2. Materials and methods2.1. Shrimp

2. Materials and methods
2.1. Shrimp
E. hepatopenaei (EHP)-infected Penaeus stylirostris were
collected from Brunei in 2006. EHP-infected P. vannamei were
collected in shrimp ponds from Vietnam in 2014 and 2015. A population
of P. vannamei was sent from Thailand to our laboratory at
University of Arizona in 2014 for a quarantine purpose, these
shrimp were later diagnosed with EHP infection by histology, their
hepatopancreas, feces and tank water were sampled for PCR
analyses.
To test the specificity of EHP in situ hybridization (ISH) and PCR
assays, samples of P. monodon showing clinical signs of cotton
shrimp disease were used, these shrimp were from Madagascar
in 2005 (fixed tissues) and 2006 (frozen tissues). P. vannamei
infected with an amoeba in the gill tissue, determined by histological
examination were also used, these were collected in 2014. For
PCR assays, hepatopancreas tissues or whole shrimp were preserved
in 95% ethanol or air dried and sent to our Lab; for ISH
assays, shrimp were fixed in Davidson’s AFA fixative.
2.2. DNA extraction
From the EHP-infected penaeid shrimp, the hepatopancreas was
removed and pooled (4–5 shrimp) into one sample. From tanks
holding EHP-infected shrimp, feces and water were sampled. The
tank water was concentrated 150 times with a Microsep Advance
Centrifugal Device (PALL Corporation) and used for DNA extraction.
Total DNA was extracted from each sample using a High-pure DNA
template preparation kit (Roche Bioscience) or a Maxwell-16 Cell
LEV DNA purification kit (Promega).
To test the specificity of EHP-primers, PCR assays were performed
with DNA templates from 2 parasitic diseases: (1) cotton
shrimp disease, P. monodon collected from Madagascar in 2006,
these shrimp showed a whitish muscle, their DNA were positive
for a Pleistophora-like microsporidium determined by small subunit
rRNA gene sequencing (Genbank No. KP825331); (2) ameoba
disease, these P. vannamei suffered substantial mortality and were
found, through histological examination, to be infected with
amoeba (species not determined).
To ensure the EHP-primers did not react to host genomes, DNA
templates were prepared from: (1) specific-pathogen-free (SPF)
P. vannamei (>10 samples) and P. monodon (3 samples) from
Hawaii, US; (2) Penaeus indicus (2 samples) from Saudi Arabia;
(3) P. stylirostris (2 samples) cultured in New Caledonia; (4)
Macrobrachium rosenbergii (2 samples) from the Philippines; (5)
crabs (7 samples, unknown species) collected in the vicinity of
shrimp ponds located in the Saudi Arabia; (6) polychaetes
(3 samples), Artemia biomass (9 samples), squid (2 samples), krill
(2 samples), these were sent from various commercial providers.
2.3. 18S rRNA gene PCR and cloning
For PCR assays, PuReTaq Ready-To-Go PCR beads (GE
Healthcare) were used. The primers for amplifying the 18S rRNA
gene are 18S-F (50-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA) and 18S-R
(50-TCTGAAATAGTGACGGGCGG). The PCR reaction contained
200 lM of each dNTP, 0.2 lM of each primer, 10 mM Tris–HCl
(pH 9.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2.5 U Taq DNA polymerase
and 1 ll of extracted DNA (10 ng to 100 ng ll1). The amplification
was performed with the following cycling parameters: initiation
denaturation at 94 C for 3 min, followed by 35 cycles of
94 C for 30s, 55C for 30s, and 72C for 1min, and a final
extension at 72 C for 5 min. Following PCR, PCR products were
analyzed in a 1.2% agarose gel containing ethidium bromide. A
band at 1 kb was excised and extracted for DNA, cloned into
the pGEM-T-Easy vector (Promega), and designated as clone
pEHP-1. Through DNA sequencing, the cloned insert was determined
to be 1146-bp (GenBank No. KP759285). The search for
the significant similarity with sequences in GenBank was performed
using BLAST at National Center for Biotechnology
Information (NCBI).
