FPNI-PCR is a simple and rapid meth

FPNI-PCR is a simple and rapid method of genomic walking and flanking sequence cloning

Methods involving inverse PCR and ligation-mediated PCR techniques suffer from the requirement for complicated manipulations, such as restriction cleavage, ligation, or tailing before PCR amplification [6,7,9]. Consequently, the use of such methods to successfully amplify and clone the target product usually requires a time-scale exceeding one working day. Similarly, the successful application of TAIL-PCR or hiTAIL-PCR methods is also time-consuming, with the time taken to perform the necessary number of PCR cycles (approx. 110) requiring a full working day (and this is even before the time taken to perform the various dilution steps is considered) [1,3]. Using FPNI-PCR, a total about 42-45 cycles (requiring less than two hours) can be adequate to produce a good rate of success in target product amplification and, in our hands, a total of 54-57 cycles (completed in less than 4 hours) ensured a successful result in 100% of cases. Both TAIL-PCR and FPNI-PCR methods demand only extremely modest levels of quantity and purity of the template DNA, thus, they can work well with both cell lysates and crude DNA extracts. Using FPNI-PCR, however, we were able to choose a wider range of annealing temperatures during the low stringency cycles of the first PCR step, thereby extending the scope of target product that could be successfully amplified. The currently widely used Genome Walker Kit from Clontech employs restriction enzyme cleavage of DNA and adaptor-ligated genomic DNA construction, and also involves a nested PCR strategy. The procedures of integrated restriction cleavage, ligation and tailing make the Genome Walker Kit a substantially more complicated and time-consuming process than the first PCR step of FPNI-PCR. Thus, we believe that in comparison to the other reported methods of genomic walking and flanking sequence cloning [[3,15,18,19], and references as above], FPNI-PCR is technically less demanding and is more time-efficient.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

fpni-PCR เป็นวิธีที่ง่ายและรวดเร็วของการเดินขนาบข้างและจีโนมโคลนลำดับ

วิธีการที่เกี่ยวข้องกับ pcr ผกผันและเทคนิค pcr ligation พึ่งได้รับจากความต้องการสำหรับกิจวัตรที่ซับซ้อนเช่นการ จำกัด แตกแยก ligation หรือ tailing ก่อนที่จะขยาย PCR [6 , 7.9] ดังนั้นการใช้วิธีการดังกล่าวจะประสบความสำเร็จและขยายโคลนผลิตภัณฑ์เป้าหมายมักจะต้องใช้เวลาขนาดเกินหนึ่งวันทำการ ในทำนองเดียวกันการประยุกต์ใช้ที่ประสบความสำเร็จของหาง pcr หรือ hitail-PCR วิธีการนี​​้ยังเป็นเวลานานมีเวลาที่จะดำเนินการจำนวนที่จำเป็นของรอบ pcr (ประมาณ110) ที่ต้องทำงานเต็มวัน (และนี่คือก่อนเวลาที่จะดำเนินการขั้นตอนการเจือจางต่างๆถือว่า) [1,3] ใช้ fpni-pcr, รวมประมาณ 42-45 รอบ (ต้องน้อยกว่าสองชั่วโมง) สามารถที่เพียงพอในการผลิตอัตราที่ดีของความสำเร็จในการขยายผลิตภัณฑ์เป้าหมายและในมือของเรารวม 54-57 รอบ (เสร็จสิ้นในเวลาน้อยกว่า 4 ชั่วโมง) มั่นใจผลที่ประสบความสำเร็จใน 100% ของกรณี ทั้งหางและ pcr fpni-PCR วิธีการเรียกร้องในระดับเพียงเจียมเนื้อเจียมตัวมากของปริมาณและความบริสุทธิ์ของแม่ dna จึงจะสามารถทำงานได้ดีกับทั้งสอง lysates เซลล์และสารสกัดจาก dna ดิบ ใช้ fpni-pcr แต่เราสามารถที่จะเลือกช่วงกว้างของอุณหภูมิการหลอมในช่วงรอบต่ำของความเข้มงวดขั้นตอน pcr แรกจึงขยายขอบเขตของผลิตภัณฑ์เป้าหมายที่จะประสบความสำเร็จในการขยาย จีโนมชุดวอล์คเกอร์ในปัจจุบันใช้กันอย่างแพร่หลายจาก clontech พนักงานแตกแยกข้อ จำกัด ของเอนไซม์ dna และอะแด็ปเตอร์ ligated ก่อสร้างดีเอ็นเอจีโนมและยังเกี่ยวข้องกับกลยุทธ์ PCR ที่ซ้อนกันวิธีการแบบบูรณาการความแตกแยก จำกัด ligation และ tailing ทำให้จีโนมวอล์คเกอร์ชุดเป็นกระบวนการที่ซับซ้อนมากขึ้นอย่างมากและใช้เวลานานกว่าขั้นตอนแรกของ pcr fpni-PCR ดังนั้นเราเชื่อว่าในการเปรียบเทียบกับคนอื่น ๆ ที่มีการรายงานวิธีการของจีโนมและการเดินขนาบลำดับโคลน [[3,15,18,19] และการอ้างอิงข้างต้น]fpni-PCR เป็นเทคนิคที่น้อยกว่าความต้องการและมีเวลาอย่างมีประสิทธิภาพ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

