิษฐ์.ExamplesExample 1 — Purification of Hib คอนจูเกต using gel filtration โครมาโทกราฟี (3.0 L Scale)The โครมาโทกราฟี column (BPG, GE Healthcare) packed with Sepharose CL-2B5 (GE Healthcare) is equilibrated with equilibration buffer (10 mM Phosphate buffercontaining 0.2 M NaC1). 3000 mL of crude Hib คอนจูเกต (Hib โพลีแซคคาไรด์คอนจูเกตd to tetanus toxoid) is loaded onto the pre equilibrated column. The crudeคอนจูเกต gets fractionated (Fraction-1 to Fraction-4) based upon distributioncoefficient (Kd), from which the desired คอนจูเกต (Fraction-2) is collected in a10 lfowthrough. Rest of the fractions (Fraction-1, Fraction-2 and Fraction-3) containscontaminants (Fig la).Example 2a - Purification of Hib คอนจูเกต using mixed mode โครมาโทกราฟี (0.08 L Scale)15 80 mL of crude Hib คอนจูเกต i.e., Hib โพลีแซคคาไรด์ คอนจูเกตd to tetanus toxoid(concentration 10 mg/mL, pH 5.8 and conductivity 20 mS/cm) is diluted 10 times with equilibration buffer (10 mM Sodium phosphate, pH 5.8 and conductivity 2 mS/cm) and concentrated to approximately five times its volume using 1000 kDacassette (Millipore Biomax). The คอนจูเกต is continuously diafiltered (using 30 kDa 20 membrane) with equilibration buffer for about 20 times and concentrated to its initial volume.
The mixed mode matrix (Capto 11V1 Core 700 matrix, GE Healthcare) packed in BPG
column (GE Healthcare) is equilibrated with equilibration buffer and the คอนจูเกต is 25 loaded at the rate of 10 cm/h. The unbound คอนจูเกต is collected. A wash is given to
the column using the equilibration buffer to collect the remaining คอนจูเกต non-
specifically adhering to the matrix. The คอนจูเกต collected is diluted using phosphate
buffer pH 5.8-6.2 and filtered through 0.45 p. and 0.2 u filter.
Example 2b — Purification of Hib คอนจูเกต using mixed mode โครมาโทกราฟี (3.0 L Scale)


5 3000 mL of crude Hib คอนจูเกต i.e., Hib โพลีแซคคาไรด์ คอนจูเกตd to tetanus toxoid
(concentration 10 mg/mL, pH 5.8 and conductivity 20 mS/cm) is diluted 10 times with equilibration buffer (10 mM Sodium phosphate, pH 5.8 and conductivity 2 mS/cm) and concentrated to approximately 3 times its volume using 1000 kDa
cassette (Millipore Biomax). The คอนจูเกต is continuously diafiltered (using 30 kDa 10 membrane) with equilibration buffer for about 25 times and concentrated to its initial
volume.

The mixed mode matrix (CaptoTm Core 700 matrix, GE Healthcare) packed in
Axichrom column (GE Healthcare) is equilibrated with equilibration buffer and the 15 คอนจูเกต is loaded at the rate of 60 cm/h. The unbound คอนจูเกต is collected. A
wash is given to the column using the equilibration buffer to collect the remaining คอนจูเกต non-specifically adhering to the matrix. The คอนจูเกต is diluted using phosphate buffer pH 5.8-6.2 and filtered through 0.45 11 and 0.2 11 filter.


20 Table 3 — Advantages of using mixed mode โครมาโทกราฟี over gel filtration
โครมาโทกราฟี for คอนจูเกต purification
Gel filtration Mixed mode

S.No. Parameters
1 Batch size
2 Matrix volume used
3 Column height
4 Column diameter
5 buffer requirement



6 Pooling criteria

โครมาโทกราฟี
3.0 L
60.0 L
90 cm
300 mm
1000 L
Specified region of
inner fraction
(contaminants and
คอนจูเกต separate over
a very narrow range
increasing the risk of
contamination, see Fig
1 a.)

