Double-stranded DNAcopies of three

Double-stranded DNA
copies of three chloroplast markers, trnK/matK, trnL-F intergenic spacer, and
psbA-trnH intergenic spacer, and one nuclear marker, ITS/5.8S, were amplified
with universal primers (Taberlet et al., 1991; Hu et al., 2000, 2002; Sang et al., 1997;
Wojciechowski et al., 1993) (Table 3-2). For the trnK/ matK amplification, the PCRs,
using a protocol modified from Hu et al. (2000), were carried out in a 25 μL
reaction mixture, which contained 1 μL (4–10 μg) of total DNA, with 1.0 μmol/L
of every forward and reverse primer, 200 μmol/L dNTP, 2.0 μmol/L magnesium
chloride, 1 μL of bovine serum albumin (10 mg/mL) (Promega, Madison, Wisconsin,
USA) and 1 unit of Taq polymerase (Qiagen, Venlo, Netherlands). Typical conditions
for PCR were 4 min at 94°C for initial denaturation, followed by 40 cycles of 45 s
at 94°C, 90 s at 48°–50°C for annealing, 90 s to 2 min at 72°C for primer extension,
depending on the fragment length, and after the cycles, a final 7 min incubation
at 72°C was employed to complete the reaction. The internal transcribed spacer
(ITS) regions 1, 2, and 5.8S gene were amplified using the same reagents and similar
conditions described in Wojciechowski et al. (1993, 1999). The primer “ITS5” was
used (occasionally, primer “ITS1” was also used instead of “ITS5”) as a forward
primer and “ITS4” as a reverse primer. The primers “ITS2” and “ITS3” were used
alternatively in some species, which could not be amplified directly by the two
primers mentioned. Sequence amplification was done in 50 μL reaction with a
lower denaturation temperature (95°C), a higher temperature for annealing (49°C),
and a longer extension time (90 s) than mentioned in Wojciechowski et al. (1993,
1999). To get rid of ambiguous or paralogous sequences, often found during the
amplification of nuclear DNA, we used cloning techniques in some species that
showed polymorphism. The PCR copies were individually cloned using TOPO
TA Cloning Kits (Invitrogen, San Diego, California, USA). Five to 10 putative
clones were selected and sequenced and then compared manually. Results from
these experiments showed that heterogeneity among repeat copies is minimal or

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขนคู่ดีเอ็นเอคัดลอกเครื่องหมายคลอโรพลาสต์ trnK/matK, trnL F intergenic เป็นตัวเว้น วรรค 3 และpsbA-trnH เป็นตัวเว้นวรรค intergenic และเครื่องหมายนิวเคลียร์หนึ่ง ของ / 5.8S ถูกขยายมีไพรเมอร์สากล (Taberlet et al., 1991 Hu et al., 2000, 2002 ป่าซางและ al., 1997Wojciechowski et al., 1993) (ตาราง 3-2) สำหรับการ trnK / matK ขยาย PCRsโดยใช้โพรโทคอที่ปรับเปลี่ยนจาก Hu et al. (2000), ได้ดำเนินการ 25 μLปฏิกิริยาผสม ซึ่งประกอบด้วย μL 1 (4-10 μg) ของดีเอ็นเอรวม กับ 1.0 μmol/Lทุกรองพื้นไปข้างหน้า และย้อนกลับ dNTP μmol/L 200 แมกนีเซียม μmol 2.0 Lคลอไรด์ μL 1 ของวัว serum albumin (10 mg/mL) (Promega เมดิสัน วิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) และพอลิเมอเรส Taq (Qiagen ใน Venlo เนเธอร์แลนด์) 1 หน่วย เงื่อนไขทั่วไปสำหรับ PCR ได้ 4 นาทีที่ 94° C สำหรับ denaturation เริ่มต้น ตามรอบ 40 ของ 45 sที่ 94° C, 90 s ที่ 48° 50° C สำหรับการอบเหนียว 90 s ไป 2 นาทีที่ 72° C สำหรับส่วนขยายของสีรองพื้นขึ้นอยู่ กับความยาวส่วน และ วงจร บ่ม 7 นาทีสุดท้ายที่ 72° C ถูกจ้างไปทำปฏิกิริยา เป็นตัวการเว้นวรรคทับภายในยีน (ของ) ภาค 1, 2 และ 5.8S มีเอาต์ใช้ reagents เหมือน และคล้ายคลึงกันเงื่อนไขที่อธิบายไว้ใน al. et Wojciechowski (1993, 1999) เป็นสีรองพื้น "ITS5"ใช้ (บางครั้ง รองพื้น "ITS1" ถูกใช้แทน "ITS5") เป็นแบบไปข้างหน้าสีรองพื้นและ "ITS4" เป็นแนวทางสำหรับการกลับรายการ ใช้ไพรเมอร์ "ITS2" และ "ITS3"หรือ ในบางชนิด ซึ่งอาจไม่ขยายได้โดยตรง โดยทั้งสองไพรเมอร์กล่าว ขยายลำดับภายใน 50 μL ปฏิกิริยาด้วยการอุณหภูมิต่ำกว่า denaturation (95° C), อุณหภูมิสูงสำหรับหลอม (49° C),และขยายเวลาอีกต่อไป (90 s) มากกว่าที่กล่าวถึงใน Wojciechowski et al. (19931999) การกำจัดลำดับชัดเจน หรือ paralogous มักจะพบในระหว่างการขยายเอ็นนิวเคลียร์ เราใช้เทคนิคการโคลนในบางชนิดที่โพลิมอร์ฟิซึมแสดง สำเนา PCR ได้แยกโคลนใช้เดินตาโคลนชนิดติดตั้งอิสระ (Invitrogen, San Diego แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) 5 ถึง 10 putativeโคลนถูกเลือก และเรียงลำดับ และเปรียบเทียบด้วยตนเองแล้ว ผลลัพธ์จากการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่า heterogeneity ระหว่างสำเนาซ้ำน้อยที่สุด หรือ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

