- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Ja
Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Japan), denoted a sterilized
mixture of pure kefiran and L. kefiranofaciens bacteria cultured
in rice medium.
7) Rice kefiran is a powder of dried culture
filtrate containing 0.5 or 15% kefiran [kefiran and concentrated
kefiran (c-kefiran), respectively], which is produced in a
hydrolyzed rice medium by L. kefiranofaciens. The repeating
structure of kefiran is shown in Fig. 1.
4) When mast cells
were cultured overnight in the presence of kefiran or c-kefiran
(0—5mg/mL), >90% of mast cells were confirmed to be viable
and morphologically normal by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT) assay and
trypan blue exclusion test. In the experiment, mast cells were
pretreated with kefiran or c-kefiran by standing for 30min in
the medium at 37°C and then stimulated with antigen in the
presence of kefiran. In degrading kefiran, kefiran and c-kefiran
(10mg/mL) were heated at 100°C in 2.5 M trifluoroacetic acid
(TFA) for 2, 4, and 6 h, because the mono- and oligo-saccharides
were detected by a thin-layer chromatography after the
treatment for 6h in a preliminary result. The TFA-treated
kefiran and c-kefiran were dried with nitrogen gas under reduced
pressure to remove the solvent and resuspended at 3mg/
mL in the medium and N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N′-2-
ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (10mM HEPES [pH 7.4],
140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 0.6mM MgCl2, 0.1%
BSA, and 0.01% sulfinpyrazone).
[Ca2+]i Measurement BMMCs (5×105 cells) were loaded
with 1µM Fura 2-AM (Molecular Probes, Eugene, OR,
U.S.A.), sensitized with anti-DNP IgE for 30min at 37°C,
and then washed twice with HEPES buffer. Fluorescence intensities
at 500 nm using excitation wavelengths of 340 and
360nm were measured at 37°C, and the F340/F360 ratio was
calculated using a spectrofluorometer connected to a personal
computer (RF-5300PC; Shimadzu, Kyoto, Japan). Ratios were
converted to Ca2+ concentrations by a previously described
procedure.
15,17)
Degranulation Assay The degranulation of mast cells
was monitored by measuring the activity of granule-stored
enzyme β-hexosaminidase secreted into cell supernatants.
15)
BMMCs (5×105 cells) sensitized with anti-DNP IgE for 30min
at 37°C were washed twice with HEPES buffer. A BMMC
suspension (200µL) was incubated with DNP-BSA for 30min
at 37°C. In the case of RBL-2H3 cells, cells (5×104 cells/
well) plated in 24-well plate and cultured overnight were
sensitized with anti-DNP IgE for 30min at 37°C and washed
twice with HEPES buffer.
17) Aliquots of mast cell supernatants
(BMMCs and RBL-2H3 cells) were transferred to a 96-well
plate (20µL/well) and incubated with 20µL of substrate solution
(2mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (SigmaAldrich,
St Louis, MO, U.S.A.) in 100mM citrate [pH 4.5])
for 1h at 37°C. After terminating the reaction with 160µL of
167mM Na2CO3–NaHCO3 buffer, the absorbance at 405nm
was measured using a microplate reader (Model 680; Bio-Rad
Laboratories, Tokyo, Japan). The release activity relative to
the total β-hexosaminidase content of cells was determined by
disrupting the cells with 0.1% Triton X-100.
Assays for Cytokine Production BMMCs (5×105
cells) sensitized with anti-DNP IgE for 30min at 37°C were
washed twice with HEPES buffer and then stimulated with
DNP-BSA for 3h at 37°C. Supernatants were collected and
absolute amounts of TNF-α released by cells were determined
using a mouse TNF-α immunoassay system (R&D Systems,
Minneapolis, MN, U.S.A.) as described previously.
15,17)
Western Blotting To prepare whole cell lysates, BMMCs
(1×106 cells) were suspended in cold lysis buffer (20mM
HEPES [pH 7.9], 0.1% NP-40, 50mM NaCl, 1mM ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA), 1mM dithiothreitol, 10mM
Na3VO4, 10µg/mL phenylmethylsulfonyl fluoride, 10µg/mL
leupeptin, and 10% glycerol) and allowed to stand on ice for
30min.
15,17—19) The suspension was clarified by centrifugation
(15000rpm, 20min) at 4°C. Afterward, supernatants were solubilized
by treatment with Laemmli buffer (0.125 M Tris–HCl
[pH 6.8], 10% 2-mercaptoethanol, 4% sodium dodecyl sulfate
(SDS), 10% sucrose, and 0.004% bromophenol blue) for 3min
at 100°C. Prepared proteins were separated by electrophoresis
on an SDS-polyacrylamide gel. Electrophoresed proteins were
transferred to a polyvinylidene fluoride membrane with an
electroblotter. After blocking with 0.5% casein, membranes
were probed with rabbit anti-phospho-Akt (Thr308) antibody
(C31E5; 1:1000 dilution), rabbit anti-phospho-Akt (Ser473)
antibody (D9E; 1:1000 dilution), rabbit anti-Akt antibody
(C67E7; 1 :1000 dilution), rabbit anti-phospho-glycogen synthase
kinase 3β (GSK3β) (Ser9) antibody (5B3; 1:1000 dilution),
rabbit anti-phospho-extracellular signal-regulated kinase
(ERK)1/2 (Thr202/Tyr204) antibody (D13.14.4E; 1 : 1000
dilution), (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, U.S.A.),
or mouse anti-β-actin antibody (1:4000 dilution) (SigmaAldrich)
and treated with 1:1000 dilution horseradish peroxidase
(HRP
mixture of pure kefiran and L. kefiranofaciens bacteria cultured
in rice medium.
7) Rice kefiran is a powder of dried culture
filtrate containing 0.5 or 15% kefiran [kefiran and concentrated
kefiran (c-kefiran), respectively], which is produced in a
hydrolyzed rice medium by L. kefiranofaciens. The repeating
structure of kefiran is shown in Fig. 1.
