cycler (Personal cycler 20; Biometr

cycler (Personal cycler 20; Biometra Biomedizinische Analytik GmbH, Go¨ttingen,Germany). The reaction mixture was overlaid with 50 ml of sterile mineral oil and then was incubated in a thermal cycler at 95°C for 5 min. Thermostable
DNA polymerase was added, and amplification was carried out for 40 cycles,each of which was set as follows: 94°C for 1 min, 48°C for 1 min, 72°C for 1 min,and finally, an additional 72°C for 5 min. The amplicons were detected by 1.8%
agarose gel electrophoresis.PFGE. DNA extraction, DNA digestion, and PFGE were performed according
to procedures described elsewhere (25). Bacteria on tryptic soy agar (Difco)–3%NaCl were transferred to 5 ml of TSB–3% NaCl and incubated overnight at 37°Cwith shaking at 160 rpm. Bacterial cells were harvested by centrifugation and
resuspended in 2 ml of buffer containing 10 mM Tris, 100 mM EDTA, and 1 mM NaCl at pH 8.0. Agarose plugs were prepared by mixing an equal volume of bacterial suspension with 1.5% low-melting agarose (FMC Corp., Rockland,
Maine). Bacterial cells in the agarose plugs were lysed by treatment with a solution containing 1 mg of lysozyme/ml and 0.1% N-sodium lauroyl sarcosine at 37°C for 24 h. The cells were then treated with proteinase K (0.5 mg/ml in 0.5 M
EDTA and 1% N-sodium lauroyl sarcosine) at 45°C for 48 h and washed three times (30 min each) with TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). One section of the plug (4 by 9 by 1.2 mm) was equilibrated with an enzyme buffer and
then placed in 100 ml of fresh buffer containing 10 U of SfiI (New England BioLabs, Beverly, Mass.). It was then incubated at 4°C for 16 h and, finally, digestion was performed at 37°C for another 48 h. High-molecular-weight restriction fragments were resolved in 1% agarose gel in 0.5% Tris-borate-EDTA buffer by using a CHEF apparatus (CHEF-DR II;
Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.). The running conditions were 190 V for 22.4 h at 14°C, with 3 to 80 s of pulse time. A lambda ladder PFGE marker (New England BioLabs) was used to mark molecular size. After electrophoresis
was performed, gels were stained in ethidium bromide (Sigma Co., St. Louis,Mo.), destained in distilled water, and photographed with a UV transilluminator, the Flou-Link 312 (Vilber Lourmat, Torey, France).
Susceptibility to environmental stresses. To determine the susceptibility to different environmental stresses, i.e., temperature or conditions of mild acid or low salinity, bacteria were cultured in 50 ml of Luria-Bertani broth–3% NaCl
medium at 37°C for 16 h. V. parahaemolyticus is a vulnerable species and will be quickly inactivated under conditions that differ from those of its natural habitat in warm marine water (12). Normally, this bacterium lives and proliferates in