โครมาโทกราฟี
3.0 L
3.0 L
18 cm
140 mm
200 L
Unbound fraction
(contaminants and
คอนจูเกต separate over
a broad range reducing
the risk of
contamination, see Fig
lb.)





22
PCT-1424




7

8

9


10


Column packing, unpacking and
chromatographic run operations
Overall process time
Nature of
โครมาโทกราฟี

Principle involved


Cumbersome,
inconvenient and
highly time consuming
operations
6 days
Fractionation by size
exclusion

Size Exclusion



Very simple,
convenient and easy

< 1 day
Negative
โครมาโทกราฟี/non-
binding mode
Size exclusion, ion
exchange &
Hydrophobic

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การนำไฟฟ้าที่ใช้ในที่นี้หมายถึงความสามารถใน 10
ของการแก้ปัญหาเช่นสารละลายบัฟเฟอร์ที่จะมีอิทธิพลต่อไฟฟ้าสถิตปฏิสัมพันธ์เช่นการเชื่อมโยงไปหรือปล่อยของสารปนเปื้อนที่มีเมทริกซ์ การนำอาจจะปรับได้โดยการไอออนิกที่แตกต่างกันมีความเข้มข้นขององค์ประกอบบัฟเฟอร์ โดยทั่วไปบัฟเฟอร์การนำต่ำเป็นที่นิยม โดยการนำต่ำมันเป็นที่เข้าใจว่าเป็นการนำต่ำกว่า 10 mS / cm ควรต่ำกว่า 5 ms / cm 15 และส่วนใหญ่โดยเฉพาะอย่างยิ่งต่ำกว่า 3 mS / cm
ในหนึ่งในรูปลักษณะการนำของบัฟเฟอร์ระหว่างประมาณ 8 mS / cm ถึงประมาณ 0.5 mS / cm ระหว่างประมาณ 5 ms / cm จะประมาณ1 mS / cm ระหว่างประมาณ 4 mS / cm ถึงประมาณ 1.5 mS / cm , ระหว่างประมาณ 3 mS / cm ถึงประมาณ 2 mS / cm. 20 ในหนึ่งในรูปลักษณะเป็นกันชนที่เป็นแบบอย่างมีฟอสเฟตมิลลิ 10 ค่า pH 5.8 ที่จะ6.2 มีการนำประมาณ 2 mS / cm. คอนจูเกตจะโหลด ในอัตรา 2-120 ซม. / ชม โดยเฉพาะอย่างยิ่งในอัตรา 10-120 เซนติเมตร / ชั่วโมง 20-110 ซม. / ชม 30-100 เซนติเมตร / ชั่วโมง 40-90 ซม. / ชม 50-80 ซม. / ชั่วโมงหรือ 60-70 ซม. / ชั่วโมง การไหล 25 อัตราที่สามารถปรับเปลี่ยนเพื่อให้มีเวลาเพียงพอสำหรับการปนเปื้อนในการโต้ตอบกับเมทริกซ์ ตัวอย่างอาจจะโหลดที่ 300 ซม. / ชมหรือสูงกว่าหนึ่งคนหรือมากกว่าซ้ำขั้นตอนของการโหลด หากต้องการน้ำมันดิบคอนจูเกตอาจจะเป็นเมมเบรนกรองก่อนที่จะโหลดลงบนโครมาโทกราฟีคอลัมน์ ที่ต้องการคอนจูเกตผ่านช่องว่างเป็นโมฆะของเรซินโหมดผสมและมีการรวบรวมไว้ในส่วนไหลผ่านในขณะที่ 30 สิ่งสกปรกที่ถูกขังอยู่ภายในแกนด์แกนเปิดใช้งานโดยไม่ชอบน้ำและ / หรือไอออนิกปฏิสัมพันธ์ ล้างจะได้รับการคอลัมน์โดยใช้ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่พีเอช 5.8-6.2 ในการเก็บรวบรวมที่เหลือคอนจูเกตที่ไม่ใช่เฉพาะการยึดมั่นในเมทริกซ์ บริสุทธิ์คอนจูเกตเป็นเจือจางด้วยการนำสูงบัฟเฟอร์เจือจางพีเอช 5.8-6.2 และกรองผ่าน 0.45p และ 0.22p กรอง. ตารางที่ 1 โพลีแซคคาไรด์อิสระ (PRP) ให้บริการฟรี โปรตีน (TT) และเนื้อหา EDC หลังจาก5 การทำให้บริสุทธิ์ของโพลีแซคคาไรด์โปรตีนคอนจูเกตโครมาโทกราฟี. ฟรี PRP 6.0 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร(Hib คอนจูเกต) โดยโหมดผสมคอลัมน์(ก ) แสดงให้เห็นถึงการปนเปื้อน. คอลัมน์ (ข) แสดงให้เห็นถึงปริมาณของสารปนเปื้อนก่อนการทำให้บริสุทธิ์ของโพลีแซคคาไรด์โปรตีนคอนจูเกตโดยโหมดผสมโครมาโทกราฟี. 