2.2. Protoplast isolationProtoplast

2.2. Protoplast isolation
Protoplast isolation was performed using the methods
described by Guo et al. (2007), Yoo et al. (2007) and Guan et al.
(2010), with some modifications. An enzyme solution was prepared
containing 1.5% (w/v) cellulase R-10, 0.4% (w/v) macerozyme R10, 20 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) and mannitol.
To determine conditions for maximum protoplast yield, a mannitol
concentration gradient experiment (replicated three times) was
conducted and varying concentrations of mannitol (0.2, 0.4, 0.6 or
0.8 M, with 0.2 M as control) were compared. The enzyme solution
was placed in a water bath at 55 ◦C for 10 min, cooled to room temperature,
then bovine serum albumin [BSA, 0.1% (w/v)] and CaCl2
(10 mM) were added (pH adjusted to 5.8), and the solution was
sterilized using a 0.45-m filter, then stored for later use. Cotyledons
or true leaves were cut into fine strip (∼1 mm) with a blade
along the direction vertical to the main vein. The strips were rapidly
transferred to enzymolysis solution (0.3–0.4 g/10 ml), permeated
in a vacuum and under weak light for 30 min, and then incubated
in enzymolysis solution at 25
±
1 ◦C in darkness with rotation
(40–50 r/min). To optimize the enzymolysis time, the tissues were
digested for 4, 6, 8, 10 or 12 h (with 4 h as control, replicated three
times), respectively. After digestion, the enzymolysate was diluted
with an equal volume of W5 solution (2 mM MES, 154 mM NaCl,
125 mM CaCl2, 5 mM KCl, pH 5.8) (Yoo et al., 2007) and mixed
gently, then filtered through nylon membrane (200 mesh). The filtrate
was centrifuged at 1000 r/min for 2 min, the supernatant was
discarded, and the protoplasts were washed one more time with
W5. The supernatant was removed after centrifugation and the
protoplasts were resuspended with W5 solution at a final concentration
of 2 × 106 protoplasts/ml (Yoo et al., 2007) for the next
transient transfection.
The purified protoplasts were diluted appropriately and counted
with a hemacytometer under a microscope for protoplast yield
statistics. Protoplast yield was calculated as follows: protoplast
yield (protoplasts/g FW) = number of the protoplasts yielded in
enzymolysis (protoplasts)/fresh weight of the material used in
enzymolysis (g FW). Protoplast viability was detected with fluorescein
diacetate (FDA) dye (Larkin, 1976). In solution, FDA is very
weak fluorescent dye. In a living cell, enzymes called esterases
in the cytosol cleave the two acetate molecules from a molecule
of FDA, leaving highly fluorescent Fluorescein. Under ultraviolet
light, Fluorescein accumulated in viable protoplasts glows with
a brilliant green hue. In this experiment, FDA stock solution was
added to diluted protoplasts at a final concentration of 0.01%,
and were then incubated in darkness for 5 min, washed twice
with W5 solution, then resuspended in WI solution (4 mM MES,
0.5 M mannitol, 20 mM KCl, pH 5.8) (Yoo et al., 2007). Fluorescence
microscopy under ultraviolet light (Olympus B × 51) was