4) When mast cells
were cultured overnight in the presence of kefiran or c-kefiran
(0—5mg/mL), >90% of mast cells were confirmed to be viable
and morphologically normal by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT) assay and
trypan blue exclusion test. In the experiment, mast cells were
pretreated with kefiran or c-kefiran by standing for 30min in
the medium at 37°C and then stimulated with antigen in the
presence of kefiran. In degrading kefiran, kefiran and c-kefiran
(10mg/mL) were heated at 100°C in 2.5 M trifluoroacetic acid
(TFA) for 2, 4, and 6 h, because the mono- and oligo-saccharides
were detected by a thin-layer chromatography after the
treatment for 6h in a preliminary result. The TFA-treated
kefiran and c-kefiran were dried with nitrogen gas under reduced
pressure to remove the solvent and resuspended at 3mg/
mL in the medium and N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N′-2-
ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (10mM HEPES [pH 7.4],
140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 0.6mM MgCl2, 0.1%
BSA, and 0.01% sulfinpyrazone).
[Ca2+]i Measurement BMMCs (5×105 cells) were loaded
with 1µM Fura 2-AM (Molecular Probes, Eugene, OR,
U.S.A.), sensitized with anti-DNP IgE for 30min at 37°C,
and then washed twice with HEPES buffer. Fluorescence intensities
at 500 nm using excitation wavelengths of 340 and
360nm were measured at 37°C, and the F340/F360 ratio was
calculated using a spectrofluorometer connected to a personal
computer (RF-5300PC; Shimadzu, Kyoto, Japan). Ratios were
converted to Ca2+ concentrations by a previously described
procedure.
15,17)
Degranulation Assay The degranulation of mast cells
was monitored by measuring the activity of granule-stored
enzyme β-hexosaminidase secreted into cell supernatants.
15)
BMMCs (5×105 cells) sensitized with anti-DNP IgE for 30min
at 37°C were washed twice with HEPES buffer. A BMMC
suspension (200µL) was incubated with DNP-BSA for 30min
at 37°C. In the case of RBL-2H3 cells, cells (5×104 cells/
well) plated in 24-well plate and cultured overnight were
sensitized with anti-DNP IgE for 30min at 37°C and washed
twice with HEPES buffer.
17) Aliquots of mast cell supernatants
(BMMCs and RBL-2H3 cells) were transferred to a 96-well
plate (20µL/well) and incubated with 20µL of substrate solution
(2mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (SigmaAldrich,
St Louis, MO, U.S.A.) in 100mM citrate [pH 4.5])
for 1h at 37°C. After terminating the reaction with 160µL of
167mM Na2CO3–NaHCO3 buffer, the absorbance at 405nm
was measured using a microplate reader (Model 680; Bio-Rad
Laboratories, Tokyo, Japan). The release activity relative to
the total β-hexosaminidase content of cells was determined by
disrupting the cells with 0.1% Triton X-100.
Assays for Cytokine Production BMMCs (5×105
cells) sensitized with anti-DNP IgE for 30min at 37°C were
washed twice with HEPES buffer and then stimulated with
DNP-BSA for 3h at 37°C. Supernatants were collected and
absolute amounts of TNF-α released by cells were determined
using a mouse TNF-α immunoassay system (R&D Systems,
Minneapolis, MN, U.S.A.) as described previously.
15,17)
Western Blotting To prepare whole cell lysates, BMMCs
(1×106 cells) were suspended in cold lysis buffer (20mM
HEPES [pH 7.9], 0.1% NP-40, 50mM NaCl, 1mM ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA), 1mM dithiothreitol, 10mM
Na3VO4, 10µg/mL phenylmethylsulfonyl fluoride, 10µg/mL
leupeptin, and 10% glycerol) and allowed to stand on ice for
30min.
15,17—19) The suspension was clarified by centrifugation
(15000rpm, 20min) at 4°C. Afterward, supernatants were solubilized
by treatment with Laemmli buffer (0.125 M Tris–HCl
[pH 6.8], 10% 2-mercaptoethanol, 4% sodium dodecyl sulfate
(SDS), 10% sucrose, and 0.004% bromophenol blue) for 3min
at 100°C. Prepared proteins were separated by electrophoresis
on an SDS-polyacrylamide gel. Electrophoresed proteins were
transferred to a polyvinylidene fluoride membrane with an
electroblotter. After blocking with 0.5% casein, membranes
were probed with rabbit anti-phospho-Akt (Thr308) antibody
(C31E5; 1:1000 dilution), rabbit anti-phospho-Akt (Ser473)
antibody (D9E; 1:1000 dilution), rabbit anti-Akt antibody
(C67E7; 1 :1000 dilution), rabbit anti-phospho-glycogen synthase
kinase 3β (GSK3β) (Ser9) antibody (5B3; 1:1000 dilution),
rabbit anti-phospho-extracellular signal-regulated kinase
(ERK)1/2 (Thr202/Tyr204) antibody (D13.14.4E; 1 : 1000
dilution), (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, U.S.A.),
or mouse anti-β-actin antibody (1:4000 dilution) (SigmaAldrich)
and treated with 1:1000 dilution horseradish peroxidase
(HRP
0/5000
