used for the species phylogeny tech

used for the species phylogeny technique developed by Heled &
Drummond (2010) and applied using *BEAST and Beauti, parts
of the BEAST package (Drummond et al. 2012). The *BEAST
technique allows co-estimation of species phylogeny and
population parameters using a mixture of coalescent and Yule
processes (Heled & Drummond 2010). Thirty-seven isolates
were selected for BEAST analysis, including the 11 newly
sequenced isolates and 26 isolates fromHenk et al. (2011). These
isolates, sequenced for the four loci, were loaded into Beauti
and used to generate an XML file of 1 000 000 generations for
preliminary test runs. Using Tracer v1.5 to assess the runs, the
XML was optimised in Beauti for a final run of 100 000 000
generations with parameters logged every 1000 generations.
The HKY substitutionmodelwithempirical bases and invariant
sites was implemented. To calculate divergence dates fromthe
node heights, a molecular clock with fixed mean substitution
rate of 3  10
9 per yr was used, as previously described for
fungi of the class Eurotiomycetes (Kasuga et al. 2002). TreeAnotator
was used to generate the maximum clade credibility
tree after discarding the first 10% of generations as burn-in and
Tracer v1.5 was used to assess convergence.

Primer design for species-specific PCR
DNA sequences (n ¼ 206) of the benA, parA, trpC and crt1 loci
were retrieved from GenBank for the four species of Penicillium
as identified by Henk et al. (2011). Alignments were performed
using MEGA 5 (Tamura et al. 2011) to identify sites of variation
between the four species allowing exclusive detection of one
species per primer set. Primer Express Software v2.0 was then
used to design forward and reverse primers targeting unique
sites in each Chrysogenumcomplex species yielding amplicon
lengths of 100e200 bases. The 30 end of the primer was targeted
to the unique species sites for maximum specificity.

DNA was extracted from four isolates representing the
species of Henk et al. (2011) (NRRL-841, NRRL-792, NRRL-35692,
NRRL-A1399), and two isolates representing out of group Penicillium
species (CBS-171.89 and CBS-110409). We screened a
variety of PCR conditions to optimise specificity for each primer
pair using 25 ml reactions: 0.2 ml of TopTaq (Qiagen), 2.5 ml
of 10 TopTaq buffer, 0.4 ml 10 mM dNTP, 1 ml 10 mM of each
primer, 17.9 ml HyPure Molecular Biology Grade Water and 2 ml
of isolate 1:10 dilution DNA extract. Touchdown PCR cycling
parameters were as follows: 95 C for 15 min, followed by
seven cycles of 95 C for 30 s followed by a 72 C annealing
temperature for 30 s reduced by 1 C in each repeated cycle

