A three-plasmid yeast expression sy

A three-plasmid yeast expression system utilizing the portable small ubiquitin-like modifier (SUMO) vector set combined with the efficient endogenous yeast protease Ulp1 was developed for production of large amounts of soluble functional protein in Saccharomyces cerevisiae. Each vector has a different selectable marker (URA, TRP, or LEU), and the system provides high expression levels of three different proteins simultaneously. This system was integrated into the protocols on a fully automated plasmid-based robotic platform to screen engineered strains of S. cerevisiae for improved growth on xylose. First, a novel PCR assembly strategy was used to clone a xylose isomerase (XI) gene into the URA-selectable SUMO vector and the plasmid was placed into the S. cerevisiae INVSc1 strain to give the strain designated INVSc1-XI. Second, amino acid scanning mutagenesis was used to generate a library of mutagenized genes encoding the bioinsecticidal peptide lycotoxin-1 (Lyt-1) and the library was cloned into the TRP-selectable SUMO vector and placed into INVSc1-XI to give the strain designated INVSc1-XI-Lyt-1. Third, the Yersinia pestis xylulokinase gene was cloned into the LEU-selectable SUMO vector and placed into the INVSc1-XI-Lyt-1 yeast. Yeast strains expressing XI and xylulokinase with or without Lyt-1 showed improved growth on xylose compared to INVSc1-XI yeast.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ระบบนิพจน์สาม plasmid ยีสต์ใช้วิเศษณ์ ubiquitin เหมือนขนาดเล็กแบบพกพา (ซูโม่) เวกเตอร์ชุดรวมกับโปรติเอสยีสต์ภายนอกที่มีประสิทธิภาพที่ Ulp1 ได้รับการพัฒนาสำหรับการผลิตของจำนวนมากของโปรตีนละลายน้ำได้ทำงานใน Saccharomyces cerevisiae แต่ละเวกเตอร์ที่มีเครื่องหมายเลือกที่แตกต่างกัน (URA, TRP หรือลิว), และระบบการให้ระดับสูงแสดงออกของโปรตีนแตกต่างกันที่สามพร้อมกัน ระบบนี้ถูกรวมไว้ในโพรโทคอบนอัตโนมัติใช้ plasmid หุ่นยนต์เพื่อจอสายพันธุ์วิศวกรรมของ S. cerevisiae เจริญเติบโตดีขึ้นบนสาร ครั้งแรก นวนิยาย PCR ประกอบกลยุทธ์ใช้ในการโคลนยีน isomerase (XI) สารลงในเวกเตอร์ URA เลือกซูโม่ และ plasmid ที่วางใน S. cerevisiae INVSc1 สายพันธุ์เพื่อให้สายพันธุ์ที่กำหนด INVSc1 XI ที่สอง กรดอะมิโนที่สแกน mutagenesis ถูกใช้เพื่อสร้างไลบรารีของยีน mutagenized รหัส bioinsecticidal เปปไทด์ lycotoxin-1 (Lyt-1) และไลบรารีโคลนลงในเวกเตอร์ซูโม่ TRP เลือก และวางลงใน INVSc1 XI เพื่อให้สายพันธุ์ที่กำหนด INVSc1-ซีอาน-Lyt-1 สาม Yersinia pestis xylulokinase ยีนโคลนลงในเวกเตอร์ซูโม่ลิวเลือก และวางลงในยีสต์ INVSc1-ซีอาน-Lyt-1 ยีสต์สายพันธุ์ที่ถ่ายทอดสีและ xylulokinase หรือ ไม่ Lyt-1 พบว่าเติบโตขึ้นบนสารเทียบกับยีสต์ INVSc1 XI