ยา Co., Ltd. (โตเกียว ญี่ปุ่น), ระบุที่ผ่านการฆ่าเชื้อส่วนผสมของ kefiran บริสุทธิ์และ L. kefiranofaciens แบคทีเรียที่เพาะเลี้ยงในข้าว7) kefiran ข้าวเป็นผงแห้งวัฒนธรรมระบบการกรองที่ประกอบด้วย 0.5 หรือ 15% kefiran [kefiran และเข้มข้นkefiran (c-kefiran), ตามลำดับ], ซึ่งมีผลิตในการhydrolyzed ข้าวปานกลาง โดย L. kefiranofaciens การทำซ้ำโครงสร้างของ kefiran จะแสดงในรูปที่ 14) เมื่อเซลล์เสาถูกเพาะเลี้ยงค้างคืนใน kefiran หรือ c kefiran(0 – 5mg/mL), > 90% ของเซลล์เสาได้รับการยืนยันจะทำงานได้และปกติ morphologically โดยการ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumทดสอบโบรไมด์ (MTT) และการทดสอบยกเว้นสี trypan ในการทดลอง เสาเซลล์ได้pretreated kefiran หรือ c kefiran โดยยืน 30 นาทีในปานกลางที่ 37° C และกระตุ้นแล้วกับ antigen ในการสถานะการออนไลน์ของ kefiran ในลด kefiran, kefiran และ c kefiran(10mg/mL) ถูกทำให้ร้อนที่อุณหภูมิ 100° C ในกรด trifluoroacetic 2.5 M(TFA) สำหรับ 2, 4 และ 6 ชม. เนื่องจากการโมโน - และสารโอลิโก-saccharidesพบ โดย chromatography ชั้นบางหลังการการรักษาสำหรับ 6h ผลลัพธ์เบื้องต้น ถือว่า TFAkefiran และ c kefiran ถูกอบ ด้วยแก๊สไนโตรเจนลดลงต่ำกว่าดันเอาตัวทำละลาย และ resuspended ที่ 3 มิลลิกรัม /มล.ในกลางและ N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N′-2 -บัฟเฟอร์กรด (HEPES) ethanesulfonic (10mM HEPES [ค่า pH 7.4],140 มม. NaCl, KCl 5mM, 1mM CaCl2, MgCl2 0.6 มม. 0.1%บีเอสเอ และ 0.01% sulfinpyrazone)[Ca2 +] วัด BMMCs (5 × 105 เซลล์) เพิ่งโหลดกับ 1µM Fura 2-AM (Probes โมเลกุล Eugene, ORสหรัฐอเมริกา), ครีมกับ IgE DNP ป้องกัน 30 นาทีที่ 37 ° Cแล้ว ซักสองครั้ง ด้วย HEPES บัฟเฟอร์ ปลดปล่อยสารเรืองแสงที่ 500 ใช้ไฟฟ้าความยาวคลื่น 340 nm และ360nm ที่วัดที่ 37° C และอัตราส่วน F340/F360คำนวณโดยใช้ spectrofluorometer ที่เชื่อมต่อกับส่วนตัวคอมพิวเตอร์ (RF-5300PC Shimadzu เกียวโต ญี่ปุ่น) อัตราถูกแปลงเป็น Ca2 + เข้มข้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ขั้นตอนการ15,17)ทดสอบ degranulation degranulation เสาเซลล์ถูกตรวจสอบ โดยการวัดการเก็บเม็ดเอนไซม์β-hexosaminidase หลั่งเข้าไปในเซลล์ supernatants15)BMMCs (5 × 105 เซลล์) ครีมกับ IgE DNP ป้องกันสำหรับ 30 นาทีที่ 37° C ถูกล้างสองครั้ง ด้วย HEPES บัฟเฟอร์ BMMC การช่วงล่าง (200µL) ก็ได้รับการกกกับบีเอสเอ DNP 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ในกรณีของ RBL - 2 H 3 เซลล์ เซลล์ (5 × 104 เซลล์ /ดี) เคลือบจาน 24 ดี และเพาะเลี้ยงค้างคืนครีมกับ IgE DNP ป้องกัน 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37° C และล้างสอง ด้วย HEPES บัฟเฟอร์17) aliquots ของเซลล์เสา supernatants(BMMCs และ RBL - 2H 3 เซลล์) ถูกย้ายไป 96-ดีแผ่น (20µL ดี) และได้รับการกกกับ 20µL ของพื้นผิว(2 มม p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (SigmaAldrichSt Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ในซิเตรท 100 มม. [ค่า pH 4.5])สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หลังจากสิ้นสุดการทำปฏิกิริยากับ 160µL ของ167 มม. Na2CO3 – NaHCO3 บัฟเฟอร์ absorbance ที่ 405nmมีวัดโดยใช้เครื่องอ่าน microplate (รุ่น 680 ไบโอ-Radห้องปฏิบัติการ โตเกียว ญี่ปุ่น) ปล่อยกิจกรรมสัมพันธ์เพื่อกำหนดเนื้อหารวมβ-hexosaminidase ของเซลล์โดยรบกวนเซลล์ ด้วย 0.1% Triton X-100Assays สำหรับ BMMCs ผลิต Cytokine (5 × 105เซลล์) ครีมกับ IgE DNP ป้องกันสำหรับได้ 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 ° Cล้างสองครั้ง ด้วย HEPES บัฟเฟอร์ และถูกกระตุ้นด้วยแล้วบีเอสเอ DNP สำหรับ 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส Supernatants ถูกเก็บรวบรวม และกำหนดจำนวนที่แน่นอนของ TNF-αออก โดยเซลล์ใช้เมาส์ระบบ immunoassay TNF-α (R & D ระบบมินเนโพ MN สหรัฐอเมริกา) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้15,17)ตะวันตก blotting วิธีการเตรียมเซลล์ทั้งหมด lysates, BMMCs(1 × 106 เซลล์) ถูกหยุดชั่วคราวในบัฟเฟอร์ lysis เย็น (20 มม.HEPES [ค่า pH 7.9], 0.1% NP-40, 50 มม. NaCl, ethylenediaminetetraacetic มม.กรด (EDTA), dithiothreitol มม. 10 มม.Na3VO4, 10µg/mL phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ 10µg/mLleupeptin และ 10% กลีเซอรอล) และอนุญาตให้ยืนบนน้ำแข็ง30 นาที15,17 — 19) มีการชี้แจงการระงับ โดยการหมุนเหวี่ยง(15000 รอบต่อนาที 20 นาที) ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส หลังจากนั้น มี solubilized supernatantsโดยการรักษาด้วย Laemmli บัฟเฟอร์ (0.125 M ทริ – HCl2 10% [pH 6.8], -mercaptoethanol, dodecyl 4% โซเดียมซัลเฟต(SDS), ซูโครส 10% และ 0.004% bromophenol สีฟ้า) 3 นาทีที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เตรียมโปรตีนต้องแยกจากกัน โดยอิบนการ SDS polyacrylamide เจ มีโปรตีน electrophoresedโอนไปเยื่อฟลูออไรด์ polyvinylidene ด้วยการelectroblotter หลังจากบล็อกกับเคซีน 0.5% เยื่อหุ้มพิสูจน์ได้กับแอนติบอดี (Thr308) ป้องกัน-phospho-Akt กระต่าย(C31E5 เจือจาง 1: 1000), กระต่ายป้องกัน phospho Akt (Ser473)แอนติบอดี (D9E เจือจาง 1: 1000) แอนติบอดีต้าน Akt กระต่าย(C67E7 เจือจาง 1:1000), synthase กระต่ายป้องกัน phospho-ไกลโคเจน3β ไคเนส (GSK3β) (Ser9) แอนติบอดี (5B3 เจือจาง 1: 1000),ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณป้องกัน phospho สารกระต่าย(ERK) 1/2 (Thr202 Tyr204) แอนติบอดี (D13.14.4E; 1:1000เจือจาง), (เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์ เบเวอร์ลี่ MA สหรัฐอเมริกา),หรือเมาส์แอนติบอดีต้าน-β-แอกติน (ผสม 1:4000) (SigmaAldrich)รักษากับฮอสฮอร์สเจือจาง 1: 1000(HRP
การแปล กรุณารอสักครู่..
