Materials and MethodsPlant material

Materials and Methods
Plant material. Flowers of O. fragrans var. aurantiacus
Mak. were collected at Shizuoka University ground during
the flowering period in autumn 2007. Flowers in full
bloom (stage 5, Baldermann et al., 2010) were used in
this study.
Analysis of carotenoids. The carotenoids of the
flower petals were analysed by HPLC as published previously
(Baldermann et al., 2010). Identification was
achieved by co-chromatography with authentic reference
substances.
Identification and sequence analysis of OfCCD1.
Detailed experimental description has been published
previously (Baldermann et al., 2010). The sequences were
aligned using ClustalW (http://www.genome.jp/). The
evolutionary history was inferred using the Neighbor-
Joining method and visualized by Tree View.
Expression of OfCCD1 in b-carotene accumulating
cells. The cDNA was expressed in E. coli XL1Blue
harboring the pACCAR plasmid that carries all genes
necessary to produce β-carotene (Missawa et al., 1995).
A single colony of transformed cells was inoculated in
100 mL YT media containing chloramphenicol and carbenicillin
and grown at 37°C over night. One mL overnight
culture was inoculated in 100 mL of fresh YT media
containing the suitable antibiotics and grown at 27°C
until an OD550 of 0.5. To this culture ITPG (0.5 mM),
ascorbate (6 mM), FeSO4 (5 μM), catalase (200 U/mL)
were added to induce the production of the target enzyme
and the in vivo reaction.
Expression and purification of the recombinant
OfCCD1 and in vitro assay. Detailed experimental
conditions have been published elsewhere (Baldermann
et al., 2010).
Analysis of volatile reaction products in the headspace
of E. coli cultures accumulating β-carotene.
The presence of β-ionone, the putative reaction prod-uct derived from the cleavage of β-carotene, was confirmed
after solid phase micro-extraction (SPME) by gas
chromatography mass spectrometry (GC-MS). A SPME
fiber coated with 100 μm polymethylsiloxane (Supelco,
Bellefonte, PA) was introduced into an Erlenmeyer flask
containing 100 mL YT liquid culture induced for production
of OfCCD1. The volatiles were collected in the
headspace for 1 h at 37°C. The reaction products were
analyzed by GS-MS using a capillary Suplecowax column
(GL Sciences Inc., Japan, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 μm
film thickness) using the following temperature program:
initial temperature 50°C, maintained for 3 min, ramped
to 190°C at 5°C/min, ramped to 240°C at 40°C/min,
and held for 3 min. The mass scan range was set to m/z
50–300 and the electric potential to 1.0 kV. Helium was