15 คอลัมน์ (ค) แสดงให้เห็นถึงจำนวนเงินที่เหลือของ สารปนเปื้อนหลังจากการทำให้บริสุทธิ์ของโพลีแซคคาไรด์โปรตีนคอนจูเกตโดยโหมดผสมโครมาโทกราฟี. คอลัมน์ (ง) แสดงถึงเปอร์เซ็นต์ของจำนวนเงินที่เหลือจากสารปนเปื้อน คอลัมน์ (จ) แสดงให้เห็นถึงการลดลงร้อยละของสารปนเปื้อน. 20 ฟรี PRP ถูกกำหนดโดยวิธีการที่อธิบายโดยไจ่ CM et al, (1994) วัคซีน 12 (8):. 700-706 โปรตีนฟรีในโพลีแซคคาไรด์คอนจูเกตวัคซีนอาจจะถูกกำหนดโดยวิธีการที่เป็นที่รู้จักกันกับบุคคลที่มีความสามารถในศิลปะ ปริมาณของ toxoid บาดทะยักฟรี (ฟรี TT) ใน 25 Hib คอนจูเกต (PRP คอนจูเกต d เพื่อ toxoid บาดทะยัก) ถูกกำหนดโดยไอออนที่แข็งแกร่งแลกเปลี่ยนโครมาโทกราฟีโดยใช้เครื่องตรวจจับเรืองแสง โมเลกุลที่มีความอ่อนแอปฏิสัมพันธ์ไอออนิกจะชะแรก (ฟรี TT) ตามด้วยโมเลกุลที่มีไอออนิกที่แข็งแกร่งปฏิสัมพันธ์(Hib คอนจูเกต) ฟรี TT ถูกชะโดยการลดค่า pH ของเฟสเคลื่อนที่ที่ต่ำกว่าพี่ของ toxoid บาดทะยัก ปริมาณของฟรี TT ถูกวัดโดยการเปรียบเทียบพื้นที่สูงสุดของกลุ่มตัวอย่างที่มีพื้นที่จุดสูงสุดของเส้นโค้งมาตรฐานวางแผนกับความเข้มข้น (.tg / มิลลิลิตร) สร้างโดยใช้ toxoid บาดทะยัก. 5 ฝอยโซน Electrophoresis (cze) ได้ถูกใช้ในปริมาณ 1 -ethy1-3- (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) โดยการตรวจสอบโดยตรงในเส้นเลือดฝอยโดยรังสียูวีการดูดกลืนแสงที่200 นาโนเมตร เนื้อหา EDC ในกลุ่มตัวอย่างที่ถูกวัดโดยการเปรียบเทียบจุดสูงสุดพื้นที่ของกลุ่มตัวอย่างที่มีพื้นที่จุดสูงสุดของกราฟมาตรฐานสร้างขึ้นโดยใช้ที่แตกต่างกัน10 ระดับความเข้มข้นของ EDC. ตารางที่ 2 - การกระจายขนาดโมเลกุลของฮีโมฟิลุคอนจูเกตบริสุทธิ์โดยโหมดผสมโครมาโทกราฟีโมเลกุลขนาดFractionation ตัวอย่างB C เนื้อหาช่วงใน KD (A + 13 + C) ในหน้า<0.2 0.2-0.5 943.1 0.5-1.0 กระจาย(%) 749.06 79.4 104.83 11.1 89.21 9.5 15 การกระจายขนาดโมเลกุลของฮีโมฟิลุคอนบริสุทธิ์ จูเกตได้รับการวิเคราะห์โดย Sepharose CL4B โครมาโทกราฟี (WHO รายงานเชิงเทคนิคซีรีส์เลขที่ 897, 2000 หน้า 27-56) สามเศษของช่วงการกระจายขนาดคือ <0.2, 0.2-0.5 และ 0.5-1.0 KD ดังแสดงในรูปที่ 2 ถูกเก็บรวบรวมและเนื้อหา PRP วิเคราะห์ ผลการศึกษาพบว่า79.4% ของคอนจูเกตอยู่ในช่วงขนาดของโมเลกุล <0.2 KD แสดงให้เห็นว่าผสม 20 