2.4. Probe labeling and in situ hybridization
The pEHP-1 plasmid DNA was used to generate a probe for ISH.
The gene probe was labeled with digoxigenin-11-dUTP (Roche) in a
PCR reaction as described by Mari et al. (1998). The primers used
for the labeling reaction were EHP-F (50-GGGAACGACGAACGGCTC
AG) and EHP-R1 (50-TGCCTTGATGAGACACTGTT) that generated a
1.1 kb fragment. Following PCR, the digoxigenin-labeled DNA
probe was precipitated with ethanol, re-suspended in water, and
stored at 20 C. The probe for cotton shrimp disease,
Pleistophora-like microsporidium, was generated from a cloned
16S RNA gene region.
The Davidson’s AFA fixed shrimp were processed, embedded in
paraffin, and sectioned (4 lm thick) in accordance with standard
methods (Lightner, 1996). After deparaffinization, hydration,
proteinase K digestion, and post-fixation, sections were overlaid
with 500 ll of hybridization solution (4  SSC, 50% formamide,
1  Denhardt’s solution, 5% dextran sulfate, 0.5 lg/ml salmon
sperm DNA) containing the EHP probe (0.2 lg/ml). Slides were
placed on a heated surface at 90 C for 10 min and hybridized overnight
at 42 C. Final detection was performed with
anti-digoxigenin antibody conjugated to alkaline phosphatase
(Roche) that was visualized using nitroblue tetrazolium and
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. กุ้งE. hepatopenaei (EHP) -ติดเชื้อกุ้งกุลา stylirostris ได้รวบรวมจากบรูไนในปี 2006 มี EHP ติดเชื้อ P. vannameiเก็บในบ่อกุ้งจากเวียดนามในปี 2014 และ 2015 ประชากรของ P. vannamei ถูกส่งจากไทยไปห้องปฏิบัติการของเราที่มหาวิทยาลัยแอริโซนาในปี 2557 สำหรับวัตถุประสงค์เฉพาะ เหล่านี้ภายหลังถูกวินิจฉัยติดเชื้อ EHP กุ้ง โดยมิญชวิทยา ของพวกเขาhepatopancreas อุจจาระ และถังน้ำถูกความสำหรับ PCRวิเคราะห์การทดสอบ specificity ของ EHP ซิ hybridization (อิชโบ) และ PCRassays ตัวอย่างของ P. monodon แสดงอาการทางคลินิกของฝ้ายโรคกุ้งเคย กุ้งเหล่านี้ได้จากมาดากัสการ์ในปี 2005 (เนื้อเยื่อถาวร) และ 2006 (เนื้อเยื่อแช่แข็ง) P. vannameiติดเชื้ออะมีบาที่ในเนื้อเยื่อเหงือก ตามสรีรวิทยานอกจากนี้ยังใช้ตรวจสอบ เหล่านี้ถูกเก็บรวบรวมในปี 2014 สำหรับรักษา PCR assays เนื้อเยื่อ hepatopancreas หรือกุ้งทั้งหมดใน 95% เอทานอลหรืออากาศแห้ง และส่งไปยังแล็บของเรา