FPNI-PCR เป็นวิธีง่าย และรวดเร็วของ genomic เดิน และ flanking โคลนลำดับ

วิธีการผกผัน PCR และเทคนิค PCR mediated ไข่ประสบความสำหรับ manipulations ภาพซับซ้อน เช่นปริจำกัด ไข่ หรือ tailing ก่อนขยาย PCR [6,7,9] ดังนั้น การใช้วิธีดังกล่าวจะประสบความสำเร็จขยาย และโคลนผลิตภัณฑ์เป้าหมายมักจะต้องสเกลเวลาเกินหนึ่งวันทำการ ในทำนองเดียวกัน ใช้วิธี PCR หางหรือ hiTAIL PCR ประสบความสำเร็จก็ใช้เวลานาน ด้วยเวลาที่ใช้ทำ PCR จำเป็นจำนวนรอบ (ประมาณ 110) กำหนดวันทำงานทั้งหมด (และนี่คือก่อนถือว่าเป็นเวลาที่ใช้ในการดำเนินการขั้นตอนการเจือจางต่าง ๆ) [1,3] ใช้ FPNI-PCR รวมเกี่ยวกับรอบ 42-45 (ต้องน้อยกว่า 2 ชั่วโมง) ได้อย่างเพียงพอในการผลิตอัตราความสำเร็จ ในเป้าหมายขยายผลิตภัณฑ์ และ ใน มือของเรา ดี จำนวนรอบ 54-57 (เสร็จสมบูรณ์แล้วในน้อยกว่า 4 ชั่วโมง) มั่นใจผลสำเร็จ 100% กรณี ทั้งหาง-PCR และ FPNI PCR วิธีต้องระดับเจียมเนื้อเจียมตัวมากเท่าของปริมาณและความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอต้นแบบ สามารถทำงานกับ lysates เซลล์ทั้งสอง และแยกดีเอ็นเอน้ำมันต่าง ๆ ใช้ FPNI-PCR อย่างไรก็ตาม เราไม่สามารถเลือกช่วงกว้างของการอบเหนียวอุณหภูมิระหว่างรอบต่ำสุดที่ stringency PCR ขั้นตอนแรก เพื่อขยายขอบเขตของผลิตภัณฑ์เป้าหมายที่สามารถประสบความสำเร็จขยาย ใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบันกลุ่มวอล์คเกอร์ Kit จาก Clontech ใช้ปริจำกัดเอนไซม์ดีเอ็นเอและอะแดปเตอร์ ligated genomic DNA สร้าง และยัง เกี่ยวข้องกับกลยุทธ์การ PCR ซ้อน ตอนปริจำกัดรวม ไข่ และ tailing ทำกระบวนการที่ซับซ้อนมากขึ้น และใช้เวลานานกว่า PCR ขั้นตอนแรกของ FPNI-PCR Kit Walker จีโนม ดังนั้น เราเชื่อว่า โดยอื่น ๆ รายงานวิธีการเดิน และ flanking ลำดับโคลน genomic [[3,15,18,19], และการอ้างอิงด้านบน], FPNI-PCR เป็นเทคนิคน้อยกว่า และเป็นมากขึ้นเวลาประสิทธิภาพ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

fpni - pcr เป็นแบบเรียบง่ายและรวดเร็ววิธีของ genomic เดินไปถึงได้และขนาบข้างตามลำดับการลอกแบบ วิธีการ

