by inverse PCR of the protein A-WEL

by inverse PCR of the protein A-WELQ-SplB-6x His tag-DSWV
construct described above with oSN1396 and oSN1397 followed
by intra-plasmid infusion to truncate the number of histidines from
6 to 5.
For the construct with 4 histidines, the original protein AWELQ-
SplB-6x His tag-DSWV ORF was amplified with oSN684 and
oSN1407, followed by infusion into a vector obtained by inverse PCR
using the oligonucleotides oSN1229 and oSN359.
2.5. ePDZ-b -WELQ-protein constructs
The ePDZ-b ORF was PCR-amplified using tandem oligonucleotides
oSN1344 and 1348 and reverse oligonucleotide oSN1386 to
attach a 6x histidine tag to the N terminus of ePDZ-b and a linker
coding for amino acids “WELQM” to the 3’ terminus. The ORF for
LSSmOrange (OFP) was PCR-amplified using oSN1318 and oSN1312,
followed by SOE PCR to create histidine tag-ePDZ-b-WELQ-OFP
expression cassette. This was then inserted by infusion cloning
into pET22b (Kan) vector obtained by inverse PCR using oSN359-
1384.
2.6. ePDZ-b -TEV site-protein constructs
The previously constructed ePDZ-b-WELQ-OFP plasmid was
inverse PCR-amplified with oSN1410 and oSN1315. The OFP ORF
(PCR-amplified using oSN1414-1412) was inserted into this plasmid
by infusion cloning to yield His tag-ePDZ-b-ENLYFQ-OFP. This
plasmid was subsequently PCR-amplified using primers oSN1415
and oSN1416 and the fibronectin 10Fn3 domain ORF (obtained by
amplifying plasmid 10FN3-HA_pET22b with primers oSN 1417 and
1418) inserted via infusion cloning. The resulting His tag-ePDZ-b-
ENLYFQ-10Fn3 expression plasmid was subsequently amplified by
inverse PCR using primer pairs oSN1419/1420 and oSN1419/1421
and products intramolecularly ligated post-phosphorylation to
yield constructs expressing His-tag-ePDZ-b-ENLYFQ-MGGS-10Fn3
and His-tag-ePDZ-b-ENLYFQ-MGGSGGS-10Fn3 respectively.
2.7. Protein expression
All protein expressionwas carried out in E. coli BL21 (DE3) using
IPTG induction of the T7 promoter. Colonies were inoculated
overnight (ON) in 10 mL TY medium supplemented with the
appropriate antibiotic at 37
C with shaking at 180 rpm. The next
day, the cultures were diluted into 800 mL of fresh medium and
allowed to grow at 37
C to an OD600 of 0.5, upon which IPTG
(1 mM final) was added. Induction was allowed to proceed overnight
at room temperature. The next day, cells were pelleted down
and stored at 20
C until further processing.
2.8. Protein purification
Cell pellets obtained as described above were resuspended in
20 mL of PBS-Tween or other buffers as mentioned in the text
followed by lysis by sonication. The lysate was centrifuged at
14800 rpm for 10 min in 50 mL Falcon tubes and the supernatant
was collected. In parallel, a 1 mL FF His-trap column (GE Healthcare)
was washed with 10 mL of the same buffer in which the pellet
was resuspended. After collecting the cell lysate supernatant, it was
run through the column, followed by washing with 10 mL of
washing buffer (the same buffer used for cell pellet resuspension).
Thereafter elution buffer (50 mM Sodium Phosphate þ 300 mM
NaCl þ 500 mM Imidazole) was run through the column and 1 mL
fractions were collected. All other fractions were also collected and
the normalized volumes of the fractions were run on an SDS-PAGE
gel followed by staining by Instant Blue for visualization.
The fractions containing high concentrations of pure protein
were mixed with glycerol to a final volume of 50% glycerol and
stored at 20
C.