เภสัชกรรม จำกัด (โตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ชี้แนะฆ่าเชื้อ
ส่วนผสมของคีเฟอรันบริสุทธิ์และแอล kefiranofaciens แบคทีเรียที่เพาะเลี้ยง
ในอาหารข้าว.
7) คีเฟอรันข้าวเป็นผงของวัฒนธรรมแห้ง
กรองที่มี 0.5 หรือ 15% คีเฟอรัน [คีเฟอรันและเข้มข้น
คีเฟอรัน (C-คีเฟอรัน) ตามลำดับ] ซึ่งผลิตใน
กลางข้าวไฮโดรไลซ์โดย kefiranofaciens ลิตร ซ้ำ
โครงสร้างของคีเฟอรันแสดงในรูป 1.
4) เมื่อเซลล์
เพาะค้างคืนในการปรากฏตัวของคีเฟอรันหรือ C-คีเฟอรัน
(0-5mg / มิลลิลิตร)> 90% ของเซลล์ได้รับการยืนยันที่จะทำงานได้
ปกติและสัณฐานโดย 3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyltetrazolium
โบรไมด์ (MTT) การทดสอบและ
Trypan ทดสอบการยกเว้นสีฟ้า ในการทดสอบเซลล์ถูก
ปรับสภาพกับคีเฟอรันหรือ C-คีเฟอรันโดยยืนสำหรับ 30 นาทีใน
สื่อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสแล้วกระตุ้นด้วยแอนติเจนใน
การปรากฏตัวของคีเฟอรัน ในการย่อยสลายคีเฟอรัน, คีเฟอรันและ C-คีเฟอรัน
(10mg / มิลลิลิตร) ถูกความร้อนที่ 100 องศาเซลเซียส 2.5 ล้านกรด TRIFLUOROACETIC
(TFA) สำหรับ 2, 4 และ 6 ชั่วโมงเพราะขาวดำและ Oligo นํ้าตาล
ถูกตรวจพบโดยบาง โครมาโต -layer หลังจาก
การรักษา 6H ในผลเบื้องต้น TFA ได้รับการรักษา
คีเฟอรันและ C-คีเฟอรันแห้งด้วยก๊าซไนโตรเจนภายใต้การลด
ความกดดันที่จะเอาตัวทำละลายและ resuspended ที่ 3mg /
มิลลิลิตรในระดับปานกลางและ N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-
กรด ethanesulfonic (HEPES) บัฟเฟอร์ (10 mM HEPES [ค่า pH 7.4]
140mm โซเดียมคลอไรด์, 5mm KCl, 1mM CaCl2, 0.6mm MgCl2, 0.1%
BSA และ 0.01% sulfinpyrazone).
[Ca2 +] ฉันวัด BMMCs (5 × 105 เซลล์) ถูกโหลด
ด้วย1μM Fura 2 -AM (วัดระดับโมเลกุล, Eugene, OR,
USA) ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาทีที่ 37 ° C,
และล้างแล้วสองครั้งด้วย HEPES บัฟเฟอร์ ความเข้มของการเรืองแสง
ที่ 500 นาโนเมตรโดยใช้ความยาวคลื่นกระตุ้น 340 และ
360nm วัดที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและอัตราส่วน F340 / F360 ถูก
คำนวณโดยใช้ spectrofluorometer ที่เชื่อมต่อกับส่วนบุคคล
คอมพิวเตอร์ (RF-5300PC; Shimadzu เกียวโตญี่ปุ่น) อัตราส่วนที่ถูก
แปลงเป็น Ca2 + ความเข้มข้นโดยอธิบายไว้ก่อนหน้า
ขั้นตอน.
15,17)
degranulation Assay degranulation ของเซลล์
ได้รับการตรวจสอบโดยการวัดการทำงานของเม็ดที่เก็บไว้
เอนไซม์β-hexosaminidase หลั่งเข้าไปในเซลล์ supernatants.
15)
BMMCs (5 × 105 เซลล์ ) ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาที
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นครั้งที่สองถูกล้างด้วย HEPES บัฟเฟอร์ BMMC
ระงับ (200μL) ถูกบ่มกับ DNP-BSA สำหรับ 30 นาที
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ในกรณีของเซลล์ RBL-2H3 เซลล์ (5 × 104 เซลล์ /
ดี) ชุบ 24 หลุมจานและเพาะเลี้ยงในชั่วข้ามคืนถูก
ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและล้าง
สองครั้งด้วย HEPES บัฟเฟอร์.