used as carrier gas at a flow rate of 1.7 mL/min.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการพืชวัสดุ ดอกไม้ของ aurantiacus fragrans โอเพียงหมาก ถูกรวบรวมไว้ในชิสึโอกะมหาวิทยาลัยดินระหว่างระยะดอกในฤดูใบไม้ร่วง 2007 ดอกไม้เต็มใช้ในบลูม (ในขั้นที่ 5, Baldermann et al., 2010)การศึกษานี้วิเคราะห์ของ carotenoids Carotenoids ของดอกไม้กลีบได้ analysed โดย HPLC เป็นเผยแพร่ก่อนหน้านี้(Baldermann et al., 2010) รหัสได้โดย chromatography ร่วมกับอาหารอ้างอิงสารรหัสและลำดับวิเคราะห์ของ OfCCD1ละเอียดทดลองได้รับการเผยแพร่ก่อนหน้านี้ (Baldermann et al., 2010) ลำดับที่ได้จัดโดยใช้ ClustalW (http://www.genome.jp/) ที่ประวัติวิวัฒนาการได้สรุปการใช้เพื่อนบ้าน-รวมวิธี และ visualized โดยมุมมองแผนภูมิค่าของ OfCCD1 ในหลังบีแคโรทีนเซลล์ CDNA ได้แสดงออกใน E. coli XL1Blueharboring plasmid pACCAR ที่ยีนทั้งหมดจำเป็นต้องผลิตβ-แคโรทีน (Missawa และ al., 1995)โคโลนีเดี่ยวของเซลล์แปรรูปถูก inoculated ในสื่อ 100 มล YT chloramphenicol และ carbenicillinและเติบโตที่ 37° C ข้ามคืน ML หนึ่งค้างคืนวัฒนธรรมถูก inoculated ใน 100 mL ของสื่อ YT สดประกอบด้วยยาปฏิชีวนะเหมาะสม และเติบโตที่ 27° Cจนกระทั่งการ OD550 0.5 วัฒนธรรมนี้ ITPG (0.5 mM),ascorbate (6 mM), FeSO4 (5 μM), catalase (200 U/mL)จะก่อให้เกิดการผลิตของเอนไซม์เป้าหมายและปฏิกิริยาในสัตว์ทดลองนิพจน์และฟอกวททชOfCCD1 และเครื่องมือวิเคราะห์ รายละเอียดการทดลองเงื่อนไขมีการเผยแพร่อื่น ๆ (Baldermannร้อยเอ็ด al., 2010)วิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาระเหยใน headspaceวัฒนธรรม E. coli หลังβ-แคโรทีนได้รับการยืนยันของβ-ionone ผลิต-uct putative ปฏิกิริยาที่มาจากความแตกแยกของβ-แคโรทีนหลังทึบระยะไมโครสกัด (SPME) โดยก๊าซchromatography โตรเมทรี (GC-MS) SPME การไฟเบอร์เคลือบ ด้วย 100 μm polymethylsiloxane (SupelcoBellefonte, PA) ถูกนำเข้าสู่การหนาว Erlenmeyerประกอบด้วยวัฒนธรรม 100 มล YT ของเหลวเกิดจากการผลิตของ OfCCD1 Volatiles ถูกเก็บรวบรวมในการheadspace สำหรับ h 1 ที่ 37 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาวิเคราะห์ โดยใช้คอลัมน์ Suplecowax รูพรุน MS GS(GL วิทยาศาสตร์ Inc. ญี่ปุ่น 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 μmฟิล์มหนา) ใช้โปรแกรมอุณหภูมิต่อไปนี้:เริ่มต้นอุณหภูมิ 50° C, 3 นาที ramped การบำรุงรักษาถึง 190° C ที่ 5° C/min, ramped ถึง 240° C ที่ 40° C/นาทีและจัดขึ้นใน 3 นาที ช่วงการสแกนโดยรวมถูกตั้งค่า m/z50-300 และศักย 1.0 kV ฮีเลียมได้ใช้เป็นผู้ขนส่งก๊าซที่อัตราการไหลของ 1.7 mL/min

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
วัสดุพืช ดอกไม้ของ fragrans var ทุม aurantiacus
หมาก ถูกเก็บรวบรวมที่พื้นชิสึโอกะมหาวิทยาลัยในช่วง
ระยะเวลาการออกดอกในฤดูใบไม้ร่วงปี 2007 ดอกไม้เต็ม
บาน (ขั้นตอนที่ 5 Baldermann et al., 2010) ถูกนำมาใช้ใน
การศึกษาครั้งนี้.
วิเคราะห์ carotenoids นอยด์ของ
กลีบดอกไม้ที่ได้มาวิเคราะห์โดยวิธี HPLC ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้
(Baldermann et al., 2010) ประจำตัวประชาชนได้รับการ
ประสบความสำเร็จโดยร่วมโคมีการอ้างอิงของแท้
สาร.
กำหนดและวิเคราะห์ลำดับของ OfCCD1.
คำอธิบายรายละเอียดการทดลองได้รับการตีพิมพ์
ก่อนหน้านี้ (Baldermann et al., 2010) ลำดับถูก
จัดชิดโดยใช้ ClustalW (http://www.genome.jp/)
ประวัติศาสตร์วิวัฒนาการได้รับการสรุปโดยใช้ Neighbor-
วิธีการเข้าร่วมและมองเห็นจากมุมมองแบบต้นไม้.