สำหรับอิชโบassays กุ้งได้ถาวรในตรึงของ Davidson AFA2.2. DNA สกัดจากกุ้งติดเชื้อ EHP penaeid, hepatopancreas ถูกเอาออก และทางถูกพู (กุ้ง 4-5) เป็นตัวอย่างหนึ่ง จากถังจับกุ้งที่ติดเชื้อ EHP อุจจาระและน้ำมีความ ที่ถังน้ำมีความเข้มข้น 150 เท่ากับล่วงหน้า Microsep เป็นอุปกรณ์แรงเหวี่ยง (แถบวาย คอร์ปอเรชั่น) และใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอดีเอ็นเอทั้งหมดถูกแยกจากแต่ละตัวอย่างโดยใช้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์สูงแม่เตรียมชุด (ซื้อ Roche) หรือเซลล์แมกซ์เวลล์-16ดีเอ็นเอลิฟเยฟอกชุด (Promega)การทดสอบ specificity ของ EHP-ไพรเมอร์ PCR assays ดำเนินกับดีเอ็นเอแม่แบบจากโรค 2 เสียงฟู่เหมือนกาฝาก: ฝ้าย (1)โรคกุ้ง P. monodon รวบรวมจากมาดากัสการ์ในปี 2006กุ้งเหล่านี้แสดงให้เห็นว่ากล้ามสี ดีเอ็นเอของพวกเขาได้บวกสำหรับ microsporidium Pleistophora เช่นที่กำหนด โดยย่อยขนาดเล็กลำดับยีน rRNA (หมายเลข Genbank KP825331); (2) ameobaโรค กุลา P. เหล่านี้ได้รับความเดือดร้อนพบการตายและพบ ผ่านการตรวจสรีรวิทยา ติดเชื้ออะมีบา (ชนิดไม่กำหนด)ให้ EHP-ไพรเมอร์ไม่ได้ไม่ตอบสนองการโฮสต์ genomes ดีเอ็นเอแม่แบบที่เตรียมจาก: (1) เฉพาะการศึกษาฟรี (SPF)P. vannamei (> 10 ตัวอย่าง) และ P. monodon (3 ตัวอย่าง) จากฮาวาย เรา (2) กุ้งกุลาหม้อ (2 อย่าง) จากซาอุดีอาระเบีย(3) P. stylirostris (ตัวอย่าง 2) อ่างในนิวแคลิโดเนีย (4)กุ้งก้ามกราม (ตัวอย่าง 2) จากฟิลิปปินส์ (5)ปู (7 ตัวอย่าง ไม่ทราบชนิด) ที่รวบรวมใน vicinity ของบ่อกุ้งอยู่ในซาอุดิอาระเบีย (6) polychaetes(3 ตัวอย่าง), อาร์ทีเมีย (9 ตัวอย่าง), ปลาหมึก (2 ตัวอย่าง), เคย(2 ตัวอย่าง), เหล่านี้ถูกส่งจากผู้ให้บริการเชิงพาณิชย์ต่าง ๆ2.3. ยีน rRNA 18S PCR และโคลนสำหรับ PCR assays, PCR พร้อม PuReTaq ไปลูกปัด (GEการดูแลสุขภาพ) ที่เคย ไพรเมอร์สำหรับมือ 18S rRNAยีนมี 18S-F (50-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA) และ 18S R(50-TCTGAAATAGTGACGGGCGG) ปฏิกิริยา PCR อยู่200 lM ละ dNTP, 0.2 lM แต่ละพื้น ตรี – HCl 10 มม.(pH 9.0), 50mM KCl, MgCl2, 1.5mM 2.5 U Taq DNA พอลิเมอเรสและ 1 จะแยกดีเอ็นเอ (10 ng ไป 100 ng จะ 1) ขยายการได้ดำเนินการกับพารามิเตอร์ต่อไปนี้ขี่จักรยาน: เริ่มต้นdenaturation ที่ 94 C สำหรับ 3 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของC 94 สำหรับ 30s, C 55 สำหรับ 30s และ 72 C 1 นาที และตัวสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 