17) aliquots ของ supernatants เสาเซลล์
(BMMCs และเซลล์ RBL-2H3) ถูกย้ายไป 96 หลุม
แผ่น (20μL / ดี) และบ่มกับ20μLของการแก้ปัญหาสารตั้งต้น
(2mm P-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (SigmaAldrich,
St Louis, MO, USA) ใน 100 มมซิเตรต [ค่า pH 4.5])
สำหรับ 1H ที่ 37 ° C หลังจากยุติการเกิดปฏิกิริยากับ160μLของ
167mm Na2CO3-NaHCO3 บัฟเฟอร์การดูดกลืนแสงที่ 405nm
วัดโดยใช้โปรแกรมอ่าน microplate A (รุ่น 680; Bio-Rad
ห้องปฏิบัติการ, Tokyo, ญี่ปุ่น) กิจกรรมการเปิดตัวเมื่อเทียบกับ
เนื้อหาβ-hexosaminidase รวมของเซลล์ถูกกำหนดโดย
กระทบกับเซลล์ที่มี 0.1% Triton X-100.
ตรวจสำหรับไซโตไคน์ผลิต BMMCs (5 × 105
เซลล์) ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ได้รับการ
ล้างครั้งที่สองด้วย HEPES บัฟเฟอร์แล้วกระตุ้นด้วย
DNP-BSA สำหรับ 3H ที่ 37 ° C supernatants ถูกเก็บรวบรวมและ
จำนวนเงินที่แน่นอนของ TNF-αปล่อยออกมาจากเซลล์ที่ได้รับการพิจารณา
โดยใช้ระบบเมาส์ TNF-α immunoassay (R & D Systems,
Minneapolis, MN, USA) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้.
15,17)
Western blotting เพื่อเตรียมความพร้อม lysates เซลล์ทั้ง BMMCs
(1 × 106 เซลล์) ถูกระงับในบัฟเฟอร์สลายเย็น (20mm
HEPES [ค่า pH 7.9], 0.1% NP-40, 50mm โซเดียมคลอไรด์, 1mM Ethylenediaminetetraacetic
Acid (EDTA) dithiothreitol 1mM, 10 mM
Na3VO4, 10μg / mL phenylmethylsulfonyl ฟลูออไร10μg / มล
leupeptin และ 10% กลีเซอรอล) และได้รับอนุญาตให้ยืนอยู่บนน้ำแข็ง
30min.
15,17-19) ระงับก็ชัดเจนโดยการหมุนเหวี่ยง
(15000rpm, 20min) ที่ 4 ° C หลังจากนั้น supernatants จะมีการละลาย
โดยการรักษาด้วย Laemmli บัฟเฟอร์ (0.125 M Tris-HCl
[ค่า pH 6.8], 10% 2-mercaptoethanol, 4% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต
(SDS), 10% ซูโครสและ 0.004% bromophenol สีน้ำเงิน) สำหรับ 3 นาที
ที่ 100 ° C โปรตีนที่เตรียมไว้ถูกแยกจากกันโดย electrophoresis
บนเจล SDS-polyacrylamide โปรตีน Electrophoresed ถูก
โอนไปยังเมมเบรนฟลูออไร Polyvinylidene กับ
electroblotter หลังจากที่ปิดกั้นด้วย 0.5% เคซีนเยื่อ
ถูกตรวจสอบกับกระต่ายป้องกัน phospho-สิ้นคิด (Thr308) แอนติบอดี
(C31E5; 1: 1,000 เจือจาง) กระต่ายป้องกัน phospho-สิ้นคิด (Ser473)
แอนติบอดี (D9E; 1: 1,000 เจือจาง) กระต่าย แอนติบอดีต่อต้านสิ้นคิด
(C67E7; 1: 1,000 เจือจาง) กระต่ายป้องกัน phospho-ไกลโคเจนเทส
ไคเนส3β (GSK3β) (Ser9) แอนติบอดี (5B3; 1: 1,000 เจือจาง)
กระต่ายป้องกัน phospho-extracellular สัญญาณควบคุมไคเนส
(ERK ) 1/2 (Thr202 / Tyr204) แอนติบอดี (D13.14.4E; 1: 1,000
เจือจาง), (มือถือสัญญาณเทคโนโลยี Beverly, MA, USA)
หรือเมาส์ต่อต้านβ-โปรตีนแอนติบอดี (1: 4000 เจือจาง) (SigmaAldrich )
และรับการรักษาด้วย 1: 1,000 เจือจางมะรุม peroxidase
(HRP
ส่วนผสมของคีเฟอรันบริสุทธิ์และแอล kefiranofaciens แบคทีเรียที่เพาะเลี้ยง
ในอาหารข้าว.
7) คีเฟอรันข้าวเป็นผงของวัฒนธรรมแห้ง
กรองที่มี 0.5 หรือ 15% คีเฟอรัน [คีเฟอรันและเข้มข้น
คีเฟอรัน (C-คีเฟอรัน) ตามลำดับ] ซึ่งผลิตใน
กลางข้าวไฮโดรไลซ์โดย kefiranofaciens ลิตร ซ้ำ
โครงสร้างของคีเฟอรันแสดงในรูป 1.