โหมดโครมาโทกราฟีอย่างมีประสิทธิภาพขจัดน้ำหนักโมเลกุลต่ำคอนจูเกต. การประดิษฐ์นี้เป็นตัวอย่างต่อไป โดยตัวอย่างที่ไม่ จำกัด ดังต่อไปนี้ มันควรจะเข้าใจว่าตัวอย่างมีไว้เพื่อแสดงให้เห็นการประดิษฐ์ จากคำอธิบายและ embodiments exemplified และตัวอย่างในฝีมือในงานศิลปะสามารถทำให้การปรับเปลี่ยนต่างๆหรือการปรับตัวเพื่อการประดิษฐ์ ดังกล่าว 25 การปรับเปลี่ยนหรือดัดแปลงจะถือว่าให้อยู่ในขอบเขตและจิตวิญญาณของการประดิษฐ์. ตัวอย่างตัวอย่างที่ 1 - การทำให้บริสุทธิ์ของ Hib คอนจูเกตใช้กรองเจลโครมาโทกราฟี (3.0 ลิตรขนาด) โครมา โทกราฟีคอลัมน์ (BPG, GE Healthcare) เต็มไปด้วย Sepharose CL-2B 5 (GE Healthcare) จะ equilibrated กับบัฟเฟอร์สมดุล (10 มิลลิบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่มี0.2 M NaC1) 3000 มิลลิลิตรน้ำมันดิบ Hib คอนจูเกต (Hib ลีแซโพคคาไรด์คอนจูเกตd เพื่อ toxoid บาดทะยัก) จะถูกโหลดลงคอลัมน์ equilibrated ก่อน น้ำมันดิบคอนจูเกตได้รับ fractionated (1 เศษส่วนให้เป็นเศษส่วน-4) ขึ้นอยู่กับการกระจายค่าสัมประสิทธิ์(Kd) จากการที่ที่ต้องการคอนจูเกต (เศษส่วน-2) มีการเก็บรวบรวมใน10 lfowthrough ส่วนที่เหลือของเศษส่วน (เศษส่วน-1 เศษส่วน-2 และเศษ-3) มีสารปนเปื้อน(รูปที่ลา). ตัวอย่าง 2a - การทำให้บริสุทธิ์ของ Hib คอนจูเกตโดยใช้โหมดผสมโครมาโทกราฟี (0.08 L สเกล) 15 80 มิลลิลิตร Hib น้ำมันดิบคอนจูเกตคือ Hib โพลีแซคคาไรด์คอนจูเกต d เพื่อ toxoid บาดทะยัก(ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร pH 5.8 และการนำ 20 mS / cm) จะปรับลด 10 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์สมดุล (10 มิลลิฟอสเฟตโซเดียมค่า pH 5.8 และการนำ 2 mS / cm) และเข้มข้นประมาณห้าครั้งปริมาณการใช้ kDa 1000 เทป (ค Biomax) คอนจูเกตเป็น diafiltered อย่างต่อเนื่อง (ใช้ 30 กิโลดาลตัน 20 เมมเบรน) กับบัฟเฟอร์สมดุลประมาณ 20 ครั้งและมีความเข้มข้นในการเริ่มต้นของปริมาณ. เมทริกซ์โหมดผสม (Capto 11V1 หลัก 700 เมทริกซ์, GE Healthcare) บรรจุใน BPG คอลัมน์ (GE Healthcare ) จะ equilibrated กับบัฟเฟอร์สมดุลและคอนจูเกต 25 โหลดในอัตรา 10 ซม / ชั่วโมง หลุดคอนจูเกตจะถูกเก็บรวบรวม ล้างจะได้รับการคอลัมน์โดยใช้บัฟเฟอร์สมดุลในการเก็บรวบรวมที่เหลือคอนจูเกตที่ไม่ใช่เฉพาะการยึดมั่นในเมทริกซ์ คอนจูเกตที่เก็บรวบรวมเป็นเจือจางโดยใช้ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 5.8-6.2 และกรองผ่าน 0.45 พี และ 0.2 ยูกรอง. ตัวอย่าง 2b - การทำให้บริสุทธิ์ของ Hib คอนจูเกตโดยใช้โหมดผสมโครมาโทกราฟี (3.0 ลิตรขนาด) 5 3000 มล Hib น้ำมันดิบคอนจูเกตคือ Hib โพลีแซคคาไรด์ คอนจูเกต d เพื่อ toxoid บาดทะยัก(ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร pH 5.8 และการนำ 20 mS / cm) จะปรับลด 10 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์สมดุล (ฟอสเฟต 10 มิลลิโซเดียมค่า pH 5.8 และการนำ 2 mS / cm) และเข้มข้นประมาณ 3 ครั้งปริมาณการใช้ kDa 1000 เทป (ค Biomax) คอนจูเกตเป็น diafiltered อย่างต่อเนื่อง (ใช้ 30 กิโลดาลตัน 10 เมมเบรน) กับบัฟเฟอร์สมดุลประมาณ 25 ครั้งและเข้มข้นในการเริ่มต้นของปริมาณ. เมทริกซ์โหมดผสม (CaptoTm หลัก 700 เมทริกซ์, GE Healthcare) บรรจุในคอลัมน์Axichrom (GE Healthcare) เป็น equilibrated กับบัฟเฟอร์สมดุลและ 15 คอนจูเกตที่มีการโหลดในอัตรา 60 ซม / ชั่วโมง หลุดคอนจูเกตจะถูกเก็บรวบรวม ล้างจะได้รับการใช้คอลัมน์บัฟเฟอร์สมดุลในการเก็บรวบรวมที่เหลือคอนจูเกตที่ไม่ใช่เฉพาะการยึดมั่นในเมทริกซ์ คอนจูเกตเป็นเจือจางโดยใช้พีเอช 5.8-6.2 ฟอสเฟตบัฟเฟอร์และกรองผ่าน 0.45 11 0.2 11 กรอง. 20 ตารางที่ 3 - ข้อดีของการใช้โหมดผสมโครมาโทกราฟีมากกว่ากรองเจลโครมาโทกราฟีสำหรับคอนจูเกตบริสุทธิ์กรองโหมดเจลผสมS.No. พารามิเตอร์1 ชุดขนาด2 ปริมาณเมทริกซ์ที่ใช้3 เสาสูง4 เส้นผ่าศูนย์กลางคอลัมน์5 ต้องการบัฟเฟอร์6 เกณฑ์ที่รวมกำไรโครมาโทกราฟี3.0 ลิตร60.0 L 90 ซม. 300 มม1000 L ภูมิภาคระบุของส่วนภายใน(สารปนเปื้อนและคอนจูเกตที่แยกต่างหากมากกว่าช่วงแคบมากเพิ่มความเสี่ยงของการปนเปื้อนดูรูปที่1). โครมาโทกราฟี3.0 ลิตร3.0 ลิตร18 ซม. 140 มม200 L ส่วนหลุด(สารปนเปื้อนและคอนจูเกตแยกมากกว่าที่หลากหลายลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนดูรูปปอนด์) 22 PCT-1424 7 8 9 10 บรรจุคอลัมน์เปิดออกและการดำเนินงานวิ่งโครมาระยะเวลาดำเนินการโดยรวมลักษณะของโครมาโทกราฟีหลักการมีส่วนร่วมยุ่งยากไม่สะดวกและไม่เสียเวลาอย่างมากในการดำเนินงาน6 วันFractionation ตามขนาดการยกเว้นขนาดยกเว้นง่ายมากสะดวกและง่าย<1 วันที่ลบโครมาโทกราฟี/ ไม่ใช่โหมดผูกพันยกเว้นขนาดไอออนแลกเปลี่ยนและไม่ชอบน้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นำที่ใช้ในที่นี้หมายถึง 10 ความสามารถในการแก้ปัญหา เช่น สารละลายบัฟเฟอร์ มีอิทธิพลปฏิสัมพันธ์ไฟฟ้าสถิต
, ตัวอย่างเช่นผูกหรือปล่อยของของสิ่งปนเปื้อนกับเมทริกซ์ การนําอาจจะปรับโดยการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของไอออนบัฟเฟอร์องค์ประกอบ บัฟเฟอร์ของการนำความร้อนต่ำโดยทั่วไปกว่า โดย
การนำความร้อนต่ำเป็นที่เข้าใจว่าซึ่งจะต่ำกว่า 10 ms / cm ควรต่ำกว่า 5 ms / cm , 15 และส่วนใหญ่โดยเฉพาะอย่างยิ่งต่ำกว่า 3 mS / cm ในหนึ่งในรูปลักษณะ , ค่า
ระหว่างประมาณ 8 ms / cm บัฟเฟอร์เป็นถึงประมาณ 0.5 ms / cm ระหว่างประมาณ 5 ms / cm
1 mS / cm ,ระหว่างประมาณ 4 ms / cm ถึงประมาณ 1.5 ms / cm ระหว่างประมาณ 3 mS / cm
ถึงประมาณ 2 mS / cm