C สำหรับ 5 นาที ต่อ PCR ผลิตภัณฑ์ PCR ได้วิเคราะห์ในเจ 1.2% agarose ประกอบด้วยโบรไมด์ ethidium Aวงที่ 1 kb มี excised และสกัดสำหรับ DNA โคลนลงในเวกเตอร์ pGEM-T-ง่าย (Promega), และกำหนดให้เป็นโคลนpEHP-1 ผ่านการจัดลำดับของดีเอ็นเอ กำหนดแทรกโคลนจะ 1146-bp (หมายเลข GenBank KP759285) การค้นหาทำสำคัญคล้ายคลึงกับลำดับใน GenBankใช้ระเบิดที่ศูนย์แห่งชาติด้านเทคโนโลยีชีวภาพข้อมูล (NCBI)2.4 การติดฉลาก และใน situ hybridization โพรบดีเอ็นเอ pEHP 1 plasmid ถูกใช้เพื่อสร้างการโพรบสำหรับอิชโบโพรบยีนถูกติดป้าย digoxigenin-11-dUTP (Roche) ในการปฏิกิริยา PCR ตามที่อธิบายไว้โดยมารี et al. (1998) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับปฏิกิริยาการติดฉลากได้ EHP-F (50-GGGAACGACGAACGGCTCAG) และ EHP-R1 (50-TGCCTTGATGAGACACTGTT) ที่สร้างความส่วน 1.1 kb วิธี PCR ดีเอ็นเอที่ชื่อ digoxigeninโพรบถูกตกตะกอน ด้วยเอทานอล หยุดชั่วคราวอีกครั้งในน้ำ และเก็บที่ 20 เซลเซียส โพรบสำหรับฝ้ายโรคกุ้งเช่น Pleistophora microsporidium ถูกสร้างขึ้นจากการโคลนภูมิภาคยีน 16S อาร์เอ็นเอของ Davidson AFA กุ้งคงถูกดำเนินการ ในพาราฟิน และจัดแบ่งเป็นส่วน ๆ (4 lm หนา) ตามมาตรฐานวิธี (Lightner, 1996) หลังจาก deparaffinization ไล่น้ำมี overlaid proteinase K ย่อยอาหาร และหลังเบีมี 500 จะของโซลูชันการ hybridization (4 SSC, formamide 50%โซลูชั่น 1 Denhardt ซัลเฟต 5% เดกซ์แทรน ปลาแซลมอน lg/ml 0.5อสุจิที่ดีเอ็นเอ) ประกอบด้วยโพรบ EHP (0.2 lg/ml) ภาพนิ่งได้วางบนพื้นผิวที่อุ่นที่ 90 C สำหรับ 10 นาที และเป็นค้างคืนที่ 42 C. ทำตรวจสอบขั้นสุดท้ายด้วยแอนติบอดีต่อต้าน-digoxigenin กลวงไปอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส(โร) ที่มี visualized ใช้ nitroblue tetrazolium และฟอสเฟต 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1
กุ้งอี hepatopenaei (EHP) ติดเชื้อ stylirostris
กุ้งถูกเก็บรวบรวมจากบรูไนในปี2006 EHP เชื้อ P. vannamei
ถูกเก็บรวบรวมไว้ในบ่อเลี้ยงกุ้งจากเวียดนามในปี2014 และในปี 2015
ประชากรของพีvannamei
ถูกส่งมาจากประเทศไทยไปยังห้องปฏิบัติการของเราที่มหาวิทยาลัยแอริโซนาในปี 2014
โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อกักกันเหล่านี้กุ้งได้รับการวินิจฉัยในภายหลังด้วยEHP
การติดเชื้อโดยเนื้อเยื่อของพวกเขาตับอุจจาระและน้ำถังเก็บตัวอย่างสำหรับPCR
วิเคราะห์.
เพื่อทดสอบความจำเพาะของ EHP ในแหล่งกำเนิดพันธุ์ (ISH) และ PCR
ตรวจตัวอย่างของ P .