4) เมื่อเซลล์
เพาะค้างคืนในการปรากฏตัวของคีเฟอรันหรือ C-คีเฟอรัน
(0-5mg / มิลลิลิตร)> 90% ของเซลล์ได้รับการยืนยันที่จะทำงานได้
ปกติและสัณฐานโดย 3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyltetrazolium
โบรไมด์ (MTT) การทดสอบและ
Trypan ทดสอบการยกเว้นสีฟ้า ในการทดสอบเซลล์ถูก
ปรับสภาพกับคีเฟอรันหรือ C-คีเฟอรันโดยยืนสำหรับ 30 นาทีใน
สื่อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสแล้วกระตุ้นด้วยแอนติเจนใน
การปรากฏตัวของคีเฟอรัน ในการย่อยสลายคีเฟอรัน, คีเฟอรันและ C-คีเฟอรัน
(10mg / มิลลิลิตร) ถูกความร้อนที่ 100 องศาเซลเซียส 2.5 ล้านกรด TRIFLUOROACETIC
(TFA) สำหรับ 2, 4 และ 6 ชั่วโมงเพราะขาวดำและ Oligo นํ้าตาล
ถูกตรวจพบโดยบาง โครมาโต -layer หลังจาก
การรักษา 6H ในผลเบื้องต้น TFA ได้รับการรักษา
คีเฟอรันและ C-คีเฟอรันแห้งด้วยก๊าซไนโตรเจนภายใต้การลด
ความกดดันที่จะเอาตัวทำละลายและ resuspended ที่ 3mg /
มิลลิลิตรในระดับปานกลางและ N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N'-2-
กรด ethanesulfonic (HEPES) บัฟเฟอร์ (10 mM HEPES [ค่า pH 7.4]
140mm โซเดียมคลอไรด์, 5mm KCl, 1mM CaCl2, 0.6mm MgCl2, 0.1%
BSA และ 0.01% sulfinpyrazone).
[Ca2 +] ฉันวัด BMMCs (5 × 105 เซลล์) ถูกโหลด
ด้วย1μM Fura 2 -AM (วัดระดับโมเลกุล, Eugene, OR,
USA) ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาทีที่ 37 ° C,
และล้างแล้วสองครั้งด้วย HEPES บัฟเฟอร์ ความเข้มของการเรืองแสง
ที่ 500 นาโนเมตรโดยใช้ความยาวคลื่นกระตุ้น 340 และ
360nm วัดที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและอัตราส่วน F340 / F360 ถูก
คำนวณโดยใช้ spectrofluorometer ที่เชื่อมต่อกับส่วนบุคคล
คอมพิวเตอร์ (RF-5300PC; Shimadzu เกียวโตญี่ปุ่น) อัตราส่วนที่ถูก
แปลงเป็น Ca2 + ความเข้มข้นโดยอธิบายไว้ก่อนหน้า
ขั้นตอน.
15,17)
degranulation Assay degranulation ของเซลล์
ได้รับการตรวจสอบโดยการวัดการทำงานของเม็ดที่เก็บไว้
เอนไซม์β-hexosaminidase หลั่งเข้าไปในเซลล์ supernatants.
15)
BMMCs (5 × 105 เซลล์ ) ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาที
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นครั้งที่สองถูกล้างด้วย HEPES บัฟเฟอร์ BMMC
ระงับ (200μL) ถูกบ่มกับ DNP-BSA สำหรับ 30 นาที
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ในกรณีของเซลล์ RBL-2H3 เซลล์ (5 × 104 เซลล์ /
ดี) ชุบ 24 หลุมจานและเพาะเลี้ยงในชั่วข้ามคืนถูก
ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและล้าง
สองครั้งด้วย HEPES บัฟเฟอร์.
17) aliquots ของ supernatants เสาเซลล์
(BMMCs และเซลล์ RBL-2H3) ถูกย้ายไป 96 หลุม
แผ่น (20μL / ดี) และบ่มกับ20μLของการแก้ปัญหาสารตั้งต้น
(2mm P-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (SigmaAldrich,
St Louis, MO, USA) ใน 100 มมซิเตรต [ค่า pH 4.5])
สำหรับ 1H ที่ 37 ° C หลังจากยุติการเกิดปฏิกิริยากับ160μLของ
167mm Na2CO3-NaHCO3 บัฟเฟอร์การดูดกลืนแสงที่ 405nm
วัดโดยใช้โปรแกรมอ่าน microplate A (รุ่น 680; Bio-Rad
ห้องปฏิบัติการ, Tokyo, ญี่ปุ่น) กิจกรรมการเปิดตัวเมื่อเทียบกับ
เนื้อหาβ-hexosaminidase รวมของเซลล์ถูกกำหนดโดย
กระทบกับเซลล์ที่มี 0.1% Triton X-100.
ตรวจสำหรับไซโตไคน์ผลิต BMMCs (5 × 105
เซลล์) ไวกับการป้องกัน DNP IgE สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ได้รับการ
ล้างครั้งที่สองด้วย HEPES บัฟเฟอร์แล้วกระตุ้นด้วย
DNP-BSA สำหรับ 3H ที่ 37 ° C supernatants ถูกเก็บรวบรวมและ
จำนวนเงินที่แน่นอนของ TNF-αปล่อยออกมาจากเซลล์ที่ได้รับการพิจารณา
โดยใช้ระบบเมาส์ TNF-α immunoassay (R & D Systems,
Minneapolis, MN, USA) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้.
15,17)
Western blotting เพื่อเตรียมความพร้อม lysates เซลล์ทั้ง BMMCs
(1 × 106 เซลล์) ถูกระงับในบัฟเฟอร์สลายเย็น (20mm
HEPES [ค่า pH 7.9], 0.1% NP-40, 50mm โซเดียมคลอไรด์, 1mM Ethylenediaminetetraacetic
Acid (EDTA) dithiothreitol 1mM, 10 mM
Na3VO4, 10μg / mL phenylmethylsulfonyl ฟลูออไร10μg / มล
leupeptin และ 10% กลีเซอรอล) และได้รับอนุญาตให้ยืนอยู่บนน้ำแข็ง
30min.