2.9. Go Native protein purification
Cell pellets were resuspended and lysed as described above. The
cell lysate was loaded on an equilibrated His-trap column followed
bywashing with 10 mL of buffer. Next, 5mL of the relevant protease
(0.5 mg/mL) was loaded on the column. The column was capped
and incubated at room temperature for the relevant duration.
Thereafter, washing buffer was run through the column and fractions
collected. Finally, imidazole elution buffer was run through
the column. All fractions were collected and normalized volumes
electrophoresed on an SDS-PAGE gel followed by staining with
Instant Blue.
2.10. Mass spectrometry/N-terminal protein sequencing
To elucidate cleavage sequence specificity mass spectrometry
analysis was performed. Following SDS-PAGE separation and Coomassie
visualisation, gel band with protease cleaved product was
excised and subjected to “in-gel” digestion [9]. Following desalting,
sample was injected and separated using Orbitrap Fusion mass
spectrometer coupled to nanoUHPLC system Easy LC1000 (Thermo)
in a 45 min gradient. To generate peak list Proteome Discoverer 1.4
softwarewas used. Searches were done using Sequest HT algorithm
against Human Uniprot database appended with specific target
sequence (87458 entries) with following parameters: precursor
mass tolerance (MS) 10 ppm, (MS/MS) IT-MS/MS 0.6 Da; noenzyme;
2 miss cleavages; Static modifications: Carboamidomethyl
(C), Variable modifications: Oxidation (M), Deamidated
(NQ). N-terminal sequencing of gel-purified protein [10] was carried
out by Biosyn

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โดยผกผัน PCR ของโปรตีน A-WELQ-SplB-6 x เขาแท็ก DSWVตามโครงสร้างที่อธิบายข้างต้นกับ oSN1396 และ oSN1397โดยแช่ใน plasmid เพื่อตัดทอนจำนวน histidines จาก6-5สำหรับก่อสร้างพร้อม 4 histidines โปรตีนเดิม AWELQ-SplB-6 x เขาแท็ก DSWV ORF ถูกขยาย ด้วย oSN684 และoSN1407 ตาม ด้วยแช่ลงในเวกเตอร์ได้ โดยผกผัน PCRใช้ oligonucleotides oSN1229 และ oSN3592.5 การสร้างโปรตีนบี ePDZ - WELQORF ePDZ-b ถูกใช้ควบคู่ oligonucleotides PCR ขยายoSN1344 และ oSN1386 oligonucleotide 1348 และย้อนกลับไปแนบ 6 x histidine แท็กไป N ePDZ b และตัวเชื่อมโยงรหัสสำหรับกรดอะมิโน "WELQM" ไปยัง 3' ORF สำหรับLSSmOrange (OFP) คือ PCR ขยายโดยใช้ oSN1318 และ oSN1312ตาม ด้วย