กุลาดำแสดงอาการทางคลินิกของผ้าฝ้ายโรคกุ้งถูกนำมาใช้กุ้งเหล่านี้จากมาดากัสการ์ในปี
2005 (เนื้อเยื่อคงที่) และ 2006 (เนื้อเยื่อแช่แข็ง) P. vannamei
ติดเชื้ออะมีบาในเนื้อเยื่อเหงือกที่กำหนดโดยเนื้อเยื่อตรวจสอบนอกจากนี้ยังถูกนำมาใช้เหล่านี้ถูกเก็บไว้ในปี 2014 สำหรับการตรวจPCR เนื้อเยื่อตับหรือกุ้งทั้งได้รับการเก็บรักษาไว้ในเอทานอล95% หรืออากาศแห้งและส่งไปยังห้องปฏิบัติการของเรา; สำหรับ ISH ตรวจกุ้งได้รับการแก้ไขในการตรึง AFA ของเดวิดสัน. 2.2 การสกัดดีเอ็นเอจากกุ้ง EHP เชื้อตับถูกลบออกและรวบรวม(4-5 กุ้ง) เป็นหนึ่งในตัวอย่าง จากถังถือ EHP กุ้งที่ติดเชื้ออุจจาระและน้ำที่ถูกเก็บตัวอย่าง น้ำถังเข้มข้น 150 ครั้งมี Microsep ล่วงหน้าอุปกรณ์แรงเหวี่ยงหนีศูนย์(พอลคอร์ปอเรชั่น) และใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ. รวมดีเอ็นเอที่สกัดจากแต่ละตัวอย่างโดยใช้ดีเอ็นเอสูงบริสุทธิ์แม่แบบของการจัดทำชุด (Roche ชีววิทยาศาสตร์) หรือแมกซ์เวล-16 เซลล์ LEV . ชุดฟอกดีเอ็นเอ (Promega) เพื่อทดสอบความจำเพาะของ EHP-ไพรเมอร์ที่ตรวจ PCR ได้ดำเนินการกับดีเอ็นเอแม่แบบจาก2 โรคพยาธิ (1) ผ้าฝ้ายโรคกุ้งกุ้งกุลาดำที่รวบรวมจากมาดากัสการ์ในปี2006 กุ้งเหล่านี้แสดงให้เห็นว่ากล้ามเนื้อสีขาว ดีเอ็นเอของพวกเขาเป็นบวกสำหรับmicrosporidium Pleistophora เหมือนถูกกำหนดโดยหน่วยย่อยขนาดเล็กrRNA ลำดับยีน (ฉบับที่ Genbank KP825331); (2) ameoba โรคเหล่านี้ได้รับความเดือดร้อนพี vannamei การตายที่สำคัญและพบได้ผ่านการตรวจสอบเนื้อเยื่อจะได้รับการติดเชื้ออะมีบา(สายพันธุ์ที่ไม่ได้กำหนด). เพื่อให้แน่ใจว่า EHP-ไพรเมอร์ไม่ได้ตอบสนองในการเป็นเจ้าภาพจีโนมดีเอ็นเอแม่แบบที่เตรียมจาก(1) เฉพาะเชื้อโรคฟรี (SPF) พี กุ้งขาว (> 10 ตัวอย่าง) และกุ้งกุลาดำ (3 ตัวอย่าง) จากฮาวายสหรัฐ (2) Penaeus indicus (2 ตัวอย่าง) จาก Saudi Arabia; (3) พี stylirostris (2 ตัวอย่าง) ที่เลี้ยงในนิวแคลิ; (4) Macrobrachium rosenbergii (2 ตัวอย่าง) จากประเทศฟิลิปปินส์ (5) ปู (7 ตัวอย่างสายพันธุ์ที่ไม่รู้จัก) เก็บรวบรวมไว้ในบริเวณใกล้เคียงของบ่อเลี้ยงกุ้งที่ตั้งอยู่ในประเทศซาอุดีอาระเบีย; (6) polychaetes (3 ตัวอย่าง), ชีวมวลอาร์ทีเมีย (9 ตัวอย่าง) ปลาหมึก (2 ตัวอย่าง) เคย(2 ตัวอย่าง) เหล่านี้ถูกส่งมาจากผู้ให้บริการในเชิงพาณิชย์ต่างๆ. 2.3 18S rRNA ยีน PCR และการโคลนสำหรับการตรวจPCR, PuReTaq พร้อม-To-Go ลูกปัด PCR (GE ดูแลสุขภาพ) ถูกนำมาใช้ ไพรเมอร์สำหรับการขยาย 18S rRNA ยีน 18S-F (50 CACCAGGTTGATTCTGCCTGA) และ 18S-R (50 TCTGAAATAGTGACGGGCGG) ปฏิกิริยา PCR ที่มีอยู่200 LM ของแต่ละ dNTP 0.2 LM ของแต่ละไพรเมอร์ 10 มิลลิ Tris-HCl (pH 9.0) KCl 50mm, 1.5mm MgCl2 2.5 U Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์และ1 LL ดีเอ็นเอที่สกัด (10 ng ถึง 100 นาโนกรัม LL? 1) ขยายได้ดำเนินการกับพารามิเตอร์การขี่จักรยานต่อไปนี้: การเริ่มต้น? denaturation ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบ? 