(two per accession), 250ng were dou

(two per accession), 250ng were double digested to com- pletion with 5U Msel and 5U EcoR1. Then, 50pmol EcoR1 adaptor and 5pmol Msel adaptor were ligated by adding 1U DNA T4 ligase and incubating at 4ºC overnight. This restriction/ligation solution was diluted 1/10 with do- uble distilled sterile water and 2ul used as a pre-amplifi- cation template, using pre-selective primers Eco R1 (+A) and Mse 1 (+C). The 20ul pre-amplification PCR contai- ned 2mM MgCl2, 30pmol of each primer, 0.5U Taq poly- merase and 0.2mM dNTP, and the cycling regime was 5min at 94ºC, followed by 24 cycles of 94ºC / 30s, 56ºC / 60s and 72ºC / 60s, with a final extension step of 72ºC / 7min. The pre-amplification reaction was diluted 1/50 and 5ul used as a template for the 20ul selective PCR (2mM MgCl2, 6.7ng MseI+3 primer and 32.8ng EcoRI+3 primer, 0.5U Taq polymerase and 0.2mM dNTP). The cy- cling regime consisted of 94ºC / 5min, followed by 12 cycles of 94ºC / 30s, 65ºC (reducing by 0.7°C per cycle) / 30s and 72 ºC / 60s; followed by 24 cycles of 94ºC / 30s, 56ºC / 30s, 72ºC / 60s, and ending with 72ºC / 7min. The samples were concentrated by evaporation under vacuum until reaching a volume of 4ul, and then, 16ul loading buffer was added. The sample was denatured at 96ºC for 5min and electrophoresed through 6% dena- turing polyacrylamide gels, which were silver stained with Silver Sequence stain kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA), following the manufacturer’s ins- tructions. Four AFLP primer combinations were used: E+AAC M+CAA, E+AAC M+CAC, E+ ACG M+CAG, E+AAC M+CAG.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(สองต่อทะเบียน), 250ng มีคู่ต้องการ com-pletion กับ 5U Msel 5U EcoR1 แล้ว อะแดปเตอร์ EcoR1 50pmol และ 5pmol Msel อะแดปเตอร์ถูกควบ โดยเพิ่ม 1U DNA T4 ligase และ incubating ที่ 4ºC ค้างคืน โซลูชั่นจำกัด/ไข่นี้ถูกทำให้เจือจาง 1/10 พร้อมทำ uble กลั่นน้ำฆ่าเชื้อและใช้เป็นแม่แบบก่อน-amplifi-cation, 2ul ใช้ไพรเมอร์ pre-selective Eco R1 (A) และ Mse 1 (C) 20ul ก่อนขยาย PCR contai-เน็ด 2 มม. MgCl2, 30pmol แต่ละพื้น 0.5U Taq โพลี merase และ dNTP 0.2mM และระบอบขี่ได้ 5 นาทีที่ 94ºC ตามรอบ 24 ของ 94ºC / 30s, 56ºC / ยุค 60s และ 72ºC / ยุค 60s กับขั้นสุดท้ายส่วนขยาย 72ºC / นาที 7 ปฏิกิริยาก่อนขยายเป็น 1/50 ที่แตกออกและใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR ใช้ 20ul 5ul (2 มม. MgCl2, 6.7ng 32.8ng และ MseI 3 พื้น EcoRI 3 พื้น 0.5U Taq dNTP พอลิเมอเรสและ 0.2 mM) ประกอบด้วยระบอบยึด cy ของ 94ºC / 5 นาที ตาม ด้วยรอบที่ 12 ของ 94ºC / 30s, 65ºC (ลดลงจาก 0.7° C ต่อวงจร) / 30s และ 72 ºC / ยุค 60s ตามวงจรของ 94ºC 24 / 30s, 56ºC / 30s 72ºC / ยุค 60s และสิ้นสุด ด้วย 72ºC / นาที 7 ตัวอย่างเข้มข้น โดยการระเหยภายใต้สุญญากาศจนถึงปริมาตรของ 4ul แล้ว เพิ่มบัฟเฟอร์โหลด 16ul ตัวอย่าง denatured ที่ 96ºC ใน 5 นาที และ electrophoresed ผ่าน 6% ทัวริง dena polyacrylamide gels ซึ่งมีสีเงินสีกับชุดคราบเงินลำดับ (Promega Corporation เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา), ต่อไปนี้ของอิน tructions ใช้ชุดพื้น AFLP สี่: M E AAC ซีเอเอโฮ E AAC M CAC, E จีบ CAG M, E AAC M CAG.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( สองต่อเข้า ) , 250ng เป็นคู่ย่อยเพื่อ com - pletion กับ 5U msel 5U ecor1 และ . งั้น , อะแดปเตอร์และ ecor1 50pmol 5pmol msel อะแดปเตอร์ถูกผูกโดยการเพิ่มดีเอ็นเอไลเกส และไข่ที่วิด T4 C 4 ºค้างคืน โซลูชั่นจำกัด / Ligation นี้เจือจาง 1 / 10 พร้อมทำ uble กลั่นน้ำ 2ul เป็นหมันและใช้เป็น pre - แม่แบบการ amplifi ,ก่อนเลือกใช้ไพรเมอร์ Eco R1 ( ) และ MSE 1 ( C ) การ 20ul ก่อนขยาย PCR ให้เช่า - เน็ด 2mm ของแต่ละชุด 30pmol , ไพรเมอร์ , 0.5u แทคโพลี - merase 0.2mm และ dntp และจักรยานระบบการปกครองเป็น 5 นาทีที่ 94 º C ตามด้วย 24 รอบ 94 º C / 30 , 56 º C / 60 และ 72 º C / 60s กับขั้นตอนการสุดท้าย 72 º C / 7min .ก่อนขยายปฏิกิริยาเจือจาง 1 / 50 และ 5ul ใช้เป็นแม่แบบสำหรับการ 20ul PCR ( 2mm ชุด 6.7ng msei , 3 และ 3 32.8ng รองพื้นด้วยสีรองพื้นใช้แท็ค 0.5u 0.2mm และ dntp ) ส่วนไซ - ยึดการปกครอง จำนวน 94 º C / 5 นาที ตามด้วย 12 รอบ 94 º C / 30 , 65 º C ( โดยการลด 0.7 ° C ต่อรอบ ) / 30 / 60 และ 72 º C ; ตามด้วย 24 รอบ 94 º C / 30 , 56 º C / 30 วินาที72 º C / 60s และลงท้ายด้วย 72 º C / 7min กลุ่มตัวอย่างเข้มข้นโดยการระเหยภายใต้สุญญากาศ จนถึงปริมาณของ 4ul แล้วโหลดบัฟเฟอร์ 16ul ถูกเพิ่มเข้ามา ตัวอย่างที่ใช้ในº C เป็นเวลา 5 นาที และ electrophoresed 96 ถึง 6 % ดีน่า - ทัวริ่งเจลอะคริลาไมด์ ซึ่งเป็นเงินที่เปื้อนคราบลำดับชุดสีเงิน ( promega Corporation , Madison , WI , USA )ต่อไปนี้เป็นผู้ผลิต INS - tructions . สี่เทคนิคผสมรองพื้นใช้ M : e AAC AAC caa E M the E ACG M และ E AAC M
ฝูงบิน