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ใช้เทคนิค phylogeny พันธุ์ที่พัฒนา โดย Heled และดรัม (2010) และการประยุกต์ใช้ * สัตว์และ Beauti ชิ้นส่วนของสัตว์ (ดรัม et al. 2012) * สัตว์เทคนิคช่วยให้สปีชีส์ phylogeny ร่วมประเมิน และพารามิเตอร์ของประชากรที่ใช้ส่วนผสมของ coalescent และเทศกาลคริสต์มาสกระบวนการ (Heled & ดรัม 2010) แยกสามสิบเจ็ดเลือกสัตว์วิเคราะห์ รวมทั้ง 11 แบบใหม่แยกตามลำดับและแยก 26 fromHenk et al. (2011) เหล่านี้แยก การเรียงลำดับสำหรับ loci สี่ ถูกโหลดเป็น Beautiและใช้ในการสร้างไฟล์ XML ของรุ่น 1 000 000 สำหรับทดสอบเบื้องต้นทำงาน ใช้ติดตามคืนชีพเพื่อประเมินการทำงาน การXML ได้ใน Beauti เหมาะสำหรับงานกราฟฟิกรันสุดท้ายของ 100 000 000รุ่นกับพารามิเตอร์ที่เข้าสู่ระบบทุกรุ่น 1000HKY substitutionmodelwithempirical ฐานและบล็อกอเมริกามีการใช้งาน การคำนวณวัน divergence จากการโหนสูง ทดแทนหมายความว่า นาฬิกาโมเลกุลกับถาวร9 10 3 ต่อปีอัตราใช้ ก่อนหน้านี้ที่ อธิบายไว้ในเชื้อราของคลาส Eurotiomycetes (คาซูกะ et al. 2002) TreeAnotatorใช้ในการสร้างความน่าเชื่อถือสูงสุด cladeแผนภูมิ 10% แรกของรุ่นเป็นการเขียนในการละทิ้ง และใช้ติดตามคืนชีพจะบรรจบกันออกแบบรองพื้นสำหรับ species-specific PCRลำดับดีเอ็นเอ (n ¼ 206) ของ loci benA พารา trpC และ crt1ได้ดึงข้อมูลจาก GenBank พันธุ์ Penicillium สี่ระบุว่าโดย Henk et al. (2011) ได้ดำเนินการจัดแนวใช้ 5 ร็อค (Tamura et al. 2011) ระบุไซต์เปลี่ยนแปลงระหว่างสายพันธุ์ 4 ให้ตรวจสอบเฉพาะหนึ่งชนิดต่อชุดรองพื้น รองพื้น Express ซอฟต์แวร์ v2.0 ได้แล้วใช้ในการออกแบบไปข้างหน้า และย้อนกลับกำหนดเป้าหมายเฉพาะไพรเมอร์ในแต่ละพันธุ์ Chrysogenumcomplex amplicon ผลผลิตความยาวของฐาน 100e200 สิ้นสุด 30 พื้นเป็นเป้าหมายไซต์พันธุ์เฉพาะสำหรับ specificity สูงสุดดีเอ็นเอที่สกัดจากสี่แยกแทนชนิดของ Henk et al. (2011) (NRRL 841, NRRL-792, NRRL-35692NRRL-A1399), และสองแยกตัวแทนจากกลุ่ม Penicilliumสปีชีส์ (CBS 171.89 และ CBS-110409) เราฉายความหลากหลายของเงื่อนไข PCR specificity สำหรับรองพื้นแต่ละอินพุทคู่ที่ใช้ปฏิกิริยา 25 ml: 0.2 ml ของ TopTaq (Qiagen), 2.5 mlTopTaq บัฟเฟอร์ 10, dNTP 0.4 ml 10 มม. 10 มม.แต่ละ 1 mlสีรองพื้น การ 17.9 มล HyPure อณูชีววิทยาระดับน้ำ และ 2 mlของแยก 1:10 สกัดเจือจางดีเอ็นเอ เหรียญ PCR ขี่จักรยานพารามิเตอร์ได้ดังนี้: C 95 สำหรับ 15 นาที ตามด้วยรอบ 7 ของ 95 C สำหรับ 30 s ตาม ด้วยการอบเหนียว 72 Cอุณหภูมิสำหรับ 30 s ลดลง 1 C ในวงจรแต่ละซ้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ใช้สำหรับเทคนิคเชื้อชาติสายพันธุ์ที่พัฒนาโดย Heled
และดรัมมอนด์(2010) และการประยุกต์ใช้ * BEAST และ Beauti
ชิ้นส่วนของแพคเกจBEAST (ดรัมมอนด์ et al. 2012) * การ BEAST
เทคนิคช่วยให้ผู้ร่วมการประมาณค่าของสายพันธุ์เชื้อชาติและพารามิเตอร์ของประชากรโดยใช้ส่วนผสมของ Coalescent และเทศกาลคริสต์มาสกระบวนการ(Heled และดรัมมอนด์ 2010) สามสิบเจ็ดสายพันธุ์ได้รับการคัดเลือกในการวิเคราะห์ BEAST รวมทั้ง 11 ใหม่สายพันธุ์ติดใจและ26 แยก fromHenk et al, (2011) เหล่านี้สายพันธุ์, ลำดับสำหรับสี่ตำแหน่งถูกโหลดลงใน Beauti และใช้ในการสร้างไฟล์ XML ที่ 1 000 000 รุ่นสำหรับวิ่งทดสอบเบื้องต้น ใช้ v1.5 Tracer ในการประเมินการทำงานของXML ที่ถูกปรับให้เหมาะสมใน Beauti สำหรับการทำงานสุดท้ายของ 100 000 000 รุ่นที่มีพารามิเตอร์เข้าสู่ระบบทุกรุ่น 1,000. ฐาน HKY substitutionmodelwithempirical และคงที่เว็บไซต์ถูกนำมาใช้ ในการคำนวณวันที่แตกต่าง fromthe สูงโหนดนาฬิกาโมเลกุลที่มีคงทดแทนเฉลี่ยอัตรา 3? 10 9 ต่อปีถูกนำมาใช้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สำหรับเชื้อราชั้นEurotiomycetes (Kasuga et al. 2002) TreeAnotator ถูกใช้ในการสร้างความน่าเชื่อถือสูงสุด clade ต้นไม้ทิ้งหลังจากที่ครั้งแรก 10% ของคนรุ่นเป็นเผาไหม้ในและTracer v1.5 ถูกใช้ในการประเมินการบรรจบกัน. การออกแบบไพรเมอร์สายพันธุ์เฉพาะ PCR ลำดับดีเอ็นเอ (n ¼ 206) ของ Bena , พารา trpC และตำแหน่ง crt1 ถูกดึงมาจาก GenBank สำหรับสี่ชนิด Penicillium ที่ระบุไว้โดย Henk et al, (2011) ได้ดำเนินการจัดแนวการใช้ MEGA 5 (ทามูระ et al. 2011) เพื่อระบุเว็บไซต์ของการเปลี่ยนแปลงระหว่างสี่ชนิดที่ช่วยให้การตรวจสอบพิเศษของหนึ่งในสายพันธุ์ต่อชุดไพรเมอร์ ไพรเมอร์เอ็กซ์เพรส v2.0 ซอฟแวร์จากนั้นก็ใช้ในการออกแบบไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์ที่ไม่ซ้ำกันกำหนดเป้าหมายเว็บไซต์ในแต่ละสายพันธุ์ที่ให้ผลผลิตChrysogenumcomplex amplicon ความยาวของฐาน 100e200 30 ในตอนท้ายของไพรเมอร์เป็นเป้าหมายไปยังเว็บไซต์ที่ไม่ซ้ำกันสำหรับสายพันธุ์จำเพาะสูงสุด. ดีเอ็นเอที่สกัดจากสี่สายพันธุ์ที่เป็นตัวแทนของสายพันธุ์ของ Henk et al, (2011) (NRRL-841, NRRL-792, NRRL-35692, NRRL-A1399) และสายพันธุ์ที่เป็นตัวแทนจากกลุ่ม Penicillium ชนิด (ซีบีเอสและซีบีเอส 171.89-110409) เราคัดเลือกความหลากหลายของสภาพ PCR เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพเฉพาะเจาะจงสำหรับแต่ละไพรเมอร์คู่โดยใช้ปฏิกิริยา25 มล.: 0.2 มิลลิลิตร TopTaq (Qiagen) 2.5 มล.? 10 บัฟเฟอร์ TopTaq 0.4 มล. 10 มิลลิ dNTP 1 มล. 10 มิลลิของแต่ละไพรเมอร์, 17.9 มล. HyPure ชีววิทยาระดับโมเลกุลน้ำและชั้นประถมศึกษาปีที่ 2 มล. ของแยก 01:10 เจือจางสารสกัดดีเอ็นเอ ดาว์นขี่จักรยาน PCR พารามิเตอร์มีดังนี้? 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีตามด้วยเจ็ดรอบ95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วยการอบ 72 C? อุณหภูมิ 30 วินาทีลดลง 1 ซีในแต่ละรอบซ้ำ?