PCR SOE สร้าง histidine แท็ก-ePDZ-b-WELQ-OFPเทปนิพจน์ นี้แล้วแทรก โดยแช่โคลนลงใน pET22b (กาญจน์) เวกเตอร์ได้ โดยผกผัน PCR ที่ใช้ oSN359 -13842.6. สร้างเว็บไซต์ ePDZ-b - TEV โปรตีนมี plasmid ePDZ b WELQ OFP ที่สร้างก่อนหน้านี้ผกผัน PCR ขยาย ด้วย oSN1410 และ oSN1315 OFP ORF(PCR-ขยายโดยใช้ oSN1414-1412) ถูกแทรกลงใน plasmid นี้โดยแช่โคลนให้ผลเขาแท็ก-ePDZ-b-ENLYFQ-OFP นี้plasmid ถูกมา PCR-ขยายโดยใช้ไพรเมอร์ oSN1415และ oSN1416 และโดเมน 10Fn3 fibronectin ORF (ได้โดยขยาย ด้วยไพรเมอร์ oSN 1417 plasmid 10FN3-HA_pET22b และ1418) แทรกผ่านโคลนแช่ ผลแท็กของเขา-ePDZ-b -Plasmid นิพจน์ ENLYFQ 10Fn3 ต่อมาถูกขยายโดยผกผันการ PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่ oSN1419/1420 และ oSN1419/1421และผลิตภัณฑ์ phosphorylation หลังควบ intramolecularly การทำให้โครงสร้างที่แสดง His-tag-ePDZ-b-ENLYFQ-MGGS-10Fn3และ His-tag-ePDZ-b-ENLYFQ-MGGSGGS-10Fn3 ตามลำดับ2.7. โปรตีนนิพจน์Expressionwas โปรตีนทั้งหมดดำเนินการใน E. coli BL21 (DE3) ใช้เหนี่ยวนำ IPTG ของโปรโมเตอร์ T7 อาณานิคมถูก inoculatedพักค้างคืน (บน) ใน 10 มล. TY กลางเสริมด้วยการยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่ 37 C กับสั่นที่ 180 รอบต่อนาที ถัดไปวัน วัฒนธรรมถูกเจือจางลง 800 มล.ของสดกลาง และการเติบโตที่ 37 C OD600 เป็น 0.5 เมื่อ IPTG ซึ่ง(สุดท้าย 1 มิลลิเมตร) ถูกเพิ่ม เหนี่ยวนำที่ได้รับอนุญาตให้ดำเนินการค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ในวันถัดไป ถูกสัตว์ลงและเก็บไว้ที่ 20 C จนถึงดำเนินการต่อไป2.8. โปรตีนบริสุทธิ์เซลล์ขี้ที่ได้อธิบายข้างต้นถูก resuspended ใน20 mL ของ PBS โลกหรือบัฟเฟอร์อื่น ๆ ตามที่กล่าวในข้อความตาม ด้วย lysis โดย sonication การ lysate ของถูกจากที่รอบต่อนาที 10 นาที 50 มล.เหยี่ยวท่อและ supernatant 14800รวบรวมได้ ขนาน 1 mL คอลัมน์ FF พระกับดัก (GE ดูแลสุขภาพ)ถูกล้าง ด้วย 10 mL ของบัฟเฟอร์เดียวซึ่งเม็ดแก้ไข resuspended หลังจากสะสม supernatant lysate ของเซลล์ มันเป็นเรียกใช้ผ่านคอลัมน์ ตาม ด้วยการล้างกับ 10 มล.ล้างบัฟเฟอร์ (เดียวบัฟเฟอร์ที่ใช้สำหรับการ resuspension ตะกอนเซลล์เม็ด)หลังจากนั้นบัฟเฟอร์ชะ (þโซเดียมฟอสเฟต 50 มม. 300 มม.Þ NaCl 500 มม.อิมิดาโซล) รันผ่านคอลัมน์และ 1 มิลลิลิตรเศษส่วนที่ถูกเก็บรวบรวม เศษส่วนอื่น ๆ ทั้งหมดยังถูกรวบรวม และปริมาณมาตรฐานของเศษส่วนมีรันการใน SDS-หน้าเจลตาม ด้วยย้อมสีโดยสีฟ้าทันทีสำหรับการแสดงเศษส่วนที่ประกอบด้วยความเข้มข้นสูงของโปรตีนบริสุทธิ์มาผสมกับกลีเซอรอลเพื่อเสียงที่ดีสุดท้ายของ 50% กลีเซอรอล และเก็บที่ 20 c2.9. ไปทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนดั้งเดิมเซลล์ขี้ resuspended และนาทีที่ 37uc ตามที่อธิบายข้างต้น การเซลล์ lysate ถูกโหลดบนคอลัมน์ equilibrated ดักพระตามbywashing กับ 10 mL ของบัฟเฟอร์ ถัดไป 5 มล.