Molecular characterizationGenomic D

Molecular characterization

Genomic DNA extraction.
Genomic DNA extraction was carried out by colony polymerase chain reaction
(PCR) method. Colony from fresh bacterial culture was properly mixed in 20 ml tris(hydroxymethyl) aminomethane–ethylenediaminetetraacetic acid buffer and heated at 95C for 10 min in a PCR machine.
After PCR, centrifugation was carried out at
8000 r/min for 5 min, and the supernatant was taken as genomic DNA.


PCR amplification of 16S rRNA gene.
For 16S ribosomal RNA (rRNA) amplification of isolated bacterial strains, oligonucleotide primers, 9F (GAGTTTGAT CCTGGCTCAG) and 1510R (GGCTACCTTGTTACGA) were used as described by Ahmed et al. (2007). The DNA template without inoculation was used as the negative control. Thermal cycling was performed by initial denaturation at 94C for 2 min, 35 cycles of denaturation at 94C for 1 min, annealing at 50C for 1 min, and elongation at 72C for 1 min. Cycling was done at final elongation step at 72C for 10 min. The PCR amplified products were separated on 0.8% agar-
ose gel and observed under gel doc system.

Phylogenetic analysis.
The amplified PCR products of 16S rRNA gene of isolated bacterial strains were sequenced by primers 27F (50-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30) and 1492R (50-ACCTTGTTAC-GACTT-30) using a commercial service of Macrogen Inc. (Korea; www.dna.macrogen.com)). The sequences obtained were compared with the sequences present in the DNA DataBank of Japan (DDBJ)/the European Molecular Biology Laboratory (EMBL)/GenBank databases by the BLAST program of the National Centre of Biotechnology Information. The sequences of strains were also retrieved for constructing the phylogenetic trees. Phylogenetic analysis was done by MEGA version 5. Phylogenetic tree was made from unambiguously arranged nucleotides using an algorithm (Saitouand Nei, 1987).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จำแนกลักษณะโมเลกุลสกัดดีเอ็นเอที่ออก สกัดดีเอ็นเอที่ออกดำเนินการ โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสอาณานิคมวิธีการ (PCR) อาณานิคมจากวัฒนธรรมแบคทีเรียสดถูกผสมใน 20 ml tris(hydroxymethyl) aminomethane – ethylenediaminetetraacetic บัฟเฟอร์กรด และความร้อน 95 c เป็นเวลา 10 นาทีในเครื่อง PCRหลังจาก PCR หมุนเหวี่ยงได้ดำเนินการที่8000 r/min 5 นาที และ supernatant ที่ถ่ายเป็นดีเอ็นเอที่ออกกระบือของยีน 16S rRNA สำหรับ 16S ribosomal RNA (rRNA) ขยายสายพันธุ์แบคทีเรียที่แยก oligonucleotide ไพรเมอร์ 9F (GAGTTTGAT CCTGGCTCAG) และ 1510R (GGCTACCTTGTTACGA) ถูกนำมาใช้ตามที่อธิบายไว้โดย Ahmed et al. (2007) ดีเอ็นเอแม่แบบโดยไม่กักบริเวณถูกใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ ความร้อนขี่จักรยานทำ โดยเริ่มแปรสภาพ 94 c เป็นเวลา 2 นาที 35 รอบของการแปรสภาพที่ 94C 1 นาที หลอม 50 c เป็นเวลา 1 นาที และการยืด 72 c เป็นเวลา 1 นาทีขี่จักรยานทำยืดตัวสุดท้ายในขั้นตอนที่ 72C 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ขยายแยกตัววุ้น 0.8%-ose เจ และปฏิบัติภายใต้ระบบ doc เจลการวิเคราะห์ผล ขยายผลิตภัณฑ์ PCR ของ 16S rRNA ยีนสายพันธุ์แบคทีเรียที่แยกได้เรียงลำดับตามไพรเมอร์ 27F (50-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30) และ 1492R (50-ACCTTGTTAC-GACTT-30) โดยใช้ผู้ให้บริการของ Macrogen Inc. (เกาหลี www.dna.macrogen.com)) ลำดับที่ได้รับมาเปรียบเทียบกับลำดับที่อยู่ในดีเอ็นเอสกายวอล์คเกอร์กลับของญี่ปุ่น (DDBJ) / ห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยาในยุโรป (EMBL) / GenBank ฐานข้อมูล โดยโปรแกรมระเบิดของศูนย์แห่งชาติของเทคโนโลยีชีวภาพข้อมูล ลำดับของสายพันธุ์ถูกยังเรียกการสร้างต้นไม้ผล ผลการวิเคราะห์ทำ โดยล้านรุ่น 5 ต้นทางทำจากนิวคลีโอไทด์เรียงไม่กำกวมโดยใช้อัลกอริทึม (เล่ง Saitouand, 1987)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โมเลกุลลักษณะ

จีโนมสกัดดีเอ็นเอ.
สกัดดีเอ็นเอจีโนมได้ดำเนินการโดยปฏิกิริยาลูกโซ่อาณานิคมโพลิเมอร์
(PCR) วิธีการ อาณานิคมจากการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียสดผสมถูกต้องใน 20 มล. ทริสเรทติ้ง (hydroxymethyl) aminomethane-Ethylenediaminetetraacetic บัฟเฟอร์กรดและให้ความร้อนที่ 95C เป็นเวลา 10 นาทีในเครื่อง PCR.
หลังจาก PCR การหมุนเหวี่ยงได้ดำเนินการที่
8000 รอบ / นาทีเป็นเวลา 5 นาทีและ ใสถูกนำมาเป็นดีเอ็นเอ.