15,17-19) ระงับก็ชัดเจนโดยการหมุนเหวี่ยง
(15000rpm, 20min) ที่ 4 ° C หลังจากนั้น supernatants จะมีการละลาย
โดยการรักษาด้วย Laemmli บัฟเฟอร์ (0.125 M Tris-HCl
[ค่า pH 6.8], 10% 2-mercaptoethanol, 4% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต
(SDS), 10% ซูโครสและ 0.004% bromophenol สีน้ำเงิน) สำหรับ 3 นาที
ที่ 100 ° C โปรตีนที่เตรียมไว้ถูกแยกจากกันโดย electrophoresis
บนเจล SDS-polyacrylamide โปรตีน Electrophoresed ถูก
โอนไปยังเมมเบรนฟลูออไร Polyvinylidene กับ
electroblotter หลังจากที่ปิดกั้นด้วย 0.5% เคซีนเยื่อ
ถูกตรวจสอบกับกระต่ายป้องกัน phospho-สิ้นคิด (Thr308) แอนติบอดี
(C31E5; 1: 1,000 เจือจาง) กระต่ายป้องกัน phospho-สิ้นคิด (Ser473)
แอนติบอดี (D9E; 1: 1,000 เจือจาง) กระต่าย แอนติบอดีต่อต้านสิ้นคิด
(C67E7; 1: 1,000 เจือจาง) กระต่ายป้องกัน phospho-ไกลโคเจนเทส
ไคเนส3β (GSK3β) (Ser9) แอนติบอดี (5B3; 1: 1,000 เจือจาง)
กระต่ายป้องกัน phospho-extracellular สัญญาณควบคุมไคเนส
(ERK ) 1/2 (Thr202 / Tyr204) แอนติบอดี (D13.14.4E; 1: 1,000
เจือจาง), (มือถือสัญญาณเทคโนโลยี Beverly, MA, USA)
หรือเมาส์ต่อต้านβ-โปรตีนแอนติบอดี (1: 4000 เจือจาง) (SigmaAldrich )
และรับการรักษาด้วย 1: 1,000 เจือจางมะรุม peroxidase
(HRP
การแปล กรุณารอสักครู่..
เภสัชกรรม Co . , Ltd . ( โตเกียว , ญี่ปุ่น ) กล่าวคือ ฆ่าเชื้อส่วนผสมของบริสุทธิ์ และ แบคทีเรีย kefiranofaciens คีเฟอแรนในข้าวขนาดกลาง7 ) ข้าวคีเฟอแรน เป็น ผงแห้งของวัฒนธรรมกรองที่มี 0.5 หรือ 15% คีเฟอแรน [ คีเฟอแรน และเข้มข้นคีเฟอแรน ( c-kefiran ) ตามลำดับ ] ซึ่งผลิตในน้ำนมข้าวขนาดกลางโดย kefiranofaciens . การทำซ้ำโครงสร้างของคีเฟอแรนจะแสดงในรูปที่ 14 ) เมื่อเสาเซลล์เพาะเลี้ยงค้างคืนในการแสดงตนของคีเฟอแรน หรือ c-kefiran( 0-5mg / ml ) > 90% ของเสาเซลล์ได้รับการยืนยันได้และ จากปกติ โดย 3 - ( 4,5-dimethylthiazol-2-yl ) - 2,5-diphenyltetrazoliumโบรไมด์ ( MTT ) และการทดสอบไตรแพนสีฟ้าไปทดสอบ ในการทดลองเสาเซลล์คือที่ได้รับกับคีเฟอแรน หรือ c-kefiran โดยยืนอยู่ใน 30 นาทีสื่อที่ 37 ° C แล้วกระตุ้นด้วยแอนติเจนในการปรากฏตัวของคีเฟอแรน . ในการย่อยสลายคีเฟอแรน และ c-kefiran คีเฟอแรน ,( 10 mg / ml ) จำนวน 100 ° C อุณหภูมิใน 2.5 M กรดไตรฟลูออโรอะซิติก( ระดับ ) 2 , 4 , และ 6 ชั่วโมง เพราะโมโน - และโอลิโกแซ็กคาร์ไรด์ถูกตรวจพบโดยเทคนิค TLC พบว่าหลังจากการรักษาสำหรับ 6H ในผลเบื้องต้น ในระดับปฏิบัติและคีเฟอแรน c-kefiran แห้งด้วยไนโตรเจนก๊าซใต้ลดลงดันเอาตัวทำละลายและ resuspended ที่ 3mg /มิลลิลิตรในกลางและ N - ( 2-hydroxyethyl ) piperazine-n ได้รับ - 2ethanesulfonic acid ( ฮีเปส ) บัฟเฟอร์ ( 10mm ฮีเปส [ pH 7.4 ]140 มม. ขนาด 5mm , KCl 1mm CaCl2 0.6mm ไอโซโทป , 0.1% ,บีเอสเอ และ 0.01 % ซัลฟินไพราโซน )แคลเซียม + [ ] ผมวัด bmmcs ( 5 × 105 เซลล์ ) โหลด1 µ M ฟูรา 2-am ( โมเลกุลโพรบ ยูจีน หรือสหรัฐอเมริกา ) และ IgE ป้องกันสำหรับ 30 นาทีที่ 37 ° C ร่วม ,แล้วล้างสองครั้งกับฮีเปสบัฟเฟอร์ ความเข้มของการเรืองแสงที่ความยาวคลื่น 340 500 nm โดยกระตุ้นและ360nm จำนวน 37 ° C และอัตรา f340 / f360 คือคำนวณโดยใช้ spectrofluorometer เชื่อมต่อกับบุคคลคอมพิวเตอร์ ( rf-5300pc ; Shimadzu , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) อัตราส่วนคือแปลงปริมาณแคลเซียม + โดยอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ขั้นตอน15,17 )ข้อมูลทางสังคมในการข้อมูลทางสังคมของเสาเซลล์ถูกตรวจสอบโดยการวัดกิจกรรมของเม็ดเก็บไว้เอนไซม์บีตา - hexosaminidase หลั่งเข้าไปในเซลล์ supernatants .15 )bmmcs ( 5 × 105 เซลล์ ) และ IgE anti DNP สำหรับ 30 นาทีที่ 37 ° C ถูกล้างสองครั้งกับฮีเปสบัฟเฟอร์ เป็น bmmcระงับ ( 200 µ L ) ถูกบ่มกับ dnp-bsa สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศา ในกรณีของ rbl-2h3 เซลล์ , เซลล์ ( 5 × 104 / เซลล์ดี ) ชุบในจานเพาะเลี้ยงค้างคืนเป็น 24 ดีและต่อต้าน DNP สำหรับ 30 นาทีที่ 37 IgE ° C และล้างสองครั้งกับฮีเปสบัฟเฟอร์17 ) เฉยๆของแมสต์เซลล์ supernatants( bmmcs และ rbl-2h3 เซลล์ ) ถูกย้ายไปเป็น 96 ดีแผ่น ( 20 µ L / ) โดย 20 µลิตร ( โซลูชั่น( 2mm p-nitrophenyl-n-acetyl - บีตา - ( sigmaaldrich d-glucosaminide ,เซนต์ หลุยส์ โม , สหรัฐอเมริกา ) , ซิ [ pH ] )สำหรับ 1 ที่ 37 องศา หลังจากยุติปฏิกิริยากับ 160 µล.167mm Na2CO3 ) โซเดียมไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ ที่ 405nm นการวัดพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่านรุ่น 680 ; ไบแร็ดห้องปฏิบัติการ , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ปล่อยกิจกรรมสัมพัทธ์รวม hexosaminidase บีตา - เนื้อหาของเซลล์ที่ถูกกำหนดโดยรบกวนเซลล์ 0.1% Triton X-100 .ใช้สำหรับ bmmcs การผลิตไซโตไคน์ ( 5 × 105เซลล์ ) และ IgE ป้องกันสำหรับ 30 นาทีที่ 37 ° C ร่วมคือล้างสองครั้งกับฮีเปส บัฟเฟอร์แล้วกระตุ้นด้วยdnp-bsa สำหรับ 3 ที่ 37 องศา และ supernatants ศึกษาแน่นอนปริมาณของเม็ดเลือดขาวในเซลล์ถูกαที่ออกโดยใช้เมาส์ TNF - ระบบทางα ( ระบบ R & D ,Minneapolis , MN , USA ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้15,17 )Western blotting เพื่อเตรียม lysates bmmcs เซลล์ทั้งหมด( 1 × 106 เซลล์ ) ถูกระงับในบัฟเฟอร์การสลายเย็น ( ขนาด 20 มม.ฮีเปส [ 9 ] pH 0.1 np-40 50mm NaCl 1mm บอนacid ( EDTA ) , 1mm บัตรแข็ง 10mm ,na3vo4 10 µ g / ml phenylmethylsulfonyl ฟลูออไรด์ 10 µกรัม / มิลลิลิตรลูเพปตินและ 10% กลีเซอรอล ) และอนุญาตให้ยืนบนน้ำแข็งสำหรับ30 นาที15,17-19 ) ระงับได้ชี้แจง โดยการปั่นเหวี่ยง( 15000 rpm 20 นาที , ) ที่ 4 องศา หลังจากนั้น supernatants ถูกสร้างโดยการรักษาด้วย laemmli บัฟเฟอร์ ( 0.125 เมตรทั้งนี้ – กรดเกลือ[ pH 6.8 ] 10% อย่างเดียว 4 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต( SDS ) 10% sucrose และ 0.004 % ) สำหรับ 3min โบรโมฟีนอลบลูที่ 100 องศา C เตรียมแยกโปรตีนโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสบน SDS polyacrylamide gel electrophoresed โปรตีนคือย้ายไปยังีนฟลูออไรด์ด้วยเมมเบรนelectroblotter . หลังจากการปิดกั้น 0.5 เคซีน , เมมเบรนกำลังตรวจสอบ akt phospho กระต่าย ( thr308 ) แอนติบอดีต่อต้าน( c31e5 ; 000 เจือจาง ) , กระต่าย ( ser473 ) phospho akt ป้องกันแอนติบอดี ( d9e ; 000 เจือจาง ) แอนติบอดีต่อต้าน akt , กระต่าย( c67e7 ; 1 : 1000 ( ) , กระต่าย และต่อต้าน phospho ไกลโคเจนไคเนส 3 บีตา ( gsk3 บีตา ) ( ser9 ) แอนติบอดี ( 5b3 ; 000 เจือจาง )กระต่าย phospho สัญญาณควบคุมและป้องกัน ไคเนส( กา ��� ) 1 / 2 ( thr202 / tyr204 ) แอนติบอดี ( d13.14.4e ; 1 : 1000( 2 ) สัญญาณมือถือเทคโนโลยี , เบเวอร์ลี , MA , USA )หรือเมาส์ actin แอนติบอดีต่อต้าน - บีตา - ( 1:4000 เจือจาง ) ( sigmaaldrich )และรักษาด้วย 000 เจือจาง .
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- The increase ofthe inlet temperature of
- Healthier
- พันธุ์บอร์ผสมพื้นเมือง
- I would like to be more likely close to
- “The Lady in the Looking-Glass,” by Virg
- ta i ngra le dao
- ระเบียง
- ฉันส่งกวางตัวใหม่ไป
- Position of filgh
- พริกขี้หนูผสม
- Go back to your room and turn on the ac
- สมน้ำหน้า
- Position of filgh
- Sbah lkhirYou are bad girlWhay you don't
- มองเห็นช่องว่างยังไม่ชัดเจนเพียงพอ
- You can read my message. .I said I go ho
- ช่วยให้การศึกษามีคุณภาพ
- กำลังวิ่งเล่น
- ข้อเสนอเชิงนโยบายในการแก้ปัญหาการขาดแคลน
- เป็นช่างภาพ ถ่ายภาพงานและกิจกรรมต่างๆของ
- Healthier
- RELEVANT SKILLS
- 21 EXTRAORDINARY HEROES: Choose your her
- หากฉันได้เป็นนักเรียน