โปรติเอสที่เกี่ยวข้อง(0.5 mg/mL) ถูกโหลดบนคอลัมน์ คอลัมน์ถูกปกคลุมและรับการกกที่อุณหภูมิห้องในช่วงระยะเวลาที่เกี่ยวข้องหลังจากนั้น การล้างบัฟเฟอร์รันผ่านคอลัมน์และเศษส่วนการเก็บรวบรวม ในที่สุด รันผ่านบัฟเฟอร์ชะอิมิดาโซลคอลัมน์ เศษส่วนทั้งหมดถูกรวบรวม และตามปกติปริมาณelectrophoresed บนการเจล SDS-หน้าตาม ด้วยย้อมสีด้วยสีฟ้าทันที2.10. mass spectrometry/N-เทอร์มินัลโปรตีนลำดับการ elucidate ความแตกแยกลำดับความจำเพาะรเมททำการวิเคราะห์ แยกหน้า SDS และ Coomassie ต่อไปนี้สร้างมโนภาพ วงเจกับผลิตภัณฑ์แหวกโปรติเอสได้สรรพสามิต และหัก "ในเจล" ย่อยอาหาร [9] ต่อแยกตัวอย่างที่ถูกฉีด และแยกใช้ฟิวชั่น Orbitrapสเปกโตรมิเตอร์ควบคู่กับระบบ nanoUHPLC LC1000 ง่าย (เทอร์โม)ในการไล่โทน 45 นาที เพื่อสร้างรายการสูงสุด Proteome Discoverer 1.4softwarewas ใช้ ทำการค้นหาโดยใช้อัลกอริทึม Sequest HTฐานข้อมูล Uniprot มนุษย์ผนวกกับเป้าหมายเฉพาะลำดับที่ (รายการ 87458) กับพารามิเตอร์ต่อไปนี้: สารตั้งต้นมวลความอดทน (MS) 10 ppm ดามัน-MS/MS 0.6 (MS/MS) noenzyme2 นางสาว cleavages ปรับเปลี่ยนแบบคงที่: Carboamidomethyl(C) ตัวแปรปรับเปลี่ยน: ออกซิเดชัน (M) Deamidated(NQ) ขนเทอร์มินัล N ลำดับของโปรตีนบริสุทธิ์เจล [10]ออก โดยไบโอซิน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โดยวิธี PCR ผกผันของโปรตีน A-WELQ-SplB-6x เขาแท็ก DSWV
สร้างกล่าวข้างต้นกับ oSN1396 และ oSN1397 ตาม
โดยภายในพลาสมิดแช่ตัดจำนวน histidines จาก
6 5.
สำหรับการสร้างที่มี 4 histidines เดิม โปรตีน AWELQ-
SplB-6x เขาแท็ก DSWV ORF ถูกขยายด้วย oSN684 และ
oSN1407 ตามด้วยการแช่ลงในเวกเตอร์ที่ได้จากการผกผัน PCR
โดยใช้ oligonucleotides oSN1229 และ oSN359 ได้.
2.5 ePDZ-B -WELQ โปรตีนสร้าง
ePDZ-B ORF ถูก PCR-amplified ใช้ควบคู่ oligonucleotides
oSN1344 และ 1348 และย้อนกลับ oligonucleotide oSN1386 จะ
แนบแท็ก 6x ฮิสติดีนไปยังสถานีเอ็น ePDZ-B และตัวเชื่อมโยง
การเข้ารหัสสำหรับกรดอะมิโน "WELQM "เพื่อ 3 'ปลายทาง ORF สำหรับ
LSSmOrange (OFP) คือ PCR-amplified ใช้ oSN1318 และ oSN1312,
ตามด้วย SOE PCR เพื่อสร้างฮิสติดีนแท็ก ePDZ-B-WELQ-OFP
เทปการแสดงออก นี้ถูกแทรกแล้วโดยการแช่โคลน
เข้าไปใน pET22b (กาญจน์) เวกเตอร์ที่ได้จากการผกผัน PCR โดยใช้ oSN359-
1384.