ขยาย PCR ของ 16S rRNA ยีน.
สำหรับ 16S โซมอลอาร์เอ็นเอ (rRNA) การขยายของสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียที่แยกไพรเมอร์ oligonucleotide, 9F (GAGTTTGAT CCTGGCTCAG) และ 1510R (GGCTACCTTGTTACGA) ถูกนำมาใช้ตามที่อธิบายไว้โดยอาเหม็ดอัลเอต (2007) แม่แบบโดยไม่ต้องฉีดวัคซีนดีเอ็นเอถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ การขี่จักรยานการระบายความร้อนได้ดำเนินการโดย denaturation เริ่มต้นที่ 94C เป็นเวลา 2 นาที 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94C เป็นเวลา 1 นาทีหลอมที่ 50C เป็นเวลา 1 นาทีและการยืดตัวที่ 72C เป็นเวลา 1 นาที ขี่จักรยานได้ทำในขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายที่ 72C เป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ขยายถูกแยกบน 0.8% agar-
เจล OSE และสังเกตภายใต้ระบบเจล Doc.

phylogenetic วิเคราะห์.
ผลิตภัณฑ์ PCR ขยายของยีน 16S rRNA ของแบคทีเรียบางแห่งมีลำดับขั้นตอนโดยไพรเมอร์ 27 (50 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30) และ 1492R ( 50 ACCTTGTTAC-GACTT-30) ใช้บริการในเชิงพาณิชย์ของ Macrogen อิงค์ (เกาหลี www.dna.macrogen.com)) ลำดับที่ได้มาเทียบกับลำดับที่มีอยู่ในดีเอ็นเอ Databank ญี่ปุ่น (DDBJ) / ยุโรปอณูชีววิทยาทดลอง (EMBL) / ฐานข้อมูล GenBank โดยโปรแกรมการระเบิดของศูนย์แห่งชาติของข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ ลำดับสายพันธุ์ก็ถูกดึงมาสำหรับการสร้างต้นไม้ phylogenetic วิเคราะห์ทำโดยรุ่น MEGA 5. phylogenetic ต้นไม้ทำจากนิวคลีโอจัดอย่างไม่น่าสงสัยโดยใช้อัลกอริทึม (Saitouand Nei, 1987)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ลักษณะทางโมเลกุลการสกัดดีเอ็นเอ .การสกัดดีเอ็นเอกระทำโดยอาณานิคมการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส( PCR ) วิธี อาณานิคมจากเพาะเชื้อสดผสมอย่างถูกต้องโดย 20 ml ( ซี ) และกรดอะมิโนมีเธนบอนเฟอร์และให้ความร้อนที่ 95c เป็นเวลา 10 นาทีในการเพิ่มเครื่องจักรหลังจากตรวจพบว่าใน 38 R / นาทีเป็นเวลา 5 นาที และนำเอามาเป็นจีโนมดีเอ็นเอการเพิ่มปริมาณของยีน 16S rRNA ยีน .สำหรับ 16S ไรโบโซมอล อาร์เอ็นเอ ( rRNA ) แบบแยกสายพันธุ์ของแบคทีเรีย ซึ่งไพรเมอร์ 9f ( gagtttgat cctggctcag ) และ 1510r ( ggctaccttgttacga ) ที่ใช้อธิบายโดยอาเหม็ด et al . ( 2007 ) ดีเอ็นเอแม่แบบปราศจากเชื้อที่ใช้เป็นตัวควบคุมลบ ความร้อนจักรยานทำโดยเริ่มต้นที่ 94c ( 2 นาที 3 รอบใน 1 นาที ( 94c annealing ที่ 50c นาน 1 นาที และเวลาที่ 72c 1 นาที จักรยานถูกทำในขั้นตอนสุดท้ายในการ 72c 10 นาทีเพื่อขยายผลิตภัณฑ์ที่ 0.8% วุ้น - แยกกันหรือเจลและตรวจสอบภายใต้ระบบหมอเจลการวิเคราะห์ phylogenetic .การขยาย PCR ของยีน 16S rRNA ของผลิตภัณฑ์แยกสายพันธุ์แบคทีเรียเป็นลำดับโดยไพรเมอร์ 27f ( 50-agagtttgatcmtggctcag-30 ) และ 1492r ( 50-accttgttac-gactt-30 ) ใช้บริการเชิงพาณิชย์ของ macrogen อิงค์ ( เกาหลี www.dna . macrogen . com ) ลำดับเปรียบเทียบกับลำดับอยู่ในดีเอ็นเอ databank ของญี่ปุ่น ( ddbj ) / ยุโรปห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยา ( สัตว ) / ขนาดฐานข้อมูล โดยระเบิดโปรแกรมของศูนย์สารสนเทศเทคโนโลยีชีวภาพ ลำดับของสายพันธุ์ที่ถูกเรียกสำหรับการสร้างต้นไม้ phylogenetic . การวิเคราะห์ ซึ่งทำโดยรุ่นเด่น 5 ซึ่งทำมาจากต้นไม้กันจัดนิวคลีโอไทด์โดยใช้อัลกอริทึม ( saitouand เนย , 1987 )