used to determine protoplast viability as follows: protoplast viability
(%) = (fluorescent protoplast number in view/protoplast total
number in view)×100%.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. protoplast แยกแยก protoplast ถูกดำเนินการโดยใช้วิธีการอธิบาย โดย Guo et al. (2007), ยู et al. (2007) และกวน et al(2010), ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง จัดเตรียมวิธีการแก้ปัญหาของเอนไซม์ประกอบด้วย cellulase 1.5% (w/v) R-10, 0.4% (w/v) macerozyme R10 กรด 2-morpholinoethanesulfonic 20 มม. (MES) และ mannitolเพื่อกำหนดเงื่อนไขสำหรับผลผลิตสูงสุด protoplast, mannitolได้ทดลองการไล่ระดับความเข้มข้น (จำลองแบบแล้ว 3 ครั้ง)ดำเนินการ และหลากหลายความเข้มข้นของ mannitol (0.2, 0.4, 0.6 หรือ0.8 M กับ 0.2 M เป็นตัวควบคุม) ได้เปรียบเทียบ วิธีการแก้ไขปัญหาของเอนไซม์วางในอ่างน้ำที่ ◦C 55 สำหรับ 10 นาที เย็นที่อุณหภูมิห้องแล้ววัว serum albumin [บีเอสเอ 0.1% (w/v)] และ CaCl2(10 มม.) เพิ่ม (ค่า pH ปรับ 5.8), และการแก้ไขปัญหาฆ่าเชื้อโดยใช้ตัวกรอง 0.45 m แล้วเก็บไว้ใช้ในภายหลัง Cotyledonsหรือใบจริงที่ตัดเป็นแถบปรับ (∼1 mm) กับใบมีดไปตามทิศทางแนวตั้งกับเส้นหลัก แถบได้อย่างรวดเร็วโอนไป enzymolysis โซลูชัน (0.3 – 0.4 g/10 ml), แทรกซึมในสุญญากาศ และภาย ใต้แสงสว่างสำหรับ 30 นาที และจากนั้น ได้รับการกกในการแก้ปัญหา enzymolysis 25±◦C 1 ในความมืดด้วยการหมุน(40-50 r นาที) การปรับปรุงเวลา enzymolysis เนื้อเยื่อได้ย่อยสำหรับ 4, 6, 8, 10 หรือ 12 h (h 4 เป็นตัวควบคุม จำลองสามที่มีเวลา), ตามลำดับ เจือจาง enzymolysate หลังจากย่อยอาหารด้วยปริมาณเท่ากับโซลูชัน W5 (2 มม MES, NaCl มม.125 มม. CaCl2, 5 mM KCl, pH 5.8) (ยู et al. 2007) และแบบผสมเบา ๆ จากนั้นกรองผ่านเมมเบรนไนลอน (ตาข่าย 200) การกรองถูกเหวี่ยงที่ 1000 r/นาที 2 นาที supernatant ถูกทิ้ง และพลาสต์ถูกล้างอีกครั้งหนึ่งด้วยW5 Supernatant ถูกเอาออกหลังจากหมุนเหวี่ยงและพลาสต์ได้ resuspended ด้วย W5 ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 2 × 106 พลาสต์/ml (ยู et al. 2007) สำหรับถัดไปtransfection ชั่วคราวพลาสต์บริสุทธิ์ผสมอย่างเหมาะสม และนับด้วย hemacytometer ภายใต้กล้องจุลทรรศน์สำหรับ protoplast ผลสถิติของ ผลผลิต protoplast ถูกคำนวณดังนี้: protoplastผลผลิต (พลาสต์/g FW) =จำนวนพลาสต์ผลในenzymolysis (พลาสต์) น้ำหนักสดของวัสดุใช้ในenzymolysis (g FW) ชีวิต protoplast ถูกตรวจพบ ด้วย fluoresceinการย้อมสี diacetate (FDA) (ลาร์กิน 1976) ในการแก้ปัญหา FDA เป็นอย่างมากสีเรืองแสงอ่อน ในเซลล์ชีวิต เอนไซม์เรียกว่า esterasesในไซโตซอลการกระจายโมเลกุลอะซิเตทสองจากโมเลกุลของ FDA ออกจาก Fluorescein ฟลูออเรสเซนต์สูง ภายใต้รังสีอัลตราไวโอเลตแสง Fluorescein สะสมในแสงพลาสต์อีกด้วยเฉดสีเขียวสดใส ในการทดลองนี้ FDA หุ้นเป็นเพิ่มพลาสต์เจือจางที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.01%และได้รับการกกแล้วในที่มืด 5 นาที ล้างสองครั้งด้วยโซลูชัน W5 แล้ว resuspended ใน WI (4 มม. MES0.5 M mannitol, 20 mM KCl ค่า pH 5.8) (ยู et al. 2007) สารเรืองแสงไมโครสโคภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต (Olympus B × 51) ถูกใช้ในการกำหนดชีวิต protoplast เป็นดังนี้: protoplast ชีวิต(%) = (จำนวน protoplast ฟลูออเรสเซนต์รวมมุม มอง/protoplastหมายเลขในมุมมอง) × 100%

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 โปรโตพลาแยก
โปรโตพลาแยกถูกดำเนินการโดยใช้วิธีการ
อธิบายโดย Guo et al, (2007) ยูเอตอัล (2007) และกวน et al.