คู่เกลียวดีเอ็นเอ
ชุดของสามคลอเครื่องหมาย trnk / matk trnl-f ส่า , spacer และ
psba trnh ส่า spacer และนิวเคลียร์ Marker ของ / 5.8s , ขยาย
กับไพรเมอร์สากล ( taberlet et al . , 1991 ; Hu et al . , 2000 , 2002 ; ซาง et al . , 1997 ;
wojciechowski et al . , 1993 ) ( ตาราง 3-2 ) สำหรับ trnk / matk amplification , pcrs
โดยใช้โปรโตคอล , ดัดแปลงจาก Hu et al . ( 2000 )ได้ดำเนินการใน 25 μ L
ปฏิกิริยาผสม ซึ่งมีอยู่ 1 μ L ( 4 – 10 μกรัม ) ของดีเอ็นเอทั้งหมด 1.0 μ mol / l
ของทุก ๆ ไปข้างหน้าและย้อนกลับ ไพรเมอร์ , 200 μ mol / L dntp 2.0 μ mol / l แมกนีเซียมคลอไรด์μ
1 L ) เซรั่ม อัลบูมิน ( 10 mg / ml ) ( promega เมดิสัน วิสคอนซิน
สหรัฐอเมริกา ) และ 1 หน่วยของทัค พอลิเมอเรส ( QIAGEN Venlo , เนเธอร์แลนด์ ) ทั่วไปเงื่อนไข
สำหรับวิธี PCR จำนวน 4 นาทีที่ 94 ° C ( เริ่มต้น ตามด้วย 40 รอบ 45 S
ที่ 94 ° C , 90 วินาทีที่ 48 °– 50 ° C สำหรับการอบ , 90 s 2 นาทีที่ 72 ° C primer extension
ขึ้นอยู่กับขนาดความยาวหลังรอบสุดท้าย 7 นาทีที่ 72 ° C บ่ม
ใช้เพื่อให้ปฏิกิริยา ภายในและ spacer
( ของมัน ) ภาค 1 , 2 และ 58 ) ใช้สารเคมีของยีนเดียวกันและเหมือนกัน
เงื่อนไขที่อธิบายไว้ใน wojciechowski et al . ( พ.ศ. 2542 ) ไพรเมอร์ " its5 "
( บางครั้งใช้ไพรเมอร์ " its1 ” ก็ใช้แทน " its5 " ) เป็น primer ข้างหน้า
" its4 " เป็นแบบไพรเมอร์ ไพรเมอร์ " its2 " และ " its3 " ใช้
หรือในบางชนิด ซึ่งอาจจะขยายได้โดยตรง โดยสอง
ไพรเมอร์กล่าว แบบลำดับ ได้ 50 μ L ปฏิกิริยากับ
ลดอุณหภูมิ 95 องศา ( C ) อุณหภูมิที่สูงขึ้นสำหรับการอบ ( 49 ° C )
และต่อเวลาอีกต่อไป ( 90 ) กว่าที่กล่าวถึงใน wojciechowski et al . ( 1993
1999 ) กำจัดความกำกวมหรือ paralogous ลำดับ มักพบในช่วง
แบบนิวเคลียร์ดีเอ็นเอ เราใช้เทคนิคบางชนิดที่
โคลนนิ่งพบ polymorphism . การตรวจแบบ PCR ใช้เล่ม Topo
ตาชุดโคลน ( Invitrogen ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) ห้า 10 โคลนซึ่ง
เลือกลำดับแล้วและเปรียบเทียบด้วยตนเอง ผลจากการทดลองดังกล่าวแสดงให้เห็นว่าสามารถ
ระหว่างสำเนาซ้ำน้อยที่สุด หรือ