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ใช้สำหรับชนิดของระบบเชื้อชาติเทคนิคที่พัฒนาโดยเฮเลด&
ดรัมมอนด์ ( 2010 ) และประยุกต์ใช้ * * * * สัตว์ และบิวตี้ ชิ้นส่วน
ของสัตว์ชุดดรัมมอนด์ et al . 2012 ) * เทคนิคสัตว์
ให้ประมาณ Co ชนิดระบบเชื้อชาติและ
ประชากรพารามิเตอร์การใช้ส่วนผสมของการรวมตัว และ ยูล
กระบวนการ ( เฮเลด& Drummond 2010 ) สามสิบเจ็ดสายพันธุ์
สุ่มการวิเคราะห์สัตว์รวมทั้ง 11 ลำดับ 26 สายพันธุ์สายพันธุ์ใหม่
fromhenk et al . ( 2011 ) เหล่านี้
สายพันธุ์นี้สำหรับ 4 ตำแหน่ง , มีโหลดในบิวตี้
และใช้ในการสร้างไฟล์ XML ของ 1 , 000 , 000 รุ่นสำหรับ
วิ่งทดสอบเบื้องต้น การติดตาม v1.5 ประเมินวิ่ง
XML คือที่ดีที่สุดสำหรับสุดท้ายในตอนนี้วิ่ง 100 000 000
รุ่นกับพารามิเตอร์เข้าสู่ระบบทุกๆ 1000
รุ่นการ hky substitutionmodelwithempirical ฐานและไม่เปลี่ยนแปลง
เว็บไซต์ที่ถูกนำมาใช้ คำนวณความแตกต่างจากช่อง
โหนด Heights , นาฬิกาโมเลกุลคงหมายถึงการแทนที่
อัตรา 3  10
9 ต่อปี ใช้ เป็น ก่อนหน้านี้ อธิบาย
เชื้อราของชั้น eurotiomycetes ( คาสึกะ et al . 2002 ) treeanotator
ถูกใช้เพื่อสร้างความน่าเชื่อถือสูงสุด
cladeต้น หลังจากทิ้งก่อน 10% ของรุ่นตามที่เขียนใน v1.5
ติดตามและใช้เพื่อประเมินการบรรจบกัน

