2.2. Microbiological analysisTen gr

2.2. Microbiological analysis
Ten grams of sample was homogenised with 90 mL of 0.85% (w/v)
sterile physiological saline in a stomacher lab-blender (400, Seward,
UK) for 1 min. A serial dilution (10−1 to 10−8) in the same diluent
was made. Spore-forming bacilli were isolated by plating on nutrient
agar (MM012, HiMedia, India), after the inactivation of vegetable cells
by heating at 100 °C for 2 min (Tamang and Nikkuni, 1996) and then
incubated at 37 °C for 24 h. Lactic acid bacteria (LAB) were isolated on
plates of MRS agar (M641, HiMedia, India) supplemented with 1%
CaCO3 and incubated at 30 °C in an anaerobic gas-jar (LE002, HiMedia,
India) for 48–72 h. The presence of filamentous fungi and yeastswas examined
on potato dextrose agar (M096, HiMedia, India) and yeast-malt
(YM) agar (M424, HiMedia, India), supplemented with 10 IU mL−1
benzylpenicillin and 12 μg mL−1 streptomycin sulphate, respectively,
and which were incubated aerobically at 28 °C for 72 h. Total viable
counts were determined on plate count agar (M091A, HiMedia, India)
incubated at 30 °C for 48–72 h. Isolated colonies based on colony morphologywere
selected randomly fromthe highest diluted plates. Isolated
bacteria were preserved in nutrient broth using 15% (v/v) glycerol at
−20 °C.
2.3. Percent occurrence of Bacillus in samples
The occurrence of different species of Bacillus in samples was calculated
out of total Bacillus isolates, and expressed in percentage.
2.4. Phenotypic characterisation
Cell morphology of all isolates and their motility were determined
using a phase contrast microscope (Olympus CH3-BH-PC, Japan). Isolates
were Gram-stained and tested for catalase production, and were
preliminarily identified based on the phenotypic properties such as
carbon dioxide production from glucose, ammonia production from
arginine, growth at different temperatures as well as the ability to
grow in different concentrations of sodium chloride and pH in nutrient
broth (M002, HiMedia, India) following the method of Schillinger and
Lücke (1987). Voges–Proskauer test, nitrate reduction, starch hydrolysis,
casein hydrolysis, citrate utilization test, bile salt tolerance and
anaerobic growth were determined following the methods of Claus
and Berkeley (1986) and Duc et al. (2004). Fermentation and assimilation
of carbon compounds were determined using API 50 CHB kits
(BioMerieux, Basingstoke, UK) according to the manufacturer's instruction
and results were analysed using the API software (APIWeb,
Biomerieux). For identification of Bacillus, taxonomic key of Slepecky
and Hemphill (2006) was followed.
2.5. Genotypic identification
2.5.1. Amplification of PCR
Bacterial genomic DNA was isolated according to the method of
Zhang et al. (2002). Amplified 16S rDNA was obtained from each strain
by Polymerase Chain Reaction (PCR) with the following universal
primers; forward 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ and reverse 5′-
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′ (Weisburg et al., 1991).
2.5.2. ARDRA
The amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) technique
using restriction enzymes was carried out with HinfI (R6205,
Promega), CfoI (R6241, Promega) and RsaI (Promega) (Jeyaram et al.,
2010).
2.5.3. ITS-PCR analysis
The amplification of 16S–23S rDNA intergenic transcribed spacer
(ITS) region was carried out in a 25 μL reaction mixture with 2 μL of
cell free DNA lysate containing 30 μg of DNA, 2.5 μL of 10× PCR reaction
buffer, 2.5 mM MgCl2, each dNTP at a final concentration of 200 μM,
each primer (16-1A: 5′-GAATCGCGCTAGTAATCG-3′ and 23-1B: 5′-
GGGTTCCCCCATTCGGA-3′) (Tilsala-Timisjärvi and Alatossava, 1997) at
