2.2.4. Control viruses and plasmid

2.2.4. Control viruses and plasmid DNA for the viral qPCR assays
Human adenovirus type 35 (HAdV35) and norovirus genogroup
II type 13 (NoV GGII.13) stocks were kindly donated by Dr. A. Allard
of the University of Umeå (Sweden) and were used as positive
process controls. On each sampling day, an extra sample was
collected and spiked with HAdV35 (105 viral particles/mL) as a
process control for flocculation, NA extraction and DNA quantification.
The NoV GGII.13 genome was also extracted from each
sample as a positive control for nucleic acid extraction and RNA
quantification (104 genome copies in each reaction of 5 mL).
Plasmid DNAwas used as a positive control and as a quantitative
standard. The hexon region (8961 bp) and the whole genome
(5130 bp) of HAdV41 and JCPyV Mad1, respectively, were cloned
into pBR322. To reduce the possibility of DNA contamination in the
laboratory, 10 mg of plasmid DNA was linearised with BamHI for
HAdV and NruI for JCPyV (Promega, Madison, WI) and the reaction
products were purified and quantified. The capsid protein region of
NoV GGII.13 cloned into the pTrueBlue®-Pvu II vector (kindly
donated by Dr. J. Vinje, CDC, Atlanta) was used as a qRT-PCR standard.
A total of 10 mg of this construct was linearised with XhoI
(Promega) to prevent contamination. Serial dilutions ranging from
100 to 105 molecules per 5 or 10 mL for RNA or DNA virus qPCR,
respectively, were performed with TE buffer. Standard dilutions
were distributed into tubes and stored at 80 C until use. Specific
primers and hydrolysis probes are described in Table 1. UltraPure™
DNase/RNase-Free distilledwaterwas used as a negative control for
the NA extraction and qPCR assays.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2.4 การควบคุมไวรัสและ plasmid DNA สำหรับ assays qPCR ไวรัสมนุษย์ adenovirus พิมพ์ 35 (HAdV35) และ norovirus genogroupหุ้น (NoV GGII.13) 13 ชนิด II ได้กรุณาบริจาค โดยดร. A. Allardของมหาวิทยาลัยของ Umeå (สวีเดน) และใช้เป็นค่าบวกการควบคุมกระบวนการ ในแต่ละวันการสุ่มตัวอย่าง ตัวอย่างการเสริมได้รวบรวม และ spiked กับ HAdV35 (105 ไวรัสอนุภาค/มล.) เป็นการการควบคุมกระบวนการ การ flocculation นาสกัดดีเอ็นเอนับกลุ่ม GGII.13 พ.ย.ยังถูกแยกจากแต่ละตัวอย่างที่เป็นตัวควบคุมค่าบวกสำหรับสกัดเอ็นเอและอาร์เอ็นเอนับ (104 กลุ่มสำเนาในแต่ละปฏิกิริยา 5 mL)DNAwas plasmid ที่ใช้ควบคุมค่าบวก และ เป็นการเชิงปริมาณมาตรฐาน ภูมิภาค hexon (8961 bp) และกลุ่มทั้งหมด(5130 bp) HAdV41 และ JCPyV Mad1 ตามลำดับ ถูกโคลนเป็น pBR322 เพื่อลดโอกาสการปนเปื้อน DNA ในการห้องปฏิบัติการ 10 มก.ของ plasmid DNA ถูกราคา linearised กับ BamHI สำหรับHAdV และ NruI JCPyV (Promega เมดิสัน WI) และปฏิกิริยาผลิตภัณฑ์ที่บริสุทธิ์ และ quantified ภูมิภาคโปรตีน capsid ของพ.