(2010) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง วิธีการแก้ปัญหาของเอนไซม์ถูกจัดทำขึ้น
มี 1.5% (w / v) เซลลู R-10 0.4% (w / v) macerozyme R10, 20 มิลลิเมตรกรด 2 morpholinoethanesulfonic (MES) และแมนนิทอล.
การตรวจสอบเงื่อนไขในการให้ผลผลิตโปรโตพลาสูงสุดเป็น mannitol
การทดสอบความเข้มข้นของการไล่ระดับสี (จำลองแบบสามครั้ง) เป็น
ดำเนินการที่แตกต่างกันและความเข้มข้นของแมนนิทอล (0.2, 0.4, 0.6 หรือ
0.8 ล้านกับ 0.2 M เป็นตัวควบคุม) ถูกนำมาเปรียบเทียบ การแก้ปัญหาการทำงานของเอนไซม์
ที่วางอยู่ในอ่างน้ำที่ 55 ◦Cเป็นเวลา 10 นาที, เย็นที่อุณหภูมิห้อง
แล้ววัวอัลบูมิเซรั่ม [BSA 0.1% (w / v)] และ CaCl2
(10 มิลลิเมตร) ถูกเพิ่ม (ปรับ pH 5.8 ) และวิธีการแก้ปัญหาที่ถูก
ฆ่าเชื้อโดยใช้ตัวกรอง 0.45-? เมตรแล้วเก็บไว้เพื่อใช้ในภายหลัง ใบเลี้ยง
หรือใบจริงถูกตัดลงในแถบที่ดี (~1 มิลลิเมตร) ที่มีใบมีด
ตามทิศทางในแนวตั้งกับเส้นเลือดหลัก แถบถูกอย่างรวดเร็ว
โอนเพื่อแก้ปัญหา enzymolysis (0.3-0.4 กรัม / 10 มล.) เต็ม
ในสุญญากาศและภายใต้แสงไฟที่อ่อนแอเป็นเวลา 30 นาทีและจากนั้นบ่ม
ในการแก้ปัญหา enzymolysis ที่ 25
±
1 ◦Cในความมืดกับการหมุน
(40-50 R / นาที) เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพเวลา enzymolysis เนื้อเยื่อที่ถูก
ย่อย 4, 6, 8, 10 หรือ 12 ชั่วโมง (มี 4 ชั่วโมงขณะที่การควบคุมการจำลองแบบสาม
ครั้ง) ตามลำดับ หลังจากการย่อยอาหาร enzymolysate ถูกเจือจาง
ด้วยปริมาตรที่เท่ากันของการแก้ปัญหา W5 (2 mm MES 154 มิลลิโซเดียมคลอไรด์,
125 มิลลิเมตร CaCl2 5 มิลลิ KCl ค่า pH 5.8) (Yoo et al., 2007) และผสม
เบา ๆ แล้วกรองผ่านผ้าไนล่อน เมมเบรน (200 ตาข่าย) กรอง
ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1,000 รอบ / นาทีเป็นเวลา 2 นาที, สารละลายที่ถูก
ทิ้งและโปรโตพลาถูกล้างอีกครั้งหนึ่งกับ
W5 ใสถูกลบออกหลังจากการหมุนเหวี่ยงและ
โปรโตพลาถูก resuspended กับการแก้ปัญหา W5 ที่ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ 2 × 106 โปรโตพลา / ml (Yoo et al., 2007) สำหรับถัดไป
transfection ชั่วคราว.