2.6 ePDZ-B -TEV เว็บไซต์โปรตีนสร้าง
สร้างก่อนหน้านี้ ePDZ-B-WELQ-OFP พลาสมิดถูก
ผกผัน PCR-amplified กับ oSN1410 และ oSN1315 OFP ORF
(PCR-amplified ใช้ oSN1414-1412) ถูกแทรกลงในพลาสมิดนี้
โดยการแช่โคลนให้ผลผลิตของเขาแท็ก ePDZ-B-ENLYFQ-OFP นี้
พลาสมิดต่อมา PCR-amplified โดยใช้ไพรเมอร์ oSN1415
และ oSN1416 และโดเมน fibronectin 10Fn3 ORF (ที่ได้จากการ
ขยายพลาสมิด 10FN3-HA_pET22b กับไพรเมอร์ OSN 1417 และ
1418) แทรกผ่านการแช่โคลน ส่งผลให้เขาแท็ก ePDZ-B-
ENLYFQ-10Fn3 แสดงออกพลาสมิดถูกขยายต่อมา
ผกผัน PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่ oSN1419 / 1420 และ oSN1419 / 1421
และผลิตภัณฑ์ ligated intramolecularly โพสต์ phosphorylation เพื่อ
ให้ผลผลิตสร้างแสดงแท็ก His-ePDZ-B-ENLYFQ -MGGS-10Fn3
และเขาแท็ก ePDZ-B-ENLYFQ-MGGSGGS-10Fn3 ตามลำดับ.
2.7 การแสดงออกของโปรตีน
ทั้งหมด expressionwas โปรตีนดำเนินการใน E. coli BL21 (DE3) โดยใช้
การเหนี่ยวนำ IPTG ของโปรโมเตอร์ T7 อาณานิคมถูกเชื้อ
ชั่วข้ามคืน (ON) ใน 10 มลกลาง TY เสริมด้วย
ยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่ 37 องศาเซลเซียสเขย่าที่ 180 รอบต่อนาที ถัดไป
วันวัฒนธรรมที่ถูกปรับลดลงไป 800 มิลลิลิตรของกลางสดและ
ได้รับอนุญาตให้เติบโตที่ 37 องศาเซลเซียสไปยัง OD600 0.5 ตามที่ IPTG
(1 มิลลิสุดท้าย) ถูกเพิ่มเข้ามา เหนี่ยวนำได้รับอนุญาตให้ดำเนินการต่อไปในชั่วข้ามคืน
ที่อุณหภูมิห้อง วันรุ่งขึ้นเซลล์เม็ดถูกลง
และเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสจนดำเนินการต่อไป.
2.8 โปรตีนบริสุทธิ์
เม็ดมือถือที่ได้รับตามที่อธิบายไว้ข้างต้นถูก resuspended ใน
20 มลพีบีเอส-Tween หรือบัฟเฟอร์อื่น ๆ ที่กล่าวถึงในข้อความที่
ตามมาด้วยการสลายโดย sonication lysate ถูกหมุนเหวี่ยงที่
14,800 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีใน 50 หลอดมลเหยี่ยวและสารละลาย
ที่ถูกเก็บรวบรวม ในแบบคู่ขนาน 1 มล FF ของเขากับดักคอลัมน์ (GE Healthcare)
ถูกล้างด้วย 10 มลของบัฟเฟอร์เดียวกันที่เม็ด
ถูก resuspended หลังจากที่เก็บรวบรวมใสเซลล์ lysate มันก็
วิ่งผ่านคอลัมน์ตามด้วยการล้างด้วย 10 มล
บัฟเฟอร์ซักผ้า (บัฟเฟอร์เดียวกับที่ใช้สำหรับเซลล์เม็ด resuspension).