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30, 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 และ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและสุดท้าย? นามสกุลที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ต่อไปนี้ PCR ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกวิเคราะห์ในเจลagarose 1.2% ที่มีโบรไมด์ ethidium วงที่ 1 กิโลไบต์ถูกตัดและสกัดดีเอ็นเอโคลนเข้าไปในpGEM-T-ง่ายเวกเตอร์ (Promega) และกำหนดให้เป็นโคลนpEHP-1 ผ่านลำดับดีเอ็นเอแทรกโคลนถูกกำหนดให้เป็น 1146-bp (GenBank หมายเลข KP759285) สำหรับการค้นหาความคล้ายคลึงกันอย่างมีนัยสำคัญกับลำดับใน GenBank ได้ดำเนินการโดยใช้ระเบิดที่ศูนย์แห่งชาติเพื่อเทคโนโลยีชีวภาพสารสนเทศ(NCBI). 2.4 การติดฉลากและการสอบสวนในแหล่งกำเนิดพันธุ์ที่ได้รับการ pEHP-1 พลาสมิดดีเอ็นเอใช้ในการสร้างสอบสวน ISH ได้. สอบสวนยีนถูกกำกับด้วย digoxigenin-11-dUTP (Roche) ในปฏิกิริยาPCR ตามที่อธิบายมารีเอตอัล (1998) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการติดฉลากปฏิกิริยาเป็น EHP-F (50 GGGAACGACGAACGGCTC AG) และ EHP-R1 (50 TGCCTTGATGAGACACTGTT) ที่สร้างส่วน1.1 กิโล ต่อไปนี้ PCR, ดีเอ็นเอ digoxigenin ที่มีข้อความแสดงความคิดเห็นถูกตกตะกอนด้วยเอทานอลอีกครั้งที่ลอยอยู่ในน้ำและเก็บไว้ที่20 องศาเซลเซียส การสอบสวนโรคกุ้งฝ้ายmicrosporidium Pleistophora เหมือนถูกสร้างขึ้นจากโคลน16S ภูมิภาคยีน RNA. เดวิดสันของ AFA กุ้งคงถูกประมวลผลที่ฝังอยู่ในพาราฟินและตัด(4 ไมครอนหนา) ตามมาตรฐานวิธีการ(Lightner 1996 ) หลังจาก deparaffinization ชุ่มชื้นโปรย่อยอาหารK, และหลังการตรึงส่วนที่ถูกซ้อนทับกับ500 LL ของการแก้ปัญหาการผสมพันธุ์ (4? เอสเอส, ไมด์ 50%, 1 การแก้ปัญหา Denhardt ของซัลเฟต dextran 5%, 0.5 แอลจี / ปลาแซลมอนมลดีเอ็นเอของอสุจิ) ที่มีการสอบสวน EHP (0.2 LG / ml) ภาพนิ่งที่ถูกวางไว้บนพื้นผิวที่ให้ความร้อนที่ 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและไฮบริดในชั่วข้ามคืนที่42 องศาเซลเซียส รอบชิงชนะเลิศการตรวจสอบได้ดำเนินการกับแอนติบอดีต่อต้าน digoxigenin ผันไปด่าง phosphatase (Roche) ที่ถูกมองเห็นโดยใช้ tetrazolium nitroblue และ5 โบรโม-4-chloro-3-indolyl ฟอสเฟต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Come take my hand?Come take my hand?การติดเชื้อจากอะมีบาในเนื้อเยื่อเหงือก ที่กำหนดโดยผล
สอบยังใช้ เหล่านี้ถูกรวบรวมใน 2014 สำหรับ
PCR ตรวจเนื้อเยื่อกุ้งหรือกุ้งทั้งหมด ถูกเก็บรักษาไว้
ใน 95% เอทานอล หรืออากาศแห้ง และส่งไปที่แล็บของเรา เพราะอิช
) , กุ้งถูกกำหนดใน Davidson เป็นเรียนฟิกเซทีฟ .
