2. Materials and methodsA total of

2. Materials and methods
A total of 60 menstrual blood samples were obtained from healthy females
(n = 8) on cotton swabs (10 samples of day 1, 21 samples of day 2, 18 samples of
day 3 and 11 samples of day 4 of menstruation). After transfer to the laboratory
the samples were stored at room temperature for 4 weeks (minimum) to 11
weeks (maximum) protected from sunlight.
A total of 32 non-menstrual blood samples from 8 males and 8 females
obtained by venous puncture and immediately transferred to cotton swabs
served as controls. Furthermore, eight vaginal swabs and eight semen samples
collected on cotton were included in the study.
All donors gave their informed consent prior to their inclusion in the study.
RNA was isolated as described previously [1]. Reverse transcription was
performed using the Sensiscript Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and random
hexamer primer (Promega, Madison, WI) in a total reaction volume of 10 ml.
For real time-PCR 1 ml cDNAwas used in a total reaction volume of 20 ml.
PCR was performed with pre-designed Taqman primer-probe sets (Applied
Biosystems, Darmstadt, Germany) for MMP-7 (assay-ID: Hs00159163_m1;
amplicon size 101 bp) and GAPDH (assay-ID: Hs99999905_m1; amplicon size
122 bp), and runwith theTaqmanUniversal PCRMasterMix on anABI Sequence
Detection System 7000 according to the manufacturers instructions (annealing
temperature 60 8C). Although in previous studiesMMP-11 has been preferred as
marker over MMP-7 [1], primer-probe sets generated for MMP-11 provided
inconsistent results so that the preformatted MMP-7 assay was chosen instead.
For consecutive dilution experiments cDNA from six menstrual blood and
control blood samples was diluted in 1:5 steps. The dilutions were used for real
time-PCR.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2 วัสดุและวิธีการ
จำนวน 60 ตัวอย่างเลือดประจำเดือนที่ได้รับจากหญิงที่มีสุขภาพดี
(n = 8) บนก้อนสำลี (10 ตัวอย่างวันที่ 1, 21 ตัวอย่างของวันที่ 2, 18 ตัวอย่าง
วันที่ 3 และ 11 ตัวอย่างของวันที่ 4 ของการมีประจำเดือน) หลังจากการถ่ายโอนไปยังห้องปฏิบัติการ
ตัวอย่างถูกจัดเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 4 สัปดาห์ (ขั้นต่ำ) ถึง 11
สัปดาห์ (สูงสุด) ป้องกันจากแสงแดด.
ทั้งหมด 32 ตัวอย่างเลือดที่ไม่ประจำเดือน 8 จากเพศชายและเพศหญิง 8
ที่ได้จากการเจาะเลือดดำและโอนทันทีเพื่อฝ้าย
ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม นอกจากนี้แปด swabs ในช่องคลอดและแปดน้ำอสุจิที่เก็บรวบรวมตัวอย่าง
บนผ้าฝ้ายถูกรวมอยู่ในการศึกษา.
บริจาคทั้งหมดให้ความยินยอมของพวกเขาก่อนที่จะมีการรวมของพวกเขาในการศึกษา.
อาร์เอ็นเอที่แยกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [1]ถอดความกลับเป็น
ดำเนินการโดยใช้ชุด sensiscript (QIAGEN, ฮิลเดน, เยอรมนี) และไพรเมอร์แบบสุ่ม
hexamer (Promega, แมดิสัน) ในปริมาณปฏิกิริยาทั้งหมด 10 มล. .
จริงเวลา pcr cdnawas 1 มล. ที่ใช้ในทั้งหมด . ปริมาณการเกิดปฏิกิริยาจาก 20 มล.
pcr ได้ดำเนินการกับก่อนการออกแบบ TaqMan ชุดไพรเมอร์โพรบ (ใช้
ศาสตร์, ดาร์มสตัด, เยอรมนี) เพื่อ MMP-7 (การทดสอบ-ID: hs00159163_m1;
ขนาด 101 bp amplicon) และ gapdh (การทดสอบ-ID: hs99999905_m1; ขนาด amplicon
122 bp) และ runwith thetaqmanuniversal pcrmastermix ในระบบลำดับ anabi
7000 การตรวจสอบเป็นไปตามคำแนะนำของผู้ผลิต (หลอมอุณหภูมิ 60
8c) แม้ว่าในหน้าที่ studiesmmp-11 ได้รับการต้องการเป็นเครื่องหมาย
กว่า MMP-7 [1] ชุดไพรเมอร์โพรบที่สร้างขึ้นสำหรับ MMP-11 ให้
ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกันเพื่อให้จัดรูปแบบไว้ MMP-7 ทดสอบได้รับการแต่งตั้งแทน.
เพื่อ cDNA จากหกเลือดประจำเดือนทดลองเจือจางติดต่อกันและ
ควบคุมตัวอย่างเลือดถูกเจือจางในขั้นตอน 01:05 เจือจางถูกนำมาใช้จริง
เวลา pcr

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
จำนวนตัวอย่างเลือดประจำเดือนที่ 60 ได้รับจากหญิงสุขภาพ
(n = 8) บนฝ้าย swabs (ตัวอย่าง 10 วัน 1 ตัวอย่างวันที่ 2 ตัวอย่าง 18 21
ตัวอย่างวันที่ 3 และ 11 วันที่ 4 ของประจำเดือน) หลังจากโอนย้ายไปยังห้องปฏิบัติการ
ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องใน 4 สัปดาห์ (เป็นอย่างน้อย) 11
สัปดาห์ (สูงสุด) ได้รับการป้องกันจากแสงแดด
จำนวน 32 ตัวอย่างไม่ใช่ประจำเดือนเลือดจาก 8 ชายและหญิง 8
รับ โดยเจาะต่อหลอดเลือดดำ และโอนย้ายไปฝ้าย swabs ทันที
เป็นตัวควบคุม นอกจากนี้ swabs แปดช่องคลอดและน้ำเชื้อตัวอย่างที่ 8
รวบรวมบนฝ้ายในศึกษา
ผู้บริจาคทั้งหมดให้แจ้งความยินยอมของพวกเขาก่อนที่จะได้ในการศึกษา
อาร์เอ็นเอที่แยกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [1] Transcription กลับถูก
ใช้ Sensiscript Kit (Qiagen, Hilden เยอรมนี) และสุ่ม
พื้น hexamer (Promega เมดิสัน WI) ปริมาณปฏิกิริยารวมของ 10 ml.