20 ในหนึ่งในรูปลักษณะ , บัฟเฟอร์ที่เป็นแบบอย่างที่มีฟอสเฟต 10 มม. , pH 5.8
6.2 ด้วยค่าประมาณ 2 ms / cm

คอนจูเกตโหลดในอัตรา 2-120 เซนติเมตร / ชั่วโมง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในอัตรา 10-120
cm / h 20-110 เซนติเมตร / ชั่วโมง30-100 cm / h 40-90 cm / h 50-80 เซนติเมตร / ชั่วโมง หรือ 60-70 เซนติเมตร / ชั่วโมง อัตราการไหล 25 จะสามารถปรับได้เพื่อให้มีเวลาเพียงพอสำหรับสารปนเปื้อนในการโต้ตอบกับ
เมทริกซ์ ตัวอย่างอาจโหลด 300 เซนติเมตร / ชั่วโมง หรือเทียบเท่ากับหนึ่งหรือมากกว่าหนึ่งซ้ำ
ขั้นตอนการโหลด ถ้าจำเป็น , คอนจูเกตดิบอาจเป็นเยื่อกรองก่อน
โครมาโทกราฟีโหลดลงคอลัมน์คอนจูเกตที่ต้องการผ่าน
เป็นโมฆะเป็นของเรซินโหมดผสมและเก็บในส่วนไหลผ่านในขณะที่ 30 สิ่งสกปรกติดอยู่ภายในระบบโดยใช้หลัก ) และ / หรือปฏิสัมพันธ์ไอออน