a final concentration of 2.4 pmol/μL and 1.5 U of Taq DNA polymerase.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. จุลชีววิทยาตัวอย่าง 10 กรัมถูกนี้กับ 90 มล. 0.85% (w/v)physiological น้ำเกลือฆ่าเชื้อในเครื่องแผงประดับหน้าอกแล็บปั่น (400 เซวาร์ดสหราชอาณาจักร) 1 นาที การเจือจาง serial (10−1 กับ 10−8) ในเดียวกันจ่ายทำ ขึ้นรูปสปอร์หนาถูกแยก โดยชุบในสารอาหารวุ้น (MM012, HiMedia อินเดีย), หลังจากยกเลิกการเรียกของเซลล์พืชโดยเครื่องทำความร้อนที่ 100 ° C เป็นเวลา 2 นาที (ตามางและ Nikkuni, 1996) และจากนั้นรับการกกที่ 37 ° C สำหรับ 24 h. กรดหน้าแบคทีเรีย (แล็บ)แผ่นของนางวุ้น (M641, HiMedia อินเดีย) เสริม ด้วย 1%CaCO3 และรับการกกที่ 30 ° C ในการไม่ใช้ออกซิเจนก๊าซโถ (LE002, HiMediaอินเดีย) สำหรับ 48 – 72 ชั่วโมง การปรากฏตัวของเชื้อราด้ายและการตรวจสอบ yeastswasมันฝรั่งวุ้นเดกซ์โทรส (M096, HiMedia อินเดีย) และยีสต์มอลต์(YM) วุ้น (M424, HiMedia อินเดีย), เสริม ด้วย mL−1 10 IUbenzylpenicillin และ 12 μ mL−1 streptomycin ซัลเฟต ตามลำดับและที่ได้รับการกก aerobically ที่ 28 ° C สำหรับ 72 รวมทำงานได้กำหนดนับบนอาหารเหลว (M091A, HiMedia อินเดีย)ได้รับการกกที่ 30 ° C สำหรับ 48 – 72 แยกอาณานิคมอิงอาณานิคม morphologywereเลือกสุ่มจากแผ่นปรับลดสูงสุด แยกแบคทีเรียถูกเก็บรักษาไว้ในสารอาหารซุปใช้กลีเซอรอล 15% (v/v) ที่−20 ° C2.3. เกิดขึ้นร้อยละของเชื้อในตัวอย่างการเกิดขึ้นของสายพันธุ์ของเชื้อในตัวอย่างคำนวณออกของ Bacillus รวมแยก และแสดงในเปอร์เซ็นต์2.4. Phenotypic characterisationCell morphology of all isolates and their motility were determinedusing a phase contrast microscope (Olympus CH3-BH-PC, Japan). Isolateswere Gram-stained and tested for catalase production, and werepreliminarily identified based on the phenotypic properties such ascarbon dioxide production from glucose, ammonia production fromarginine, growth at different temperatures as well as the ability togrow in different concentrations of sodium chloride and pH in nutrientbroth (M002, HiMedia, India) following the method of Schillinger andLücke (1987). Voges–Proskauer test, nitrate reduction, starch hydrolysis,casein hydrolysis, citrate utilization test, bile salt tolerance andanaerobic growth were determined following the methods of Clausand Berkeley (1986) and Duc et al. (2004). Fermentation and assimilationof carbon compounds were determined using API 50 CHB kits(BioMerieux, Basingstoke, UK) according to the manufacturer's instructionand results were analysed using the API software (APIWeb,Biomerieux). For identification of Bacillus, taxonomic key of Slepeckyand Hemphill (2006) was followed.2.5. Genotypic identification2.5.1. Amplification of PCRBacterial genomic DNA was isolated according to the method ofZhang et al. (2002). Amplified 16S rDNA was obtained from each strainby Polymerase Chain Reaction (PCR) with the following universalprimers; forward 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ and reverse 5′-3′ AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (Weisburg et al. 1991)2.5.2. ARDRAขยาย ribosomal ดีเอ็นเอจำกัด (ARDRA) การวิเคราะห์เทคนิคใช้เอนไซม์จำกัดได้ดำเนินการ ด้วย (R6205, HinfIPromega), CfoI (R6241, Promega) และ RsaI (Promega) (Jeyaram et al.,2010)2.5.3 PCR ของการวิเคราะห์ขยายของ 16S – 23S rDNA spacer intergenic ทับภูมิภาค (ของตน) ได้ดำเนินการในส่วนผสมปฏิกิริยาที่ 25 μL มี μL 2 ของเซลล์ฟรี DNA lysate มี 30 μของดีเอ็นเอ μL 2.5 ของปฏิกิริยา PCR × 10บัฟเฟอร์ 2.5 มม. MgCl2, dNTP แต่ละที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 200 μ mรองพื้นแต่ละ (16 1A: 5 ′-GAATCGCGCTAGTAATCG-3′ และ 23 1B: 5 ′ -GGGTTCCCCCATTCGGA-3′) (Tilsala-Timisjärvi และ Alatossava, 1997) ที่ความเข้มข้นที่สุดท้ายของ 2.4 pmol/μL และ 1.5 U ของ Taq DNA พอลิเมอเรส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยา
สิบกรัมของตัวอย่าง homogenised 90 มล 0.85% (w / v)
น้ำเกลือทางสรีรวิทยาการฆ่าเชื้อในห้องปฏิบัติการ Stomacher ปั่น (400, เอิร์ด,
สหราชอาณาจักร) เป็นเวลา 1 นาที เจือจางอนุกรม (10-1 10-8) ในเจือจางเดียวกัน
ถูกสร้างขึ้นมา สร้างสปอร์แบคทีเรียที่แยกได้โดยการชุบบนสารอาหาร
วุ้น (MM012, HIMEDIA อินเดีย) หลังจากการใช้งานของเซลล์พืช
ด้วยความร้อนที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที (Tamang และ Nikkuni, 1996) และจากนั้น
บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 H แบคทีเรียแลคติก (LAB) ที่แยกบน
แผ่น MRS agar (M641, HIMEDIA อินเดีย) เสริมด้วย 1%
CaCO3 และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสในแบบไม่ใช้ออกซิเจนก๊าซขวด (LE002, HIMEDIA,
อินเดีย) สำหรับ 48-72 ชั่วโมง การปรากฏตัวของเชื้อราและ yeastswas ตรวจสอบ
บน potato dextrose agar (M096, HIMEDIA อินเดีย) และยีสต์มอลต์
(YM) วุ้น (M424, HIMEDIA อินเดีย) เสริมด้วย 10 IU ML-1
benzylpenicillin และ 12 ไมโครกรัม ML-1 streptomycin ซัลเฟตตามลำดับ
และที่ถูกบ่มออกซิเจนที่ 28 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 72 ชั่วโมง ทำงานได้รวม
นับได้รับการพิจารณาในการนับจานเลี้ยงเชื้อ (M091A, HIMEDIA อินเดีย)
บ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48-72 ชั่วโมง อาณานิคมแยกออกมาอยู่บนพื้นฐานของอาณานิคม morphologywere
เลือกแผ่นสุ่ม fromthe เจือจางสูงสุด ที่แยก
เชื้อแบคทีเรียที่ถูกเก็บรักษาไว้ในน้ำซุปสารอาหารที่ใช้ 15% (v / v) กลีเซอรอลที่
-20 ° C.