การแสดงออกของ OfCCD1 ขแคโรทีนสะสม
เซลล์ cDNA ได้แสดงออกใน E. coli XL1Blue
เยิ้มพลาสมิด Paccar ที่ดำเนินยีนทั้งหมดที่
จำเป็นในการผลิตβแคโรทีน (Missawa et al., 1995).
อาณานิคมเดียวของเซลล์เปลี่ยนได้รับเชื้อใน
100 มลสื่อ YT มี chloramphenicol และ carbenicillin
และ การเติบโตที่ 37 ° C ข้ามคืน หนึ่งมิลลิลิตรค้างคืน
วัฒนธรรมได้รับเชื้อใน 100 มลของสื่อ YT สด
ที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสมและเติบโตที่ 27 ° C
จน OD550 0.5 วัฒนธรรมนี้ ITPG (0.5 มิลลิเมตร)
ascorbate (6 มิลลิเมตร) FeSO4 (5 ไมครอน), catalase (200 U / มิลลิลิตร)
มีการเพิ่มเพื่อก่อให้เกิดการผลิตเอนไซม์เป้าหมาย
และในร่างกายเกิดปฏิกิริยา.
การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ recombinant
OfCCD1 และทดสอบในหลอดทดลอง ทดลองละเอียด
เงื่อนไขได้รับการเผยแพร่ที่อื่น ๆ (Baldermann
et al., 2010).
การวิเคราะห์ของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาผันผวนในช่องว่างเหนือของเหลว
ของเชื้อ E. coli วัฒนธรรมสะสมβแคโรทีน.
การปรากฏตัวของβ-Ionone ปฏิกิริยาสมมุติแยง-ชาญมาจาก ความแตกแยกของβแคโรทีนได้รับการยืนยัน
หลังจากขั้นตอนการสกัดของแข็งขนาดเล็ก (SPME) โดยก๊าซ
โครมาโตมวลสาร (GC-MS) SPME
เส้นใยเคลือบด้วย 100 ไมโครเมตร polymethylsiloxane (Supelco,
เบลลาฟอน, PA) ถูกนำเข้ามาในขวดรูปกรวย
ที่มี 100 มล YT วัฒนธรรมของเหลวเหนี่ยวนำให้เกิดการผลิต
ของ OfCCD1 สารระเหยถูกเก็บไว้ใน
ช่องว่างเหนือของเหลวเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาถูก
วิเคราะห์โดย GS-MS ใช้ฝอยคอลัมน์ Suplecowax
(GL วิทยาศาสตร์อิงค์ประเทศญี่ปุ่นวันที่ 30 ม., 0.25 มม ID, 0.25 ไมโครเมตร
ความหนาของฟิล์ม) โดยใช้โปรแกรมอุณหภูมิต่อไปนี้:
อุณหภูมิเริ่มต้น 50 ° C, การบำรุงรักษาเป็นเวลา 3 นาที , เมา
ถึง 190 ° C ที่ 5 องศาเซลเซียส / นาที, เมาถึง 240 ° C ที่ 40 ° C / นาที,
และจัดขึ้นเป็นเวลา 3 นาที ช่วงสแกนมวลถูกกำหนดให้ม. / Z
50-300 และศักย์ไฟฟ้า 1.0 กิโลโวลต์ ฮีเลียมถูก
นำมาใช้เป็นก๊าซที่อัตราการไหล 1.7 มิลลิลิตร / นาที

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
วัสดุพืช ดอกไม้ . fragrans var aurantiacus
มัก ศึกษาที่มหาวิทยาลัยใน ชิสึโอกะ ดิน
ระยะเวลาออกดอกในฤดูใบไม้ร่วง 2007 ดอกไม้เต็มบาน (
5 เวที baldermann et al . , 2010 ) สถิติที่ใช้ในการศึกษาวิเคราะห์นี้
.