ย. GGII.13 โคลนเป็น pTrueBlue ® Pvu II เวกเตอร์ (กรุณาบริจาค โดยดร.เจ Vinj e, CDC แอตแลนตา) ใช้เป็นมาตรฐาน qRT PCRจำนวน 10 มก.ของโครงสร้างนี้ถูก linearised กับ XhoI(Promega) เพื่อป้องกันการปนเปื้อน Dilutions ประจำตั้งแต่100-105 โมเลกุลต่อ 5 หรือ 10 mL สำหรับอาร์เอ็นเอหรือดีเอ็นเอไวรัส qPCRตามลำดับ ได้ทำพร้อมบัฟเฟอร์ TE มาตรฐาน dilutionsกระจายเข้าไปในท่อ และเก็บไว้ที่ 80 C จนใช้ เฉพาะไพรเมอร์และคลิปปากตะเข้ไฮโตรไลซ์ไว้ในตารางที่ 1 UltraPure ™ใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบสำหรับ distilledwaterwas DNase/RNase-ฟรีนาสกัดและ qPCR assays

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2.4 ไวรัสการควบคุมและพลาสมิดดีเอ็นเอสำหรับไวรัส qPCR การตรวจ
ชนิด adenovirus มนุษย์ 35 (HAdV35) และเชื้อ norovirus genogroup
สองประเภท 13 (พ.ย. GGII.13) หุ้นที่ได้รับบริจาคกรุณาโดยดร. อัลลาร์ก
ของมหาวิทยาลัยUmeå (สวีเดน) และถูกนำมาใช้ เป็นบวก
การควบคุมกระบวนการ ในแต่ละวันตัวอย่างตัวอย่างพิเศษถูก
เก็บรวบรวมและถูกแทงด้วย HAdV35 (105 อนุภาคไวรัส / มิลลิลิตร) เป็น
กระบวนการในการควบคุมตะกอนสกัด NA และการหาปริมาณดีเอ็นเอ.
จีโนม พ.ย. GGII.13 ยังถูกสกัดจากแต่ละ
ตัวอย่างเป็นตัวควบคุมในเชิงบวก สำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิกและ RNA
ปริมาณ (104 สำเนาจีโนมในการตอบสนอง 5 มิลลิลิตรในแต่ละ).
พลาสมิด DNAwas ใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวกและเชิงปริมาณเป็น
มาตรฐาน ภูมิภาค hexon (8961 bp) และทั้งจีโนม
(5130 bp) ของ HAdV41 และ JCPyV MAD1 ตามลำดับถูกโคลน
เข้า pBR322 เพื่อลดความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนดีเอ็นเอใน
ห้องปฏิบัติการ 10 mg ของพลาสมิดดีเอ็นเอเชิงเส้นกับ BamHI สำหรับ
HAdV และ NruI สำหรับ JCPyV (Promega, Madison, WI) และปฏิกิริยา
ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์และปริมาณ ภูมิภาคของโปรตีน capsid
พ.ย. GGII.13 โคลนเข้าไปในpTrueBlue® PVU-II เวกเตอร์ (กรุณา
บริจาคโดยดร. เจ Vinj? อี CDC, Atlanta) ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐาน qRT-PCR.
รวม 10 มิลลิกรัมนี้ สร้างได้รับการเชิงเส้นที่มี XhoI
(Promega) เพื่อป้องกันการปนเปื้อน เจือจางอนุกรมตั้งแต่
100 ถึง 105 โมเลกุลละ 5 หรือ 10 มิลลิลิตรสำหรับอาร์เอ็นเอหรือไวรัสดีเอ็นเอ qPCR,
ตามลำดับได้ดำเนินการกับบัฟเฟอร์ TE เจือจางมาตรฐาน
ถูกกระจายลงไปในท่อและเก็บไว้ที่? 80? C จนถึงการใช้งาน เฉพาะ
ไพรเมอร์และโพรบย่อยสลายได้อธิบายไว้ในตารางที่ 1 บริสุทธิ์™
DNase / RNase ฟรี distilledwaterwas ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบสำหรับ
การสกัดและการตรวจ NA qPCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2.4 . ไวรัส การควบคุมและพลาสมิดดีเอ็นเอสำหรับตรวจไวรัสอะดิโนไวรัสประเภทมนุษย์
qpcr 35 ( hadv35 ) และประเภท genogroup
2 รายการ ( 13 พ.ย. ggii . 13 ) หุ้นกรุณาบริจาคโดย ดร. อัล
ของมหาวิทยาลัยอุเมะปี ( สวีเดน ) และถูกใช้เป็นตัวควบคุม
ขั้นตอนในเชิงบวก ในแต่ละวัน สุ่ม ตัวอย่างพิเศษคือ
เก็บและถูกแทงด้วย hadv35 ( 105 ไวรัสอนุภาค / ml ) เป็น