โปรโตพลาบริสุทธิ์ถูกเจือจางเหมาะสมและนับ
กับ hemacytometer ภายใต้กล้องจุลทรรศน์สำหรับอัตราผลตอบแทนโปรโตพลา
สถิติ อัตราผลตอบแทนโปรโตพลาที่คำนวณได้ดังนี้โปรโตพลา
ผลผลิต (โปรโตพลา / g FW) = จำนวนโปรโตพลาให้ผลใน
enzymolysis (โปรโตพลา) / น้ำหนักสดของวัสดุที่ใช้ในการ
enzymolysis (g FW) มีชีวิตโปรโตพลาพบกับ fluorescein
diacetate (FDA) สีย้อม (เฟร็ดดี้, 1976) ในการแก้ปัญหา, องค์การอาหารและยาเป็นอย่างมาก
ที่อ่อนแอสีย้อมเรืองแสง ในเซลล์ที่มีชีวิตเอนไซม์ที่เรียกว่า esterases
ในเซลล์แล่งสองโมเลกุลอะซิเตทจากโมเลกุล
ขององค์การอาหารและยาออกจาก Fluorescein เรืองแสงสูง ภายใต้รังสีอัลตราไวโอเลต
แสง Fluorescein สะสมในโปรโตพลาที่ทำงานได้เรืองแสงที่มี
สีเขียวสดใส ในการทดลองนี้องค์การอาหารและยาแก้ปัญหาสต็อก
เพิ่มให้กับโปรโตพลาเจือจางที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.01%
และถูกบ่มแล้วในความมืดเป็นเวลา 5 นาทีล้างครั้งที่สอง
กับการแก้ปัญหา W5 แล้ว resuspended ในการแก้ปัญหา WI (MES 4 มิล,
0.5 M mannitol, 20 มิลลิเมตร KCl ค่า pH 5.8) (Yoo et al., 2007) เรืองแสง
กล้องจุลทรรศน์ภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต (โอลิมปั B × 51) ถูก
ใช้ในการกำหนดความมีชีวิตของโปรโตพลาดังนี้มีชีวิตโปรโตพลา
(%) = (จำนวนโปรโตพลาเรืองแสงในมุมมอง / โปรโตพลารวม
จำนวนในมุมมอง) × 100%

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การแยกโปรโตพลาสต์การแยกโปรโตพลาสต์โดยใช้วิธีการคืออธิบายโดย Guo et al . ( 2007 ) , ยู et al . ( 2007 ) และกวน et al .( 2010 ) , มีการปรับเปลี่ยน เอนไซม์ในสารละลายที่เตรียมไว้ที่ 1.5 % ( w / v ) เซลลูเลส r-10 0.4 % ( w / v ) macerozyme R10 , 20 มม. 2-morpholinoethanesulfonic กรด ( MES ) และ 5 .เพื่อตรวจสอบเงื่อนไขสำหรับผลผลิตจำนวนสูงสุด , แมนนิทอลทดลองไล่ระดับความเข้มข้น ( จำนวน 3 ครั้ง )ดำเนินการและความเข้มข้นแตกต่างกันของแมนนิทอล ( 0.2 , 0.4 , 0.6 หรือ0.8 m กับ 0.2 M เป็นกลุ่มควบคุม ) เปรียบเทียบ สารละลายเอนไซม์อยู่ในอ่างน้ำที่ 55 ◦องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที เย็นที่อุณหภูมิห้องแล้วอัลบูมิน [ BSA , 0.1% ( w / v ) ] และผลิต( 10 มม. ) เพิ่ม ( ปรับ pH 5.8 ) และโซลูชั่น คือฆ่าเชื้อ ใช้กรอง 0.45-m