โวนอยด์ carotenoids ของ
กลีบดอกไม้วิเคราะห์โดย HPLC ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้
( baldermann et al . , 2010 )การยืนยันตัวตนโดยโครมาโตกราฟีกับ Co


สารอ้างอิงจริง การจำแนกและการวิเคราะห์ลำดับของ ofccd1 .

รายละเอียดรายละเอียดการทดลองที่ได้รับการตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ ( baldermann et al . , 2010 ) ลำดับถูก
ชิดใช้ clustalw ( http : / / www.genome . JP / )
วิวัฒนาการประวัติศาสตร์ คือมีการใช้เพื่อนบ้าน -
เข้าร่วมและวิธีการตรวจโดยมุมมองต้นไม้ .
การแสดงออกของ ofccd1
- สะสมในเซลล์ วิธีแสดงออกใน E . coli xl1blue
กรมเจ้าท่า paccar พลาสมิดที่ประกอบทั้งหมดยีน
ที่จําเป็นในการผลิตบีตา - แคโรทีน ( missawa et al . , 1995 ) .
อาณานิคมเดียวเปลี่ยนเซลล์เป็นเชื้อใน YT
100 มล. และสื่อที่มี chloramphenicol ซามูไรสปิริตส์
และโตที่ 37 ° C ในคืนเดียว ค้างคืน
1 มิลลิลิตรวัฒนธรรมเป็นเชื้อใน 100 มิลลิลิตรของสื่อ YT สด
ที่มียาปฏิชีวนะที่เหมาะสม และโตที่ 27 ° C
จนกว่า od550 0.5 . นี้วัฒนธรรม itpg ( 0.5 มม. ) ,
ascorbate ( 6 มม. ) , feso4 ( 5 μ M ) , Catalase ( 200 U / ml )
ถูกเพิ่มเพื่อก่อให้เกิดการผลิตชิ้นงานและเอนไซม์ในปฏิกิริยาตัว
.
การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ ofccd1 แนนท์
ในนอร์เวย์ .
ทดลองรายละเอียดเงื่อนไขที่ได้รับการเผยแพร่ในที่อื่น ( baldermann
et al . , 2010 ) .
การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาที่เปลี่ยนแปลงได้ในเฮดสเปซ
ของ E . coli วัฒนธรรมบีตา - แคโรทีนสะสม .
การแสดงตนของบีตา - ไอโอโนน , ปฏิกิริยาแยง uct ซึ่งมาจากความแตกแยกของบีตา - แคโรทีนถูกยืนยัน
หลังจากโซลิดเฟสไมโครการสกัด ( spme ) โดยโครมาโตกราฟีก๊าซ
Mass Spectrometry ( GC-MS ) เป็น spme
ไฟเบอร์เคลือบด้วย 100 μ M polymethylsiloxane ( supelco
bellefonte , PA ) ใช้เป็นขวดบรรจุ 100 ml YT
เออร์เลนเมเยอร์และของเหลววัฒนธรรมการผลิต
ของ ofccd1 . มีปริมาณสารระเหยที่รวบรวมใน
เฮดสเปซเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศา ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา คือ วิเคราะห์ข้อมูลโดยการใช้ปลายนิ้ว gs-ms

( GL suplecowax คอลัมน์วิทยาศาสตร์ Inc . , ญี่ปุ่น , 30 เมตร , 0.25 mm 0.25 m
μ IDความหนาของฟิล์ม ) ใช้ตามอุณหภูมิที่โปรแกรมเริ่มต้นอุณหภูมิ 50 องศา C :
, รักษานาน 3 นาที ขู่เข็ญ
190 องศา C ที่ 5 ° C / นาที ramped 240 ° C ที่ 40 ° C / min
และจัดขึ้นนาน 3 นาที มวลสแกนช่วงถูกตั้งค่าให้ M / Z
50 - 300 และศักยภาพไฟฟ้า 1.0 เควี . ฮีเลียมถูก
ใช้เป็นแก๊สตัวพา ที่อัตราการไหลของ 1.7 มิลลิลิตร / นาที