warm seawater, with optimum growth at 35 to 37°C, 3% NaCl, and neutral acidity (2). The maximum growth range of this pathogen is about 5 to 44°C, pH 4.8 to 11.0 (2). Temperature at 13°C or salinity below 0.5% NaCl inhibits growth of this
bacterium (2). Although V. parahaemolyticus is alkaline tolerant, treatment with mild acid at pH 4.4 is lethal (26). For temperature stresses, the cultures were shifted to either 4 or 50°C (14). For mild acid stress, the bacterial cultures were

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

cycler (บุคคล cycler 20 Biometra Biomedizinische Analytik GmbH, Go¨ttingen เยอรมนี) ส่วนผสมของปฏิกิริยาถูกซ้อน ด้วย 50 ml ของน้ำมันแร่ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว incubated ใน cycler มีความร้อน 95° c สำหรับ 5 นาที Thermostableดีเอ็นเอพอลิเมอเรสถูกเพิ่ม และขยายดำเนินการ 40 รอบ ซึ่งแต่ละการตั้งค่าเป็นดังนี้: 94° C เป็นเวลา 1 นาที 1 นาที 72° C เป็นเวลา 1 นาที 48° C และในที่สุด การเพิ่มเติม 72° C เป็นเวลา 5 นาที Amplicons ตรวจพบ โดย 1.8%agarose เจลอิ PFGE สกัดดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอย่อย PFGE และดำเนินการตามขั้นตอนการอธิบายอื่น ๆ (25) เชื้อแบคทีเรียบนอาหารเลี้ยงเชื้อ tryptic ถั่วเหลือง (Difco) –3% NaCl โอน 5 มล.ของ TSB – 3% NaCl และรับการกกค้างคืนที่ 37 ° Cwith สั่นที่ 160 รอบต่อนาที มีการเก็บเกี่ยวเซลล์แบคทีเรีย โดยการหมุนเหวี่ยง และresuspended ใน 2 มล.ของบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยทริสเรทติ้ง 10 มม. 100 มม. EDTA และ 1 มม. NaCl ที่ pH 8.0 ปลั๊ก Agarose วจัดทำขึ้น โดยการผสมระงับแบคทีเรียในปริมาณเท่ากับกับ 1.5% ต่ำละลาย agarose (ตัว Corp. รอคแลนด์เมน) เซลล์แบคทีเรียในปลั๊ก agarose ได้นาทีที่ 37uc โดยการรักษา ด้วยโซลูชันที่ประกอบด้วย 1 มิลลิกรัมของ lysozyme/ml และ 0.1 N โซเดียม lauroyl สิ่งที่ sarcosine ที่ 37° C ใน 24 ชม เซลล์ได้รับการรักษาแล้ว ด้วย proteinase K (0.5 mg/ml ใน 0.5 ม.EDTA และ 1% โซเดียม N lauroyl สิ่งที่ sarcosine) ที่ 45 ° C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง และล้าง 3 ครั้ง (30 นาที) กับ TE buffer (10 mM ทริสเรทติ้ง HCl, 1 mM EDTA) ส่วนหนึ่งของปลั๊ก (4 โดย 9 มม. 1.2) คือ equilibrated กับมีบัฟเฟอร์เอนไซม์ และแล้ว วางไว้ใน 100 มิลลิลิตรของสดบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 10 U ของ SfiI (BioLabs New England เบเวอร์ลี่ มวล.) แล้วมัน incubated ที่ 4° C เป็นเวลา 16 ชม. และ สุดท้าย ทำการย่อยอาหารที่ 37° C สำหรับอีก 48 ข้อจำกัดสูงน้ำหนักโมเลกุลบางส่วนได้รับการแก้ไข 1% agarose เจใน 0.5% ทริ-borate-EDTA บัฟเฟอร์ โดยใช้อุปกรณ์เชฟ (CHEF DR IIห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ริชมอนด์ รัฐแคลิฟอร์เนีย) สภาพวิ่งได้ 190 V สำหรับ 22.4 h ที่ 14° C มี 3 80 s เวลาชีพจร