หลังจากนั้นชะบัฟเฟอร์ (50 มิลลิโซเดียมฟอสเฟตÞ 300 มิลลิเมตร
NaCl Þ 500 มิลลิ Imidazole ) คือการทำงานผ่านคอลัมน์และ 1 มิลลิลิตร
เศษส่วนที่ถูกเก็บรวบรวม ทั้งหมดเศษส่วนอื่น ๆ ยังถูกเก็บรวบรวมและ
ปริมาณปกติเศษส่วนได้ทำงานบนระบบ SDS-PAGE
เจลตามด้วยการย้อมสีโดยทันทีสีฟ้าสำหรับการแสดง.
เศษส่วนที่มีความเข้มข้นสูงของโปรตีนบริสุทธิ์
ถูกผสมกับกลีเซอรอลปริมาณสุดท้ายของ 50% กลีเซอรอล และ
เก็บไว้ที่? 20? C.
2.9 ไปโปรตีนพื้นเมืองบริสุทธิ์
เม็ดมือถือถูก resuspended และ lysed ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
lysate เซลล์ถูกโหลดบน equilibrated คอลัมน์ของเขากับดักตาม
bywashing 10 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ ถัดไป 5ml ของน้ำย่อยที่เกี่ยวข้อง
(0.5 mg / ml) ถูกโหลดในคอลัมน์ คอลัมน์นี้ถูกปกคลุม
และบ่มที่อุณหภูมิห้องในช่วงระยะเวลาที่เกี่ยวข้อง.
หลังจากนั้นล้างบัฟเฟอร์ที่กำลังวิ่งผ่านคอลัมน์และเศษส่วน
ที่เก็บรวบรวม สุดท้ายบัฟเฟอร์ชะ imidazole กำลังวิ่งผ่าน
คอลัมน์ เศษส่วนทั้งหมดถูกเก็บรวบรวมและปริมาณปกติ
electrophoresed บนเจล SDS-PAGE ตามด้วยการย้อมสีด้วย
ทันทีฟ้า.
2.10 มวลสาร / N-ขั้วลำดับโปรตีน
เพื่ออธิบายความแตกแยกลำดับความจำเพาะมวลสาร
วิเคราะห์ได้ดำเนินการ ต่อไปนี้การแยกระบบ SDS-PAGE และ Coomassie
การแสดง, วงดนตรีเจลที่มีน้ำย่อยสินค้าแยกถูก
ตัดและยัดเยียดให้ "ในเจล" การย่อยอาหาร [9] ต่อไปนี้ desalting,
ตัวอย่างถูกฉีดและแยกออกจากกันโดยใช้ Orbitrap ฟิวชั่นมวล
สเปกโตรมิเตอร์ควบคู่กับระบบ nanoUHPLC ง่าย LC1000 (เทอร์โม)
ในการไล่ระดับสี 45 นาที เพื่อสร้างรายการยอดโปรตีน Discoverer 1.4
softwarewas ใช้ ค้นหาได้กระทำโดยใช้อัลกอริทึม HT Sequest
กับฐานข้อมูลของมนุษย์ Uniprot ผนวกกับเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจง
ตามลำดับ (87,458 รายการ) กับพารามิเตอร์ต่อไปนี้: ปูชนียบุคคล
อดทนมวล (MS) 10 ppm (MS / MS) IT-MS / MS 0.6 ดา; noenzyme;
2 นางสาวปริ; การปรับเปลี่ยนแบบคงที่: Carboamidomethyl
(C), การปรับเปลี่ยนการศึกษา: ออกซิเดชัน (M), Deamidated
(NQ) N-ขั้วลำดับของโปรตีนเจลบริสุทธิ์ [10] ได้ดำเนิน
การโดย Biosyn

