In order to increase the yield of P

In order to increase the yield of PCR products and to facilitate the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analyses, a nested PCR technique was applied (Qiu and Ting, 2013). For the total bacterial community, the 16S rRNA genes were amplified from the DNA extracts using universal primers 27F (50-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-30) and 1492R (50-GGTTACCTTGTTACGACTT-30), following a temperature cycling conditions: Pre-incubation at 95 C for 2 min, followed by 25 cycles of 95 C for 1 min, 62 C for 1.5 min, and 72 C for 1 min; and a final elongation at 72 C for 10 min. A nested PCR was then performed on the PCR products obtained from previously described primers with a second primer pair 357F-Clamp (50-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-CCTACGGGAGGCAGCAG-30) and 518R (50- ATTACCGCGGCTGCTGG-30), following a cycling program: Preincubation at 95 C for 2 min, followed by 30 cycles of 95 C for 1 min, 60 C for 45 s, and 72 C for 1 min; and a final elongation at 72 C for 10 min. All the PCR amplifications were carried out in a total volume of 50 ml in 200 ml tubes using a DNA thermocycler (Bio Rad, Philadelphia, PA). The PCR mixture contained 1.25 U of Taq polymerase (Promega, Madison, WI), 1PCR buffer, 2 mM MgCl2, 0.5 mmol of each primer, each deoxynucleoside triphosphate at a concentration of 200 mM, and 40 ng of template DNA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพื่อเพิ่มผลผลิตของ PCR ผลิตภัณฑ์ และช่วยวิเคราะห์ electrophoresis (DGGE) เจไล่ระดับ denaturing เทคนิค PCR ซ้อนถูกใช้ (คูและทิง 2013) สำหรับชุมชนแบคทีเรียรวม rRNA 16S มีขยายยีนจากดีเอ็นเอแยกโดยใช้ไพรเมอร์สากล 27F (50-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-30) และ 1492R (50-GGTTACCTTGTTACGACTT-30), อุณหภูมิขี่เงื่อนไขต่อไปนี้: บ่มก่อนที่ C 95 ใน 2 นาที ตาม ด้วย 25 รอบ 95 เซลเซียสใน 1 นาที 62 C 1.5 นาที และ 72 C สำหรับ 1 นาที และ elongation ขั้นสุดท้ายที่ 72 C สำหรับ 10 นาที แล้วทำ PCR ซ้อนบนผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้จากไพรเมอร์ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้กับสองรองพื้นคู่ 357F-แคลมป์ (50-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-CCTACGGGAGGCAGCAG-30) และ 518R (50-ATTACCGCGGCTGCTGG-30), ตามโปรแกรมขี่จักรยาน: Preincubation ที่ C 95 ใน 2 นาที ตาม ด้วยรอบ 30 95 C ใน 1 นาที 60 C 45 s และ 72 C สำหรับ 1 นาที และ elongation ขั้นสุดท้ายที่ 72 C สำหรับ 10 นาที Amplifications PCR ทั้งหมดถูกดำเนินในปริมาณรวมของ 50 ml ในหลอด 200 ml ใช้ thermocycler ดีเอ็นเอ (Bio Rad ฟิลาเดลเฟีย PA) ผสม PCR อยู่ 1.25 U Taq พอลิเมอเรส (Promega เมดิสัน WI) 1 PCR กันชน MgCl2, 0.5 mmol mM 2 แต่ละพื้น โนซีนไตรฟอสเฟตแต่ละ deoxynucleoside ที่ความเข้มข้น 200 มม. และ 40 ng ของแม่แบบดีเอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อที่จะเพิ่มผลผลิตของผลิตภัณฑ์ PCR และเพื่ออำนวยความสะดวกข่าวคราวการไล่ระดับสี denaturing (DGGE) วิเคราะห์เทคนิค PCR