เครื่องหมาย PFGE บันไดแลมบ์ดา (นิวอิงแลนด์ BioLabs) ถูกใช้เพื่อทำเครื่องหมายขนาดโมเลกุล หลังจากอิถูกดำเนินการ เจไวท์ในโบรไมด์ ethidium (บริษัท Sigma เซนต์หลุยส์ เดือน), destained ในน้ำกลั่น และถ่ายรูปกับมี UV transilluminator, 312 Flou ลิงค์ (Vilber Lourmat, Torey ฝรั่งเศส)ความไวต่อความเครียดด้านสิ่งแวดล้อม การตรวจสอบความไวต่อการแตกต่างกันความเครียดสิ่งแวดล้อม เช่น อุณหภูมิหรือสภาพความรุนแรงต่ำ หรือกรดเค็ม แบคทีเรียถูกล้างใน 50 ml ของ Luria Bertani ซุป – 3% NaClปานกลางที่ 37° C สำหรับ 16 V. parahaemolyticus มี และจะยกอย่างรวดเร็วภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างจากท่ามกลางน้ำทะเลอุ่น (12) ปกติ แบคทีเรียนี้อาศัยอยู่ และ proliferates ในอุ่นน้ำทะเล มีการเติบโตสูงสุดที่ 35 ถึง 37° C, 3% NaCl และกรดเป็นกลาง (2) ช่วงสูงสุดเจริญเติบโตของเชื้อโรคนี้มีประมาณ 5 44° C, pH 4.8 ถึง 11.0 (2) อุณหภูมิ 13° C หรือความเค็มต่ำกว่า 0.5% NaCl ยับยั้งการเติบโตนี้แบคทีเรีย (2) แม้ว่า V. parahaemolyticus เป็นด่างทนต่อ รักษา ด้วยกรดอ่อน ๆ ที่ pH 4.4 มียุทธภัณฑ์ (26) สำหรับอุณหภูมิเครียด วัฒนธรรมถูกเลื่อนขึ้นไป 4 หรือ 50 ° C (14) สำหรับความเครียดกรดอ่อน แบคทีเรียวัฒนธรรมได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Cycler (Cycler ส่วนบุคคล 20 Biometra Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen, เยอรมนี) ผสมปฏิกิริยาถูกบุด้วย 50 มล. ของน้ำมันแร่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วถูกบ่มใน Cycler ความร้อนที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ทนความร้อน
ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เสริมและขยายได้ดำเนินการ 40 รอบซึ่งแต่ละถูกกำหนดดังต่อไปนี้: 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 48 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและสุดท้ายเพิ่มอีก 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที amplicons ตรวจพบโดย 1.8%
agarose เจล electrophoresis.PFGE สกัดดีเอ็นเอการย่อยอาหารดีเอ็นเอและ PFGE ได้ดำเนินการตาม
ขั้นตอนที่อธิบายไว้ในที่อื่น ๆ (25) แบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อถั่วเหลือง tryptic (Difco) -3% NaCl ถูกโอนไปยัง 5 มิลลิลิตร TSB-3% NaCl และบ่มค้างคืนที่ 37 ° Cwith เขย่าที่ 160 รอบต่อนาที เซลล์แบคทีเรียถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและ
resuspended ใน 2 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ที่มีขนาด 10 MM Tris, 100 มิลลิเมตร EDTA และ 1 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ที่ pH 8.0 ปลั๊ก Agarose ได้จัดทำขึ้นโดยการผสมปริมาตรที่เท่ากันของการระงับแบคทีเรียกับ 1.5% ต่ำละลาย agarose (เอฟเอ็มคอร์ปร็อกแลนด์,
เมน) เซลล์แบคทีเรียในปลั๊ก agarose ถูก lysed โดยการรักษาด้วยวิธีการแก้ปัญหาที่มี 1 มิลลิกรัมของไลโซไซม์ / ml และ 0.1% N-โซเดียม lauroyl sarcosine ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ได้รับการรักษาแล้วกับโปร K (0.5 mg / ml 0.5 M