แล้วเก็บไว้เพื่อใช้ในภายหลัง การแสดงออกหรือใบจริงมาตัดเป็นแถบก็ได้ ( ∼ 1 มม. ) กับใบมีดตามแนวตั้งกับเส้นหลัก แถบเป็นอย่างรวดเร็วย้ายไป enzymolysis โซลูชั่น ( 0.3 - 0.4 กรัม / มิลลิลิตร ( 10 )ในสุญญากาศและภายใต้ไฟอ่อนประมาณ 30 นาที จากนั้นบ่มใน enzymolysis โซลูชันที่ 25±1 ◦ C ในความมืดด้วยการหมุน( 40 – 50 r / min ) เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพ enzymolysis เวลาขับถ่ายคือย่อยที่ 4 , 6 , 8 , 10 หรือ 12 ชั่วโมง ( 4 H ขณะที่ควบคุมแบบสามครั้ง ) , ตามลำดับ หลังจากการย่อย , enzymolysate เจือจางด้วยปริมาณเท่ากันของ W5 โซลูชั่น ( 2 มม. นอกจากนี้ , NaCl 154 มม.ผลิต 125 mm . 5 มิลลิโมลาร์ pH 5.8 ) ( ยู et al . , 2007 ) และผสมเบาๆ แล้วกรองผ่านเมมเบรน ( 200 ตาข่ายไนล่อน ) ส่วนกรองอยู่ที่ระดับ 1 , 000 R / นาที 2 นาที นำ คือยกเลิก , และพบว่าล้างอีกครั้งด้วยW5 . และน่านถูกลบออกหลังจากปั่นและพบว่า resuspended กับสารละลายที่ความเข้มข้นสุดท้าย W52 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร ( ยู et al . , 2007 ) ต่อไปชั่วคราวสำหรับ .และพบว่าจำนวนที่เหมาะสมและนับกับ hemacytometer ภายใต้กล้องจุลทรรศน์สำหรับจำนวนผลผลิตสถิติ โปรคำนวณผลผลิตดังนี้ โปรโตพลาสต์ผลผลิต ( โปรโตพลาสต์ / g FW ) = จำนวนโปรโตพลาสต์จากในenzymolysis ( ต่อ ) / น้ำหนักสดของวัตถุดิบที่ใช้ในenzymolysis ( G FW ) สามารถตรวจพบโปรกับี่ได ซิเตท ( FDA ) ย้อม ( Larkin , 1976 ) ในสารละลาย , FDA มีมากอ่อนเรืองแสงสี ในเซลล์ เอนไซม์ที่เรียกว่าหาอาหารที่พบในประเทศไทยใน PDF แยกสองโมเลกุลอะซิเตตจากโมเลกุลของ FDA ออกมากี่หลอด . ภายใต้รังสีอัลตราไวโอเลตอ่อนี่สะสมในเซลล์เรืองแสงด้วยได้สีสันเขียวสดใส ในการทดลองนี้ คือ หุ้นโซลูชั่น องค์การอาหารและยาเพิ่มจำนวนโปรโตพลาสต์ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.01 %และจากนั้นบ่มในที่มืดเป็นเวลา 5 นาที ล้างหน้าสองครั้งกับ W5 โซลูชั่น แล้ว resuspended ใน วี โซลูชั่น ( 4 มม. นอกจากนี้ ,mannitol 0.5 M KCl 20 มม. , pH 5.8 ) ( ยู et al . , 2007 ) ฟลูออเรสเซนซ์กล้องจุลทรรศน์ภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต ( Olympus b × 51 ) คือใช้กำหนดจำนวนของโปรโตพลาสต์ของดังนี้( % ) = ( จำนวนแบคทีเรียเรืองแสงในมุมมอง / โปรทั้งหมดจำนวนที่ดู ) × 100 %