ที่ซ้อนกันถูกนำมาใช้ (Qiu และ Ting 2013) สำหรับชุมชนแบคทีเรียรวมยีน 16S rRNA ถูกขยายจากสารสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ไพรเมอร์สากล 27 (50 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-30) และ 1492R (50 GGTTACCTTGTTACGACTT-30) ต่อไปนี้อุณหภูมิเงื่อนไขการขี่จักรยาน: Pre-บ่มที่ 95 องศาเซลเซียส 2 นาทีตามด้วย 25 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 62 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1.5 นาที, และ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที?; และการยืดตัวสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที PCR ที่ซ้อนกันที่ได้ดำเนินการแล้วในผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้รับจากไพรเมอร์อธิบายไว้ก่อนหน้ากับคู่ไพรเมอร์ที่สอง 357F-หนีบ (50 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-CCTACGGGAGGCAGCAG-30) และ 518R (50 ATTACCGCGGCTGCTGG-30) ต่อไปนี้โปรแกรมการขี่จักรยาน: Preinc​​ubation ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 30 รอบจาก 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที?; และการยืดตัวสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ทั้งหมด amplifications PCR ได้ดำเนินการในปริมาณ 50 มล. 200 มลในหลอดโดยใช้ thermocycler ดีเอ็นเอ (Bio ราด, Philadelphia, PA) ส่วนผสม PCR ที่มีอยู่ 1.25 U ของโพลิเมอร์ Taq (Promega, Madison, WI) 1 บัฟเฟอร์ PCR 2 มิลลิ MgCl2, 0.5 มิลลิโมลของแต่ละไพรเมอร์แต่ละ triphosphate deoxynucleoside ที่ความเข้มข้น 200 มิลลิและ 40 นาโนกรัมดีเอ็นเอแม่แบบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อเพิ่มผลผลิต ผลิตภัณฑ์ PCR และอำนวยความสะดวกี่ลาด gel electrophoresis ( การทดลอง ) วิเคราะห์ข้อมูล การประยุกต์ใช้เทคนิคซ้อนเทคนิค ( ชิว และติ่ง , 2013 ) สำหรับชุมชนแบคทีเรียทั้งหมด , เบส 16S rRNA ยีนถูกขยายจากดีเอ็นเอที่สกัดโดยใช้ไพรเมอร์ 27f สากล ( 50-agagtttgatcctggctcag-30 ) และ 1492r ( 50-ggttaccttgttacgactt-30 )ต่อไปนี้เป็นเงื่อนไขก่อนการบ่มที่อุณหภูมิจักรยาน 95  C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 25 รอบ 95  องศาเซลเซียสนาน 1 นาที 62  C 1.5 นาที 72  นาน 1 นาที และสุดท้ายการยืดตัวที่ 72  C นาน 10 นาทีเป็นแบบซ้อนกันโดยก็แสดงบนผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้จากที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้กับสองคู่ไพรเมอร์รองพื้น 357f หนีบ ( 50-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg-cctacgggaggcagcag-30 ) และ 518r ( 50 - attaccgcggctgctgg-30 ) ตามโครงการจักรยาน : พบ 95  C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 30 รอบ  95 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที , 60  C 45 s , และ 72  องศาเซลเซียสนาน 1 นาที ;และการยืดตัวสุดท้ายที่ 72  C 10 นาที amplifications ทั้งหมดโดยทดลองในปริมาณ 50 ml 200 ml หลอดโดยใช้ดีเอ็นเอเทอร์มอไซเคล ์ ( ไบโอ ราด , Philadelphia , PA ) pcr ส่วนผสมที่มีอยู่ 1.25 U ของทัค พอลิเมอเรส ( promega เมดิสัน , WI ) , บัฟเฟอร์  PCR 1 , 2 มม. ชุด 0.5 มิลลิโมลของแต่ละคู่ แต่ละ deoxynucleoside ไตรฟอสเฟตที่ความเข้มข้น 200 มม.และ 40 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