2.2 .
การสกัดดีเอ็นเอจากอันดับเครดิตที่ติดเชื้อชนิดกุ้ง , กุ้งคือ
ออกและรวม ( 4 – 5 กุ้ง ) เป็นหนึ่งในตัวอย่าง จากถัง
ถือกุ้งอันดับเครดิตที่ติดเชื้อ อุจจาระและน้ำตัวอย่าง .
ถังน้ำเข้มข้น 150 ครั้ง ด้วย microsep ล่วงหน้า
แรงเหวี่ยงอุปกรณ์ ( พอล คอร์ปอเรชั่น ) และใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ .
ดีเอ็นเอทั้งหมดสกัดจากแต่ละตัวอย่างสูงบริสุทธิ์ดีเอ็นเอแม่แบบ ( โรชด้านการเตรียมชุด

maxwell-16 เซลล์ ) หรือเลฟ ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ Kit ( promega ) .
ทดสอบความจำเพาะของวิธี PCR หรืออันดับเครดิต , จำนวน
กับดีเอ็นเอแม่แบบจาก 2 โรคพยาธิ ( 1 ) โรคกุ้งฝ้าย
, กุ้งกุลาดำ ที่รวบรวมจากมาดากัสการ์ในปี 2006
กุ้งเหล่านี้พบกล้ามเนื้อขาว ดีเอ็นเอของพวกเขาบวก
สำหรับ pleistophora เหมือน microsporidium กำหนดโดยขนาดเล็ก 1
rRNA ยีนลำดับ ( ขนาดไม่ kp825331 )( 2 ) ameoba
P . vannamei ทรมานจากโรคเหล่านี้อย่างมากและ
พบผ่านครีบ จะติดเชื้ออะมีบา ( ชนิดไม่ระบุ )
.
เพื่อให้อันดับเครดิตชนิดไม่ตอบสนองเป็นจีโนม , ดีเอ็นเอ
แม่แบบที่เตรียมจาก ( 1 ) ปลอดโรค ( SPF )
ที่เฉพาะเจาะจง P . vannamei ( 10 ตัวอย่าง ) และกุ้งกุลาดำ ( 3 ตัวอย่าง ) จาก
ฮาวาย , เรา( 2 ) แบบปลักร้ ( 2 ตัวอย่าง ) จากซาอุดิอาระเบีย ;
( 3 ) หน้า stylirostris ( 2 ตัวอย่าง ) ที่เพาะเลี้ยงในนิวแคลิโดเนีย ; ( 4 )
กุ้งก้ามกราม ( 2 ตัวอย่าง ) จากฟิลิปปินส์ และ ( 5 )
ปู ( 7 ตัวอย่าง ไม่ทราบชนิด ที่รวบรวมในบริเวณ
บ่อกุ้ง ตั้งอยู่ใน ซาอุดิอาระเบีย ; ( 6 ) เพรียง
( 3 ตัวอย่าง ) , อาร์ทีเมีย ชีวมวล ( 9 คน ) , ปลาหมึก ( 2 ตัวอย่าง ) กุ้งเคย
( 2 คน )เหล่านี้ถูกส่งจากผู้ให้บริการเชิงพาณิชย์ต่างๆ
2.3 18S rRNA ยีน PCR และโคลน
สำหรับ PCR พบ puretaq , พร้อมที่จะไปจากลูกปัด ( GE
Healthcare ) สถิติที่ใช้ ไพรเมอร์สำหรับ amplifying 18S rRNA ยีน 18s-f
( 50-caccaggttgattctgcctga ) และ 18s-r
( 50-tctgaaatagtgacgggcgg ) การตรวจปฏิกิริยาที่มีอยู่
200 LM ของแต่ละ dntp 0.2 LM ของแต่ละสีรองพื้น 10 มม. นอกจากนี้ – HCl
( pH 9.0 ) 50mm . 1.5 ชุด , ,2.5 วูทัค DNA polymerase