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โดยวิธี PCR ผกผันของโปรตีน a-welq-splb-6x dswv แท็กของเขาสร้างที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วย และ osn1397 osn1396 ตามโดยฉีดพลาสมิดภายในการตัดทอนจำนวน histidines จาก6 กับ 5เพื่อสร้าง 4 histidines , awelq เดิม - โปรตีนsplb-6x ของเขาแท็ก dswv ORF ถูกขยายด้วย osn684 และosn1407 ตามด้วยฉีดเข้าไปในเวกเตอร์ได้โดยวิธีผกผันการใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์และ osn1229 osn359 .2.5 epdz-b - welq โครงสร้างโปรตีนการ epdz-b ORF คือ PCR ไพรใช้ควบคู่โอลิโกนิวคลีโอไทด์osn1344 1348 และและย้อนกลับ ซึ่ง osn1386 เพื่อติดแท็กเฉพาะเมื่อ n ปลายทางของ epdz-b และลิงเกอร์รหัสสำหรับกรดอะมิโน " welqm " ถึง 3 สถานี โดย ORF สำหรับlssmorange ( p ) คือ PCR และขยายการใช้ osn1312 osn1318 ,ตามด้วยวิธี PCR เพื่อสร้างโซ tag-epdz-b-welq-ofp ีนท่าทางเทป . นี้ใส่แล้วแช่โคลนโดยเป็น pet22b ( คัน ) ได้โดยวิธี PCR ที่ใช้เวกเตอร์ osn359 - ผกผัน1209 .2.6 epdz-b tev เว็บไซต์โครงสร้างโปรตีนepdz-b-welq-ofp พลาสมิดที่สร้างก่อนหน้านี้วิธี PCR และของ osn1410 osn1315 . โดยปัจจุบัน ORF( สามารถขยายการใช้ osn1414-1412 ) ถูกแทรกลงในนี้อยู่โดยแช่โคลนเพื่อผลผลิต tag-epdz-b-enlyfq-ofp ของเขา นี้พลาสมิดดีเอ็นเอ amplified ใช้ไพรเมอร์ osn1415 ในภายหลังและ osn1416 และไฟโบรเนกติน 10fn3 โดเมน ORF ( ที่ได้รับโดยขยาย 10fn3-ha_pet22b กับไพรเมอร์และทราน 1406 พลาสมิด1035 ) แทรกผ่านแช่โคลน . ผล tag-epdz-b ของเขาenlyfq-10fn3 การแสดงออกพลาสมิด ต่อมาได้ขยายโดยPCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่ตรงกันข้าม osn1419 1420 osn1419 / ผม / และและผลิตภัณฑ์ intramolecularly ฟอสโฟริเลชันเพื่อผูก โพสต์สร้างการแสดง his-tag-epdz-b-enlyfq-mggs-10fn3 ผลผลิตและ his-tag-epdz-b-enlyfq-mggsggs-10fn3 ตามลำดับ2.7 . การแสดงออกของโปรตีนexpressionwas โปรตีนทั้งหมดดำเนินการใน E . coli BL21 ( DE3 ) โดยใช้* * 3 เอนไซม์เหนี่ยวของโปรโมเตอร์ อาณานิคมปลูกเชื้อคืน ( บน ) 10 มิลลิลิตร เสริมด้วยสื่อไทยาปฏิชีวนะที่เหมาะสม 37 องศาเซลเซียสเขย่าที่ 180 รอบ / นาที ต่อไปวันวัฒนธรรมลดไป 800 มล. ขนาดกลาง สด และอนุญาตให้ขึ้นที่อุณหภูมิ 37 เป็น od600 0.5 ซึ่งเมื่อโปรตีน( 1 เดือนสุดท้าย ) ถูกเพิ่มเข้ามา การได้รับอนุญาตให้ดำเนินการค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง วันต่อมา เซลล์มีเม็ดลงเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 C ถึงการประมวลผลต่อไป2.8 . บริสุทธิ์โปรตีนเซลล์เม็ดได้ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น resuspended ใน20 ml ของ PBS หรือบัฟเฟอร์อื่น ๆนตามที่กล่าวไว้ใน