EDTA และ 1% N-โซเดียม lauroyl sarcosine) ที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมงและล้างสามครั้ง (30 นาทีในแต่ละ) กับ TE บัฟเฟอร์ (10 มิลลิ tris- HCl 1 มิ EDTA) ส่วนหนึ่งของ Plug (4 9 1.2 มิลลิเมตร) ถูก equilibrated กับบัฟเฟอร์เอนไซม์และ
แล้ววางไว้ใน 100 มล. ของบัฟเฟอร์สดบรรจุ 10 U ของ SfiI (นิวอิงแลนด์ BioLabs เบเวอร์ลี่, Mass.) มันถูกบ่มแล้วที่ 4 ° C เป็นเวลา 16 ชั่วโมงและในที่สุดการย่อยอาหารได้รับการดำเนินการที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลาอีก 48 ชั่วโมง สูงน้ำหนักโมเลกุลเศษข้อ จำกัด ได้รับการแก้ไขในเจล agarose 1% 0.5% Tris-borate-EDTA บัฟเฟอร์โดยใช้เครื่องช่วยเชฟ (พ่อครัว DR ครั้งที่สอง;
. Bio-Rad ห้องปฏิบัติการริชมอนด์, แคลิฟอร์เนีย) เงื่อนไขการทำงาน 190 V สำหรับ 22.4 ชั่วโมงที่ 14 ° C มี 3-80 ของเวลาการเต้นของชีพจร เครื่องหมายแลมบ์ดาบันได PFGE (นิวอิงแลนด์ BioLabs) ถูกนำมาใช้ในการทำเครื่องหมายโมเลกุลขนาด หลังจาก electrophoresis
ได้ดำเนินการเจลมีการย้อมใน ethidium bromide (Sigma Co. , St. Louis, มิสซูรี.) destained ในน้ำกลั่นและการถ่ายภาพด้วยรังสียูวี transilluminator ที่ Flou-Link 312 (Vilber Lourmat, Torey ฝรั่งเศส)
ไวต่อความเครียดสิ่งแวดล้อม เพื่อตรวจสอบความไวต่อการที่จะเน้นสิ่งแวดล้อมที่แตกต่างกันกล่าวคืออุณหภูมิหรือเงื่อนไขของกรดอ่อนหรือความเค็มต่ำแบคทีเรียมาเพาะเลี้ยงใน 50 มล. ของโซเดียมคลอไรด์ Luria-Bertani น้ำซุป 3%
ขนาดกลางที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 16 ชั่วโมง V. parahaemolyticus เป็นสายพันธุ์ที่มีความเสี่ยงและจะมีการใช้งานได้อย่างรวดเร็วภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างจากที่อยู่อาศัยตามธรรมชาติของมันอยู่ในน้ำทะเลอุ่น (12) ปกตินี้ชีวิตของแบคทีเรียและ proliferates ใน
น้ำทะเลที่อบอุ่นกับการเจริญเติบโตที่ดีที่สุดที่ 35-37 ° C, 3% NaCl และความเป็นกรดเป็นกลาง (2) ช่วงเจริญเติบโตสูงสุดของเชื้อโรคนี้อยู่ประมาณ 5 ถึง 44 ° C, ค่า pH 4.8-11.0 (2) ที่อุณหภูมิ 13 ° C หรือเค็มด้านล่าง 0.5% NaCl ยับยั้งการเจริญเติบโตของ
เชื้อแบคทีเรีย (2) แม้ว่า V. parahaemolyticus ทนด่าง, การรักษาด้วยกรดอ่อน ๆ ที่ pH 4.4 เป็นตาย (26) สำหรับความเครียดอุณหภูมิวัฒนธรรมที่ถูกขยับไปทั้ง 4 หรือ 50 ° C (14) สำหรับความเครียดกรดอ่อน, วัฒนธรรมแบคทีเรียได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วงจร ( ส่วนตัวรอบ 20 biometra biomedizinische นักวิเคราะห์ GmbH , ไปตั้ง ttingen , เยอรมัน ) ปฏิกิริยาที่ผสมกันกับน้ำมัน 50 มิลลิลิตร เป็นหมัน และถูกบ่มในรอบความร้อน 95 องศา C ใน 5 นาทีดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ได้เพิ่ม และขยายพบว่า 40 รอบ ซึ่งแต่ละกำหนดดังนี้ : 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที , 48 องศา C เป็นเวลา 1 นาที 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที และสุดท้าย อีก 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที amplicons ถูกตรวจพบโดย 1.8%เจล electrophoresis.pfge . การสกัดดีเอ็นเอ การย่อย DNA และ PFGE มีการปฏิบัติตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ในที่อื่น ( 25 ) แบคทีเรียในอาหารวุ้นถั่วเหลือง ( difco ) – 3% NaCl มีการโอน 5 ml ของ TSB – 3 โซเดียมคลอไรด์บ่มค้างคืนที่ 37 องศา cwith สั่นที่ 160 รอบต่อนาที เซลล์แบคทีเรียที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการเหวี่ยงแยก และresuspended 2 ml ของบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยบริษัท 10 mM , 100 mM EDTA และ 1 mM NaCl ที่ pH 8.0 . ปลั๊ก ( เตรียมโดยการผสมปริมาณเท่ากันของ bacterial suspension ที่มีจุดหลอมเหลวต่ำ 1.5% , ร็อกแลนด์ ( FMC คอร์ป ,เมน ) เซลล์แบคทีเรียใน ( ปลั๊กเป็น lysed โดยการรักษาด้วยสารละลายที่ประกอบด้วย 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรและไลโซไซม์ 0.1 % n-sodium lauroyl ซาร์โคซีน 37 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์จึงรักษาด้วยโปรตีน K ( 0.5 mg / ml ใน 0.5 เมตรEDTA และ 1% n-sodium lauroyl ซาร์โคซีน ) ที่ 45 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมงและล้าง 3 ครั้ง ( 30 นาทีแต่ละ ) กับ TE บัฟเฟอร์ ( 10 มม. นอกจากนี้ HCl 1 mM EDTA ) หนึ่งส่วนของปลั๊ก ( 4 9 1.2 มม. ) คือ equilibrated กับเอนไซม์และบัฟเฟอร์แล้ววางไว้ใน 100 มิลลิลิตร ประกอบด้วย 10 U ของ sfii สดบัฟเฟอร์ ( อังกฤษ biolabs เบเวอรี่ มวล . ) จากนั้นบ่มที่อุณหภูมิ 4 องศา C เป็นเวลา 16 ชั่วโมงและในที่สุดการย่อยได้ใน 37 ° C ในอีก 48 ชั่วโมง สูงน้ำหนักโมเลกุลจำกัดชิ้นส่วนถูกแก้ไขใน 1% เจล 0.5% ทั้งนี้ บอเรตบัฟเฟอร์โดยใช้ EDTA เชฟ ( chef-dr II ; เครื่องมือไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , ริชมอนด์ , แคลิฟอร์เนีย ) การใช้เงื่อนไขเป็น 190 V สำหรับ 22.4 H ที่ 14 ° C , 3 ถึง 80 ของเวลาชีพจร เป็นบันไดส่งเครื่องหมาย ( อังกฤษ biolabs PFGE ) ใช้มาร์คขนาดโมเลกุล หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิสแสดง , เจลใช้ย้อมในทิเดียมโบรไมด์ ( Sigma Co . , เซนต์หลุยส์ , มิสซูรี่ ) , destained ในน้ำกลั่น และถ่ายภาพด้วยรังสี UV transilluminator , flou ลิงค์ 312 ( vilber lourmat torey , ฝรั่งเศส )เกิดความเครียดทางสิ่งแวดล้อม เพื่อศึกษาความไวต่อความเครียดต่างกัน สิ่งแวดล้อม เช่น อุณหภูมิ หรือสภาพของกรดอ่อน หรือความเค็มต่ำ , แบคทีเรียที่เพาะเลี้ยงใน broth ปริมาตร 50 มิลลิลิตร– 3% NaCl ลุเรียแบร์ตานิขนาดกลางที่ 37 ° C เป็นเวลา 16 ชั่วโมง tdh คือสายพันธุ์อ่อนแอ และจะได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างจากของธรรมชาติในทะเลน้ำอุ่น ( 12 ) โดยปกติ แบคทีเรีย และ proliferates ในชีวิตนี้น้ำทะเลอุ่น กับเติบโตสูงสุดที่ 35 กับ 37 ° C , 3% NaCl และกรดด่างเป็นกลาง ( 2 ) การเจริญเติบโตสูงสุดช่วงของเชื้อนี้ประมาณ 5 ถึง 44 องศา C , pH 4.8 ถึง 11.0 ( 2 ) อุณหภูมิที่ 13 ° C หรือความเค็มต่ำกว่า 0.5% NaCl ยับยั้งการเจริญเติบโตนี้แบคทีเรีย ( 2 ) แม้ว่า tdh คือด่างใจกว้าง , การรักษาด้วยกรดอ่อนๆ pH 4.4 เป็นตาย ( 26 ) สำหรับความเครียด อุณหภูมิ วัฒนธรรมที่ถูกเปลี่ยนให้ทั้ง 4 หรือ 50 ° C ( 14 ) สำหรับกรดอ่อนๆความเครียด เชื้อแบคทีเรียคือ