1 จะสกัดดีเอ็นเอ ( 10 กรัม 100 กรัมจะ  1 ) การเพิ่มปริมาณได้ด้วยค่า

( จักรยานต่อไปนี้ : เริ่มต้นที่ 94  C เป็นเวลา 3 นาที ตามด้วย 35 รอบ
94  C 30 , 55  C 30 , และ 72  C เสียและส่วนขยายสุดท้าย
72  องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีต่อไปนี้ผลิตภัณฑ์ PCR PCR ,
วิเคราะห์เป็น 1.2% เจลที่มีทิเดียมโบรไมด์ .เป็นวงดนตรีที่ 
1 กิโลถูกตัดและสกัดดีเอ็นเอโคลนเข้า pgem-t-easy เวกเตอร์ ,
( promega ) และกำหนดให้เป็นโคลน
pehp-1 . ผ่านการจัดลำดับดีเอ็นเอ การโคลนใส่ตั้งใจ
เป็น 1146 BP ( ขนาดไม่ kp759285 ) ค้นหา
ความเหมือนอย่างลำดับในการใช้ระเบิดที่พบ

ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ ( ncbi ) .
2.4 .ตรวจสอบฉลากและใน situ hybridization
ดีเอ็นเอพลาส pehp-1 ถูกใช้เพื่อสร้างค้นหา ish .
ยีนตัวถูกกับ digoxigenin-11-dutp ( โรช ) ในปฏิกิริยา PCR
ตามที่อธิบายไว้โดยมาริ et al . ( 1998 ) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการติดฉลากปฏิกิริยาเป็น ehp-f
( 50-gggaacgacgaacggctc
AG ) และ ehp-r1 ( 50-tgccttgatgagacactgtt ) ที่สร้างขึ้น ขนาด
1.1 KB ต่อไปนี้ PCR ,ที่ติดฉลากดีเอ็นเอ
สอบสวนมาตกตะกอนด้วยเอทานอลจะแขวนลอยอยู่ในน้ำ และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C .
  สอบสวนโรคกุ้งฝ้าย
pleistophora เหมือน microsporidium ถูกสร้างขึ้นจากโคลนยีน 16S RNA

เดวิดสันของภูมิภาค สำหรับซ่อมกุ้งถูกประมวลผลฝังตัวใน
พาราฟิน และคุณสมบัติ 4 ผมหนา ) ตามวิธีมาตรฐาน
( ดวงไฟ , 1996 )หลังจาก deparaffinization hydration
โปรเค การย่อยอาหาร และการตรึงโพสต์บางส่วนถูกหุ้มด้วย 500 จะแก้ปัญหา
เบส ( 4  SSC 50% Formamide ,
1  denhardt สารละลาย 5% dextran sulfate , 0.5 LG / ml ปลาแซลมอน
DNA สเปิร์ม ) ที่มีอันดับเครดิตโพรบ ( 0.2 LG / ml ) . สไลด์กำลัง
วางบนพื้นผิวอุณหภูมิ 90  C 10 นาทีที่ 42  C .
) ค้างคืนสุดท้ายคือการตรวจหาแอนติบอดีต่อต้านติด

( conjugated จะระโยงระยางโรช ) ที่มองเห็นและใช้ tetrazolium nitroblue
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ฟอสเฟต