รองพื้นออกแบบเฉพาะ - ขยายพันธุ์ PCR
ลำดับดีเอ็นเอ ( N ¼ 206 ) ของ Bena พารา trpc , และรูปแบบ crt1
ถูกดึงจาก 5% สำหรับสี่ชนิดของเชื้อรา Penicillium
ตามที่ระบุโดย et al , แฮงก์ . ( 2011 ) การได้ใช้เมก้า
5 ( ทามูระ et al .2011 ) เพื่อระบุเว็บไซต์ของการเปลี่ยนแปลง
ระหว่างสี่ชนิดให้ตรวจหาชนิดต่อหนึ่ง
รองพื้นเซ็ตพิเศษ รองพื้นซอฟต์แวร์ Express V2.0 แล้ว
ใช้ออกแบบไปข้างหน้าและย้อนกลับจากเป้าหมายของเว็บไซต์ที่ไม่ซ้ำกันในแต่ละ chrysogenumcomplex

ชนิดและความยาวของฐาน 100e200 ยวบยาบ 30 ปลาย ไพรเมอร์เป็นเป้าหมาย
กับสายพันธุ์เฉพาะเว็บไซต์ให้ความจำเพาะสูงสุด .

ดีเอ็นเอจากสี่แยกแทน
ชนิดแฮงก์ et al . ( 2011 ) ( nrrl-841 nrrl-792 nrrl-35692
, , , nrrl-a1399 ) และสองสายพันธุ์ของชนิดของเชื้อรา Penicillium
กลุ่ม ( cbs-171.89 และ cbs-110409 ) เราคัดเป็น
หลากหลายสภาพ PCR เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพความจำเพาะของแต่ละคู่ โดยใช้ไพรเมอร์
25 มล. 0.2 มิลลิลิตรปฏิกิริยา toptaq ( เพิ่ม ) , 2.5 ml
ของ  10 toptaq บัฟเฟอร์ , 0dntp 10 มิล 4 ml 1 มล. 10 มม. ของแต่ละ
primer , 17.9 ml hypure อณูชีววิทยาและเกรดน้ำ 2 มล.
ของแยก 1 : 10 ( DNA ที่สกัดเข้มข้น Touchdown PCR จักรยาน
พารามิเตอร์ดังนี้ 95  เป็นเวลา 15 นาที ตามด้วย
7 รอบ 95  เป็นเวลา 30 วินาทีตามด้วย 72  C อุณหภูมิการหลอม
30 s ลด 1  C ในแต่ละซ้ำรอบ