ล้างให้คอลัมน์โดยใช้ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 5.8 6.2
เก็บที่เหลือคอนจูเกตไม่เฉพาะยึดมั่นในเมทริกซ์
คอนจูเกตบริสุทธิ์ถูกเจือจางด้วยความสูงการบัฟเฟอร์ pH 5.8 6.2 และกรองผ่าน 0.45p และ 0.22p กรอง


table-1 โพลีแซคคาไรด์อิสระ ( ช่วย ) , โปรตีนขนส่งฟรี ( TT ) และ EDC เนื้อหาหลัง

5 การโพลีแซคคาไรด์โปรตีนโครมาโทกราฟีคอนจูเกต




ฟรีช่วย 6.0 มก. / มล.

( ฮิบคอนจูเกต ) โดยคอลัมน์
โหมดผสม ( ) เป็นสารปนเปื้อน .
คอลัมน์ ( B ) หมายถึง ปริมาณของสิ่งปนเปื้อนก่อนที่จะผลิต
โพลีแซคคาไรด์โปรตีนคอนจูเกตโดยโครมาโทกราฟีโหมดผสม
15 คอลัมน์ ( c ) หมายถึง ปริมาณของสารปนเปื้อนที่ตกค้างหลังจากการ
โพลีแซคคาไรด์โปรตีนคอนจูเกตโดยโครมาโทกราฟีโหมดผสม .
คอลัมน์ ( D ) เป็นเปอร์เซ็นต์ของยอดเงินคงเหลือของสารปนเปื้อน คอลัมน์ ( E ) หมายถึงเปอร์เซ็นต์การลดสิ่งปนเปื้อน


20 ฟรีช่วยถูกหาโดยวิธีอธิบายโดยไทร C.M . , et al .( 1994 )
วัคซีน 12 ( 8 ) : 700-706

ฟรีโปรตีนในโพลีแซคคาไรด์คอนจูเกตวัคซีนอาจจะกำหนดโดยวิธีการ
รู้จักบุคคลผู้เชี่ยวชาญในศิลปะ ปริมาณของบาดทะยักฟรี ( TT ) ใน 25 ฮิบคอนจูเกต ( ช่วยป้องกันการคอนจูเกต D ) ถูกกำหนดโดยโครมาโทกราฟีแลกเปลี่ยนแอนไอออน
แข็งแรงโดยใช้สารรังสีโมเลกุลที่มีการโต้ตอบจะอ่อนแอ
ไอออนตัวอย่างแรก ( TT ) รองลงมา คือ โมเลกุลที่มีปฏิสัมพันธ์ไอออน
แข็งแรง ( ฮิบคอนจูเกต ) TT คือตัวอย่างฟรีโดยการลดค่าความเป็นกรดของเฟสเคลื่อนที่ต่ำกว่าปี่ของบาดทะยักสูง .ปริมาณของ TT ฟรีถูก quantified โดยเปรียบเทียบยอดพื้นที่ตัวอย่างของมาตรฐานสูงสุดบริเวณโค้งงัดข้อกับความเข้มข้น ( TG / ml ) สร้างขึ้นโดยใช้บาดทะยักสูง .
5
อิเล็กหลอดเลือดฝอย ( CYP ) โซนที่ใช้วัดปริมาณ 1-ethy1-3 - ( 3 -
dimethylaminopropyl ) carbodiimide ( EDC ) โดย โดยตรงการในเส้นเลือดโดยการดูดกลืนแสงยูวี
200 นาโนเมตรเพราะเนื้อหาในตัวอย่างตรวจ โดยเปรียบเทียบยอด
พื้นที่ของตัวอย่างที่มีพื้นที่สูงสุดของเส้นโค้งมาตรฐานการสร้างที่แตกต่างกัน
10 ความเข้มข้นของ EDC


ตาราง 2 - โมเลกุลกระจายขนาดของฮิบคอนจูเกตบริสุทธิ์ โดยผสมโหมด


( โครมาโทกราฟีโมเลกุลขนาด





b ตัวอย่าง
C



( และเนื้อหาในช่วง 13 องศาเซลเซียส ใน p.g
< 0.2 เท่ากับ 0.2-0.5 943.1

0.5-1 .0

จำหน่าย
( )
3

749.06 เกี่ยวกับ 104.83 89.21 9.5


15 โมเลกุลกระจายขนาดของเด็กบริสุทธิ์คอนจูเกตโดยใช้เกี่ยวข้อง
cl4b โครมาโทกราฟี ( ที่รายงานทางเทคนิค ชุด ไม่ ถึง 2 , 000 PG 27-56 )
3 ) การกระจายขนาดช่วง เช่น < 0.2 เท่ากับ 0.2-0.5 คาดว่า KD และ ดังแสดงในรูปที่ 2 คือข้อมูลช่วยปริมาณวิเคราะห์