2.3 เกิดขึ้นร้อยละของ Bacillus ในตัวอย่าง
การเกิดขึ้นของสายพันธุ์ที่แตกต่างกันของ Bacillus ในตัวอย่างที่คำนวณได้
จาก Bacillus รวมแยกและแสดงในอัตราร้อยละ.
2.4 ฟีโนไทป์ลักษณะ
ทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ของเชื้อและการเคลื่อนไหวของพวกเขาได้รับการพิจารณา
โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เฟสตรงกันข้าม (โอลิมปั CH3-BH-PC, ญี่ปุ่น) ไอโซเลท
ถูกแกรมเปื้อนและทดสอบการผลิต catalase และถูก
เบื้องต้นระบุขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของฟีโนไทป์เช่น
การผลิตก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์จากกลูโคสผลิตแอมโมเนียจาก
อาร์จินี, การเจริญเติบโตในอุณหภูมิที่แตกต่างกันเช่นเดียวกับความสามารถในการ
เติบโตในระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันของโซเดียมคลอไรด์ และค่า pH ในสารอาหาร
น้ำซุป (M002, HIMEDIA อินเดีย) ตามวิธีการของ Schillinger และ
Lücke (1987) ทดสอบ Voges-Proskauer ลดไนเตรตย่อยสลายแป้ง
เคซีนไฮโดรไลซิทดสอบการใช้ซิเตรต, ทนเค็มน้ำดีและ
การเจริญเติบโตแบบไม่ใช้ออกซิเจนได้รับการพิจารณาดังต่อไปนี้วิธีการของซานตาคลอส
และเบิร์กลีย์ (1986) และ Duc, et al (2004) การหมักและการดูดซึม
ของสารคาร์บอนได้รับการพิจารณาโดยใช้ชุด API 50 CHB
(BIOMERIEUX เบซิงสหราชอาณาจักร) ตามคำสั่งของผู้ผลิต
และผลที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ของ API (APIWeb,
Biomerieux) สำหรับบัตรประจำตัวของเชื้อ Bacillus ที่สำคัญการจัดหมวดหมู่ของ Slepecky
และ Hemphill (2006) ตามมา.
2.5 บัตรประจำตัวพันธุกรรม
2.5.1 การขยายของ PCR
แบคทีเรียดีเอ็นเอถูกแยกไปตามวิธีการของ
Zhang et al, (2002) ขยาย 16S rDNA ที่ได้รับจากแต่ละสายพันธุ์
โดย (Polymerase Chain Reaction PCR) กับสากลต่อไป
ไพรเมอร์; ไปข้างหน้า 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 'และย้อนกลับ 5'-
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' (Weisburg et al., 1991).
2.5.2 ARDRA
การวิเคราะห์ข้อ จำกัด ดีเอ็นเอขยายไรโบโซม (ARDRA) เทคนิคการ
ใช้เอนไซม์ข้อ จำกัด ได้ดำเนินการกับ HinfI (R6205,
Promega) CfoI (R6241, Promega) และ RsaI (Promega) (Jeyaram et al.,
2010).
2.5.3 ITS-PCR วิเคราะห์
ขยายของ 16S-23S rDNA intergenic คัดลอก spacer
(ITS) เขตได้ดำเนินการในส่วนผสมปฏิกิริยา 25 ไมโครลิตรมี 2 ไมโครลิตรของ
เซลล์ lysate ดีเอ็นเอฟรีที่มี 30 ไมโครกรัมดีเอ็นเอ 2.5 ไมโครลิตร 10 × PCR ปฏิกิริยา
บัฟเฟอร์ ขนาด 2.5 มม MgCl2 แต่ละ dNTP ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 200 ไมโครเมตร
แต่ละไพรเมอร์ (16-1A: 5'-GAATCGCGCTAGTAATCG-3 'และ 23-1B: 5'-
GGGTTCCCCCATTCGGA-3') (Tilsala-Timisjärviและ Alatossava, 1997) ที่
มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 2.4 pmol / ไมโครลิตรและ 1.5 U ของ Taq DNA Polymerase