Toxoplasma strain RH and the lacZ-e

Toxoplasma strain RH and the lacZ-expressing clone 2F were cultured in human foreskin ®broblast (HFF) cell monolayers as described previously (Morisaki et al., 1995). Toxoplasma invasion of HFF cell monolayers was quanti®ed by colorimetric detection of b-galactosidase (b-Gal) activity expressed
by the parasite strain 2F as described previously (Dobrowolski and Sibley, 1996). Brie¯y, puri®ed parasites were incubated with HFF monolayers in invasion medium [DMEM ‡3% (v/v) FBS, 20mM HEPES, 0.2% (w/v) NaH2CO3] for 10 or 20min at 378C. After extensive washing in PBS, monolayers were lysed, and b-Gal activity was determined using the substrate chlorophenol red b-D-galactopyranoside (Eustice et al., 1991). Parasite numbers were determined by comparison of enzyme levels with dilution standards, produced by lysis of parasites counted in a haemocytometer. Immuno¯uorescence staining was also used to examine parasite invasion of HFF cells grown on permanox chamber slides (Nalge Nunc International). Monolayers were infected with parasites for 20min at 378C in a CO 2 incubator followed byabriefwashwithPBSand®xationfor20minwith2.5%(w/v) formaldehyde/0.02% (w/v) glutaraldehyde in ice-cold PBS. After blocking and permeabilizing infected monolayers for 30min with PBS containing 10% (v/v) FBS and 0.05% (w/v) saponin (Sigma), parasites associated with host cells were sequentially stained with rabbit anti-SAG1 and Texas Redconjugated goat anti-rabbit (Jackson ImmunoResearch Laboratories; 1:500) antibodies, diluted in PBS‡1% (v/v) FBS, 1% (v/v) normal goat serum and 0.05% (w/v) saponin.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ต้องใช้ toxoplasma RH และ lacZ-กำลังโคลน 2F ถูกอ่างในหนังหุ้มปลายมนุษย์ ® broblast (HFF) เซลล์ monolayers อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Morisaki และ al., 1995) บุกรุก toxoplasma ของ HFF monolayers เซลล์ถูก quanti ® ed โดยตรวจสอบเทียบเคียงของกิจกรรม b-galactosidase (b-Gal) แสดงby the parasite strain 2F as described previously (Dobrowolski and Sibley, 1996). Brie¯y, puri®ed parasites were incubated with HFF monolayers in invasion medium [DMEM ‡3% (v/v) FBS, 20mM HEPES, 0.2% (w/v) NaH2CO3] for 10 or 20min at 378C. After extensive washing in PBS, monolayers were lysed, and b-Gal activity was determined using the substrate chlorophenol red b-D-galactopyranoside (Eustice et al., 1991). Parasite numbers were determined by comparison of enzyme levels with dilution standards, produced by lysis of parasites counted in a haemocytometer. Immuno¯uorescence staining was also used to examine parasite invasion of HFF cells grown on permanox chamber slides (Nalge Nunc International). Monolayers were infected with parasites for 20min at 378C in a CO 2 incubator followed byabriefwashwithPBSand®xationfor20minwith2.5%(w/v) formaldehyde/0.02% (w/v) glutaraldehyde in ice-cold PBS. After blocking and permeabilizing infected monolayers for 30min with PBS containing 10% (v/v) FBS and 0.05% (w/v) saponin (Sigma), parasites associated with host cells were sequentially stained with rabbit anti-SAG1 and Texas Redconjugated goat anti-rabbit (Jackson ImmunoResearch Laboratories; 1:500) antibodies, diluted in PBS‡1% (v/v) FBS, 1% (v/v) normal goat serum and 0.05% (w/v) saponin.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Toxoplasma ความเครียด RH และโคลน lacZ แสดง-2F ถูกเลี้ยงในมนุษย์หนังหุ้มปลายลึงค์®broblast (HFF) monolayers มือถือตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Morisaki et al., 1995) บุก Toxoplasma ของ HFF monolayers เซลล์quanti®edโดยการตรวจสอบสีของ B-galactosidase (B-Gal)