ข้อความตามด้วยการสลายโดย sonication . การ lysate คือระดับที่14800 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที และนำหลอด 50 มิลลิลิตร เหยี่ยวคือการเก็บรวบรวม ในแบบคู่ขนาน 1 ml FF ของเขากับดักคอลัมน์ ( GE Healthcare )ซัก 10 ml ของบัฟเฟอร์เดียวกันซึ่งในเม็ดคือ resuspended . หลังจากรวบรวมเซลล์ lysate สูง คือวิ่งผ่านคอลัมน์ตามด้วยซัก 10 มิลลิลิตรล้างบัฟเฟอร์ ( Buffer เดียวกันใช้สำหรับเซลล์เม็ด resuspension )หลังจากนั้นใช้โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( 50 มม. þ 300 มม.ขนาด 500 มม. þอิมิดาโซล ) คือ วิ่งผ่านคอลัมน์ 1 มิลลิลิตรเศษส่วนที่ถูกบุกรุก ทั้งหมดอื่น ๆ ยังเก็บและเศษส่วนค่าปริมาณของเศษส่วนที่ถูกใช้ในการศึกษาเจลสีฟ้าตามคุณสมบัติทันทีสำหรับการสร้างภาพเศษส่วนที่มีความเข้มข้นสูงของโปรตีนบริสุทธิ์ผสมกลีเซอรอลจะเป็นเล่มสุดท้ายของ 50% กลีเซอรอลและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส2.9 . โปรตีนบริสุทธิ์ไปพื้นเมืองเซลล์และอัตรา resuspended lysed ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ที่เซลล์ lysate ถูกโหลดใน equilibrated ของเขากับดักคอลัมน์ตามbywashing 10 ml ของบัฟเฟอร์ หน้า 5 ของโปรตีนที่เกี่ยวข้อง( 0.5 mg / ml ) คือโหลดไว้ในคอลัมน์ คอลัมน์ก็ปรบมือบ่มที่อุณหภูมิห้องระยะเวลาที่เกี่ยวข้องหลังจากนั้นล้างบัฟเฟอร์วิ่งผ่านเสาและเศษส่วนรวบรวม ในที่สุดอิมิดาโซล ( บัฟเฟอร์วิ่งผ่านคอลัมน์ ทั้งหมดถูกเก็บรูปเล่มและเศษส่วนelectrophoresed บน SDS-PAGE gel ตามการศึกษาฟ้าทันที2.10 . มวลสาร / กรดอะมิโนลำดับโปรตีนกลไกการลำดับความจำแมสสเปกโทรเมทรีการวิเคราะห์ . การแยกและการศึกษาเหล่านี้น่าจะเป็นดังนี้ภาพ , วงกับโปรเป็นผลิตภัณฑ์เจลตัดและภายใต้ " เจล " การย่อยอาหาร [ 9 ] desalting ต่อไปนี้ ,ตัวอย่างและการ orbitrap ฉีดแยกมวล ฟิวชั่นกล้องคู่กับ nanouhplc ระบบง่าย lc1000 ( ร้อน )ใน 45 นาทีลาด . เพื่อสร้างรายการที่พบสูงสุด 1.4 โปรตีนsoftwarewas ใช้ . ค้นหา ทำโดยใช้ขั้นตอนวิธี sequest ทร.กับฐานข้อมูล uniprot มนุษย์ ผนวกกับเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงลำดับ ( 87458 รายการ ) กับสารตั้งต้นพารามิเตอร์ต่อไปนี้ :ความอดทนมวล ( MS ) 10 ppm ( MS / MS / MS ) it-ms 0.6 ดา ; noenzyme ;นางสาว carboamidomethyl รอยร้าว การดัดแปลงแบบคงที่ :( C ) , การปรับเปลี่ยนตัวแปร : ( M ) , deamidated ออกซิเดชัน( NQ ) ลำดับของกรดอะมิโนของโปรตีนบริสุทธิ์เจล [ 10 ] ถูกอุ้มออก