สำหรับ PCR เวลาจริง 1 ml cDNAwas ใช้ปริมาณปฏิกิริยารวมของ 20 ml.
ทำ PCR กับชุดรองพื้นโพรบ Taqman มาก่อน (ประยุกต์
Biosystems ดาร์มส เยอรมนี) 7 MMP (ทดสอบ ID: Hs00159163_m1;
amplicon ขนาด 101 bp) และ GAPDH (ทดสอบ ID: Hs99999905_m1; amplicon ขนาด
122 bp), และ runwith theTaqmanUniversal PCRMasterMix บน anABI ลำดับ
7000 ระบบตรวจสอบตามคำแนะนำของผู้ผลิต (การอบเหนียว
อุณหภูมิ 60 8C) แม้ว่าใน 11 studiesMMP ก่อนหน้านี้ได้ต้องเป็น
เครื่องหมายมากกว่า MMP-7 [1], ชุดรองพื้นโพรบที่สร้างขึ้นสำหรับ MMP-11 ให้
ไม่สอดคล้องกันผลที่ทดสอบ MMP-7 แปลงถูกเลือกแทน
สำหรับ cDNA ทดลองเจือจางเนื่องจากเลือดประจำเดือนที่หก และ
ควบคุมเลือดตัวอย่างที่ผสมในขั้นตอนที่ 1:5 Dilutions ที่ใช้ตัวจริง
PCR ครั้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
รวม 60 มีประจำเดือนเลือดตัวอย่างได้จากอาหารเพื่อ สุขภาพ ผู้หญิง
( N = 8 )บนผ้าฝ้าย swabs ( 10 ตัวอย่างของวันที่ 1 , 21 ตัวอย่างของวันที่ 2 , 18 ตัวอย่างของ
วันที่ 3 และ 11 ตัวอย่างของวันที่ 4 ของระดู) หลังจากนั้นใช้บริการรับส่งเพื่อไปยังห้องทดลองตัวอย่าง
ซึ่งจะช่วยให้ได้เก็บไว้ใน อุณหภูมิ ห้องสำหรับ 4 สัปดาห์(ต่ำสุด)ถึง 11
สัปดาห์(สูงสุด)จะได้รับการป้องกันจากแสงแดด.
จำนวนรวม 32 ตัวอย่างเลือดไม่มีประจำเดือนจาก 8 ชายและหญิง 8
ซึ่งจะช่วยได้รับโดยเจาะทำ CPR ในทันทีและจะพาท่านไปส่งถึงยัง swabs
ซึ่งจะช่วยจัดให้บริการผ้าฝ้ายและการควบคุม ยิ่งไปกว่านั้นแปด swabs อุ้งเชิงกรานและแปดน้ำอสุจิตัวอย่าง
ถูกเก็บไว้ที่ทำจากผ้าฝ้ายรวมอยู่ในการศึกษาที่.
ผู้บริจาคทั้งหมดให้ได้รับความยินยอมให้ทราบก่อนถึงการรวมของพวกเขาในการศึกษาที่.
rna ได้แยกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[ 1 ]การถอดสคริปต์ย้อนกลับเป็น
ซึ่งจะช่วยดำเนินการโดยใช้ sensiscript ชุด( qiagen , hilden ,เยอรมัน)และสุ่ม
hexamer เชื้อปะทุ( promega , Madison , WI )ในที่รวมการตอบสนองระดับเสียงของ 10 มล..
สำหรับแบบเรียลไทม์ - pcr 1 มล. cdnawas ใช้ในที่รวมการตอบสนองระดับเสียงของ 20 มล..
pcr ได้ดำเนินการด้วยการออกแบบ taqman Primer - ตรวจสอบชุด(ใช้
biosystems , darmstadt ,เยอรมนี)สำหรับจัด - 7 (สอบ - ID : HS 00159163 _m 1 ;
amplicon ขนาด 101 BP )และ gapdh (สอบ - ID : HS 99999905 _m 1 ; amplicon ขนาด
122 BP ),และ runwith thetaqmanuniversal pcrmastermix บน anabi ตามลำดับ
การตรวจจับระบบ 7000 ตามที่ผู้ผลิตคำแนะนำ( annealing
อุณหภูมิ 608 c ) แม้ว่าใน studiesmmp ก่อนหน้า - 11 ได้รับการที่ต้องการเป็น
เครื่องหมายมากกว่าจัด - 7 [ 1 ],ตั้งค่าเชื้อปะทุ - ยอนสร้างขึ้นสำหรับจัดให้บริการ - 11
ผลลัพธ์ที่ไม่สม่ำเสมอจึงพยายามจัดเพียบพร้อมด้วย - 7 ได้รับการเลือกสรร cdna แทน.
สำหรับการทดลองเจือจางติดต่อกันจากเลือดมีประจำเดือนและตัวอย่างเลือด
การควบคุมก็เจือจางใน 1 : 5 ขั้นตอน dilutions ที่ถูกนำไปใช้เพื่อจริง
เวลา - pcr.