เกี่ยวข้องกับสีตัดกัน pcr และ ligation ดีงาม pcr เทคนิคทนทุกข์ทรมานจากความต้องการสำหรับความซับซ้อนต้นเหตุเช่นการจำกัดความบาดหมางกัน, ligation ,หรือปลายไม้ที่ฝังอยู่ในผนังก่อน pcr 6,7,9 ใช้การขยายเสียง[] ดังนั้นจึงมีผลทำให้ผลการใช้วิธีการดังกล่าวเพื่อขยายและการถอดแบบข้อมูล( Clone ) ผลิตภัณฑ์ ของกลุ่มเป้าหมายที่ได้จะต้องอาศัยเวลาขนาดใหญ่ที่เกินหนึ่งวันทำการ ในทำนองเดียวกันแอปพลิเคชันที่ประสบความสำเร็จของวิธีการหาง - pcr หรือ hitail - pcr ยังเป็นเวลาที่ต้องใช้เวลานานด้วยเวลาที่จะดำเนินการจำนวนที่จำเป็นในการรอบ pcr (ประมาณ110 )ต้องมีวันทำงานเต็มที่(และในส่วนนี้คือก่อนถึงเวลาที่ได้รับในการทำตามขั้นตอนต่างๆที่เจือจางได้รับการพิจารณาให้)[ 1,3 ] การใช้ fpni - pcr ทั้งหมดที่เกี่ยวกับ 42-45 รอบ(ต้องใช้ไม่น้อยกว่าสองชั่วโมง)สามารถเพียงพอในการผลิตอัตราที่ดีของความสำเร็จในการขยายสินค้าเป้าหมายและอยู่ในมือของเรายอดรวมของ 54-57 รอบ(เสร็จสมบูรณ์ในเวลาไม่ถึง 4 ชั่วโมง)ทำให้สร้างความมั่นใจให้ประสบความสำเร็จได้ใน 100% ของลูกหนี้ วิธีการหาง - pcr และ fpni - pcr ทั้งสองความต้องการเฉพาะระดับไม่มากนักแต่ก็เป็นอย่างมากของความบริสุทธิ์และปริมาณของดีเอ็นเอเทมเพลตที่ทำให้พวกเขาสามารถทำงานได้เป็นอย่างดีพร้อมด้วย lysates เซลล์และสารสกัดจากดีเอ็นเอทั้งน้ำมันดิบ การใช้ fpni - pcr แต่ถึงอย่างไรก็ตามเราสามารถที่จะเลือกช่วงของ annealing อุณหภูมิ ในช่วงรอบต่ำ(กฎของขั้นตอน pcr ครั้งแรกซึ่งจะขยายขอบเขตของ ผลิตภัณฑ์ กลุ่มเป้าหมายที่จะประสบความสำเร็จแอมพลิฟาย Walker ยีนชุดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบันจาก clontech มีพนักงานความบาดหมางกันเอนไซม์การจำกัดของดีเอ็นเอและการก่อสร้างดีเอ็นเอ genomic อะแดปเตอร์ - ligated และนอกจากนั้นยังรวมถึงกลยุทธ์ pcr ซ้อนตามขั้นตอนที่ระบุในการจำกัดความบาดหมางกัน ligation แบบอินทิเกรตและปลายไม้ที่ฝังอยู่ในผนังทำให้ยีน Walker ชุดที่ขั้นตอนที่สำคัญความซับซ้อนมากขึ้นและต้องใช้เวลานานกว่าการ pcr ครั้งแรกที่ fpni - pcr. ดังนั้นเราจึงเชื่อว่าในเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการอื่นๆที่รายงานของ genomic เดินไปถึงได้และขนาบข้างตามลำดับการลอกแบบ[[ 3,15,18,19 ]และการอ้างถึงเป็นด้านบน]fpni - pcr คือทางด้านเทคนิคขั้นสูงไม่น้อยและมีเวลามากขึ้นอย่างมี ประสิทธิภาพ