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สามพลาสมิดยีสต์ระบบการแสดงออกใช้พกพาขนาดเล็ก ubiquitin เหมือนปรับปรุง (SUMO) ชุดเวกเตอร์รวมกับที่มีประสิทธิภาพภายนอกยีสต์น้ำย่อย Ulp1 ได้รับการพัฒนาสำหรับการผลิตจำนวนมากของโปรตีนทำงานละลายใน Saccharomyces cerevisiae แต่ละเวกเตอร์มีเครื่องหมายเลือกที่แตกต่างกัน (URA, TRP หรือ LEU) และระบบให้ระดับการแสดงออกสูงของสามโปรตีนที่แตกต่างกันไปพร้อม ๆ กัน ระบบนี้ถูกรวมเข้ากับโปรโตคอลบนโดยอัตโนมัติอย่างเต็มที่พลาสมิดแพลตฟอร์มหุ่นยนต์ไปยังหน้าจอสายพันธุ์วิศวกรรมของ S. cerevisiae สำหรับการเจริญเติบโตที่ดีขึ้นในไซโล แรกนวนิยาย PCR กลยุทธ์การชุมนุมถูกใช้ในการโคลนไซโล isomerase (จิน) ยีนเข้าไปในเวกเตอร์ SUMO URA เลือกและพลาสมิดที่ถูกวางอยู่ในสายพันธุ์ S. cerevisiae INVSc1 ที่จะให้สายพันธุ์ที่ได้รับมอบหมาย INVSc1-XI ประการที่สองกรดอะมิโนสแกนฉับถูกใช้ในการสร้างห้องสมุดของยีน mutagenized เข้ารหัสเปปไทด์ bioinsecticidal lycotoxin-1 (Lyt-1) และห้องสมุดที่เป็นโคลนเข้าไปใน TRP เลือก SUMO เวกเตอร์และวางลงใน INVSc1-จินที่จะให้สายพันธุ์ที่ได้รับมอบหมาย INVSc1-XI-Lyt-1 ประการที่สามการ xylulokinase ยีน Yersinia pestis เป็นโคลนเข้าเวกเตอร์ SUMO LEU เลือกและวางลงใน INVSc1-XI-Lyt-1 ยีสต์ สายพันธุ์ยีสต์แสดง XI และ xylulokinase มีหรือไม่มี Lyt-1 มีการเจริญเติบโตที่ดีขึ้นในไซโลเมื่อเทียบกับ INVSc1-XI ยีสต์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 สายพันธุ์ยีสต์ที่ใช้ระบบยูบิควิตินการแสดงออกแบบพกพาขนาดเล็กเช่น ส่วนขยาย ( ซูโม่ ) เวกเตอร์ชุดรวมกับประสิทธิภาพในยีสต์โปรตีน ulp1 ถูกพัฒนาขึ้นสำหรับการผลิตจำนวนมากของโปรตีนที่ทำหน้าที่ใน Saccharomyces cerevisiae . เวกเตอร์ที่แตกต่างกันแต่ละที่มีเครื่องหมาย ( ส่วนตัวเลือก , หรือลูก ) , และระบบจะให้ระดับการแสดงออกของโปรตีนที่แตกต่างกันสามสูงพร้อมกัน ระบบนี้ได้ถูกรวมเข้ากับโปรโตคอลบนพลาสมิดที่ใช้หุ่นยนต์อัตโนมัติแพลตฟอร์มหน้าจอวิศวกรรมสายพันธุ์ของ S . cerevisiae เพื่อปรับปรุงการเจริญเติบโตในไซโลส . แรก , นิยาย PCR ประกอบกลยุทธ์ใช้โคลนเอนไซม์ไอโซเมอเรส ( Xi ) ยีนเข้าไปในส่วนตัวเลือก ซูโม่เวกเตอร์และพลาสมิดอยู่ในสายพันธุ์ S . cerevisiae invsc1 ให้เมื่อย เขต invsc1 Xi ประการที่สอง การสแกนเป็นกรดอะมิโนใช้ในการสร้างห้องสมุดของ mutagenized ยีนส์ lycotoxin-1 เปปไทด์ bioinsecticidal การเข้ารหัส ( lyt-1 ) และห้องสมุดถูกโคลนเข้าสู่ TRP เลือกซูโม่เวกเตอร์และอยู่ใน invsc1 Xi ให้เมื่อย เขต invsc1-xi-lyt-1 . ประการที่สาม เยอซิเนีย pestis xylulokinase ยีนโคลนในลิวเลือกซูโม่เวกเตอร์และวางไว้ในยีสต์ invsc1-xi-lyt-1 . ยีสต์สายพันธุ์แสดง 11 xylulokinase ที่มีหรือไม่มี lyt-1 แสดงการปรับปรุงการเจริญเติบโตในไซโลส เทียบกับ invsc1 Xi ยีสต์