กิจกรรมแสดงโดยสายพันธุ์ปรสิต2F ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Dobrowolski และ Sibley, 1996) Briey ปรสิตpuri®edถูกบ่มกับ monolayers HFF ในสื่อบุก [DMEM ?? 3% (v / v) FBS, 20mm HEPES 0.2% (w / v) NaH2CO3] สำหรับ 10 หรือ 20 นาทีที่ 378C หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส monolayers ถูก lysed และกิจกรรม B-สาวถูกกำหนดโดยใช้พื้นผิว chlorophenol แดง BD-galactopyranoside (Eustice et al., 1991) ตัวเลขพยาธิได้รับการพิจารณาโดยเปรียบเทียบระดับเอนไซม์ที่มีมาตรฐานการลดสัดส่วนที่ผลิตโดยสลายของปรสิตนับสไลด์นับเม็ดเลือด การย้อมสีImmuno¯uorescenceยังถูกใช้ในการตรวจสอบการบุกรุกปรสิตเซลล์ HFF ปลูกในภาพนิ่งห้อง permanox (Nalge Nunc นานาชาติ) monolayers มีการติดเชื้อปรสิตสำหรับ 20min ที่ 378C ใน 2 ร่วมตามศูนย์บ่มเพาะbyabriefwashwithPBSand®xationfor20minwith2.5% (w / v) ฟอร์มาลดีไฮด์ / 0.02% (w / v) glutaraldehyde พีบีเอสในเย็น หลังจากการสกัดกั้นและ permeabilizing monolayers ติดเชื้อสำหรับ 30 นาทีกับพีบีเอสที่มี 10% (v / v) FBS และ 0.05% (w / v) ซาโปนิน (ซิกม่า) ปรสิตที่เกี่ยวข้องกับเซลล์โฮสต์มีการย้อมตามลำดับกับกระต่ายต่อต้าน SAG1 และเท็กซั Redconjugated แพะป้องกัน -rabbit (แจ็คสัน ImmunoResearch ห้องปฏิบัติการ; 1: 500) แอนติบอดีเจือจางในพีบีเอส ?? 1% (v / v) FBS, 1% (v / v) ซีรั่มแพะปกติและ 0.05% (w / v) ซาโปนิน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Toxoplasma ความเครียดและ lacz แสดงความชื้นสัมพัทธ์โคลน ห้อง 2F เพาะเลี้ยงใน broblast ®หนังหุ้มปลายลึงค์ของมนุษย์ ( hff ) เซลล์ monolayers ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( โมริซากิ et al . , 1995 ) Toxoplasma บุก hff เซลล์ monolayers คือการไฟฟ้า® ed โดยการตรวจหา b-galactosidase 7.4 ( b-gal ) กิจกรรมแสดงออก
โดยปรสิตสายพันธุ์ห้อง 2F ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( และ dobrowolski Sibley , 1996 ) ¯บรีคปุริ®เอ็ดปรสิตถูกแยก hff monolayers ในการบุกรุกปานกลาง [ dmem ‡ 3 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) FBS 20mm ฮีเปส 0.2% ( w / v ) nah2co3 ] 10 หรือ 20 นาทีที่ 378c หลังจากอย่างละเอียดล้างพีบีเอส monolayers เป็น lysed และกิจกรรม b-gal ใช้วิเคราะห์พื้นผิวตาดีกา b-d-galactopyranoside ( อุสติส et al . , 1991 )ถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบตัวเลขและระดับเอนไซม์กับมาตรฐานการ ผลิต โดยการสลายของปรสิตนับใน haemocytometer . มมูโน¯ uorescence ย้อมยังใช้ในการตรวจสอบการบุกรุกของ hff ปรสิตเซลล์ที่ปลูกใน permanox ห้องภาพนิ่ง ( nalge ขณะนี้นานาชาติ )monolayers ติดเชื้อปรสิตสำหรับ 20 นาทีที่ 378c ใน CO 2 ตู้ตาม byabriefwashwithpbsand ® xationfor20minwith2.5 % ( w / v ) ฟอร์มาลดีไฮด์ / 0.02 % ( w / v ) กลูตารัลดีไฮด์ใน PBS เย็นน้ำแข็ง หลังจากที่บล็อก และ permeabilizing monolayers ติดเชื้อสำหรับ 30 นาทีกับ PBS ที่มี 10% ( v / v ) FBS และ 0.05% ( w / v ) ซาโปนิน ( Sigma )ปรสิตที่เกี่ยวข้องกับเซลล์เจ้าบ้านถูกย้อมด้วย anti-sag1 เป็นกระต่ายและเท็กซัส redconjugated แพะป้องกันกระต่าย ( แจ็คสัน immunoresearch ห้องปฏิบัติการ ; 1 : 500 ) ภูมิคุ้มกันเจือจางใน PBS ‡ 1% ( v / v ) FBS 1% ( v / v ) เซรั่มแพะปกติและ 0.05% ( w / v )
อังกฤษ .