2.4. DNA extraction and PCR amplifi

2.4. DNA extraction and PCR amplification
Microbial DNA was extracted from grass carp intestine samples
by using the Bacterial DNA Kit (50) (Omega, USA) following manufacturer's
instruction. For each sample, DNA was extracted in triplicate
to avoid bias, and the extracts from the same sample were
pooled [30]. Purity of DNA extractedwas verified by electrophoresis
on ethidium bromide staining 1% agarose gels, and concentration
was analyzed spectrophotometrically using the M200pro (TECAN,
Switzerland). The extracted DNAwas stored at 80 C until use. The
V4eV5 region of the bacteria 16S ribosomal RNA gene were
amplified by PCR (95 C for 2 min, followed by 25 cycles at 95 C for
30 s, 55 C for 30 s, and 72 C for 30 s and a final extension at 72 C
for 5 min). The primers used were 515F 50-barcode-
GTGCCAGCMGCCGCGG-30 and 907R 50-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-
30 , where barcode is an eight-base sequence unique to each sample.
PCR reactions were performed in triplicate 20 mL mixture containing
4 mLof5FastPfu Buffer, 2 mL of 2.5mMdNTPs, 0.8 mL of each primer
(5 mM), 0.4 mL of FastPfu Polymerase, and 10 ng of template DNA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. ดีเอ็นเอแยกและขยาย PCRจุลินทรีย์ดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างลำไส้ปลาสะนากหญ้าโดยแบคทีเรีย DNA ชุด (50) (โอเมก้า สหรัฐอเมริกา) ของผู้ผลิตต่อไปนี้คำแนะนำ สำหรับแต่ละอย่าง ดีเอ็นเอที่สกัดใน triplicateเพื่อหลีกเลี่ยงความโน้มเอียง และสารสกัดจากตัวอย่างเดียวกันได้รวม [30] ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ extractedwas โดย electrophoresisethidium โบรไมด์ย้อมสี 1% agarose เจ และความเข้มข้นได้วิเคราะห์โดยใช้การ M200pro spectrophotometrically (TECANสวิตเซอร์แลนด์) DNAwas แยกเก็บไว้ที่ 80 C จนใช้ ที่ภูมิภาค V4eV5 ของแบคทีเรีย 16S ribosomal อาร์เอ็นเอยีนได้ขยาย โดย PCR (C 95 ใน 2 นาที ตาม ด้วยรอบ 25 ที่ C 95 ในs, C 55 สำหรับ 30 30 s และ C 72 สำหรับ 30 s และนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 Cสำหรับ 5 นาที) ไพรเมอร์ที่ใช้ได้ 515F 50-บาร์โค้ด -GTGCCAGCMGCCGCGG-30 และ 907R 50-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT -30 ลำดับฐานแปดเฉพาะแต่ละอย่างบาร์โค้ดดำเนินใน triplicate 20 mL ประกอบด้วยส่วนผสมของปฏิกิริยา PCR4 mLof5 FastPfu บัฟเฟอร์ 2 mL ของ 2.5mMdNTPs, 0.8 mL แต่ละพื้นng (5 mM), 0.4 mL FastPfu พอลิเมอเรส และ 10 ของดีเอ็นเอต้นแบบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การสกัดดีเอ็นเอและขยาย PCR
จุลินทรีย์ถูกสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างลำไส้หญ้าปลาคาร์พโดยใช้ดีเอ็นเอแบคทีเรีย Kit (50) (โอเมก้า, USA) ผู้ผลิตต่อไปนี้การเรียนการสอน สำหรับแต่ละตัวอย่างดีเอ็นเอถูกสกัดในเพิ่มขึ้นสามเท่าที่จะหลีกเลี่ยงอคติและสารสกัดจากตัวอย่างเดียวกันถูกสำรอง[30] ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ extractedwas ตรวจสอบโดย electrophoresis ในการย้อมสี ethidium bromide 1% agarose เจลและความเข้มข้นของการวิเคราะห์spectrophotometrically ใช้ M200pro (TECAN, วิตเซอร์แลนด์) DNAwas แยกเก็บไว้ที่? 80? C จนถึงการใช้งาน ภูมิภาค V4eV5 ของแบคทีเรีย 16S ยีน RNA โซมอลถูกขยายโดยวิธี PCR (95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 25 รอบที่ 95? C เป็นเวลา 30 วินาที 55? C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 72? C เป็นเวลา 30 วินาทีและ ขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา5 นาที) ไพรเมอร์ที่ใช้คือ 515F 50 barcode- GTGCCAGCMGCCGCGG-30 และ 907R 50 CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 30 ที่บาร์โค้ดเป็นลำดับแปดฐานไม่ซ้ำกันในแต่ละตัวอย่าง. ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการเพิ่มขึ้นสามเท่าใน 20 มลส่วนผสมที่มี4 mLof5? FastPfu บัฟเฟอร์ 2 มิลลิลิตร 2.5mMdNTPs 0.8 มิลลิลิตรของแต่ละไพรเมอร์(5 มิลลิ) 0.4 มิลลิลิตร FastPfu โพลิเมอร์และ 10 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การสกัดดีเอ็นเอและยีน (
จุลินทรีย์ดีเอ็นเอจากตัวอย่างหญ้าปลาคาร์พไส้
โดยใช้ชุดดีเอ็นเอแบคทีเรีย ( 50 ) ( Omega , USA ) ตามคำสั่งของ
ผู้ผลิต สำหรับแต่ละตัวอย่างดีเอ็นเอทั้งสามใบ
เพื่อหลีกเลี่ยงอคติและสารสกัดจากตัวอย่างเดิม
รวม [ 30 ] ความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีส
extractedwas ตรวจสอบในคู่ bromide staining 1 % เจลโรส และสมาธิ
วิเคราะห์นี้ใช้ m200pro ( TECAN
, สวิตเซอร์แลนด์ ) สกัด dnawas เก็บไว้ที่  80  C จนใช้
v4ev5 ภูมิภาคของ 16S ไรโบโซมอล อาร์เอ็นเอของยีนแบคทีเรียถูก
โดยขยาย PCR ( 95  C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 25 รอบ 95  C
30 , 55  เป็นเวลา 30 วินาที กับ 72  C 30 และงานสุดท้ายที่ 72  C
เป็นเวลา 5 นาที ) ไพรเมอร์ใช้ 515f 50 บาร์โค้ด - และ -

gtgccagcmgccgcgg-30 907r 50-ccgtcaattcmtttragttt 30 ที่บาร์โค้ดเป็น 8 ลำดับฐานเฉพาะแต่ละตัวอย่าง .
ปฏิกิริยา PCR ได้ทั้งสามใบ 20 ml ผสมที่ประกอบด้วย
4 mlof5  fastpfu บัฟเฟอร์ , 2 ml ของ 2.5mmdntps 0.8 ml ของแต่ละสีรองพื้น
( 5 มม. ) , 0.4 มิลลิลิตร fastpfu polymerase และ 10 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