Quantitative real-time PCRThe expre

Quantitative real-time PCR
The expression levels of three newly identified cytochrome
P450 (CYP6A40, CYP6D8 and CYP6G4) in different life stages (egg,
3d-larva, 3d-pupa and 3d-adult) in the two laboratory strains
(TJS and BJD) and the tissue transcription profiles of eight P450
genes (the three novel P450s and five P450s previously reported
to be over-expressed in other pyrethroid resistance house fly populations)
in different population house flies (3d-female adults)
were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) using a
Mx3000P qPCR System (Stratagene, USA) and RealMasterMix SYBR
Green PCR kit (Tiangen, China). The b-actin gene and RPS3 (ribosomal
protein S3) were used as the reference genes to normalize
expression level of P450 genes among different samples. The ten
specific primers for qRT-PCR were listed in Table 1. The primer
specificity was checked by a melt curve analysis (MxPro 4.0 program,
Stratagene) and by sequencing of the PCR products. Amplification
efficiency was determined by a standard curve based on
10 fold dilution series of cDNA templates, and amplification efficiency
of 100 ± 5% was accepted. Reactions were run in a 25 lL
mixture containing 12.5 lL RealMasterMix/SYBR solution, 0.5 lL
each forward and reverse primer (10 lM), and 3.5 lL cDNA template
with the following reaction conditions: 95 C for 10 min, followed
by 45 cycles of 95 C for 15 s, 58 C for 30 s and 68 C for
15 s. The melting temperatures of amplicons were measured by
taking continuous fluorescence reading whilst increasing temperature
from 58 to 95 C with 0.5 C for 10 s at each step. Each experiment
was repeated with three independent RNA samples as
biological replicates, and each cDNA sample or template-free control
was performed three times as technical replicates. The relative
expression levels of P450 genes were calculated by the 2DDCT
method as described by Livak and Schmittgen [35]. Results were
expressed as mean ± SE of three biological replicates. One-way
analysis of variance (ANOVA) and Student’s t-test were performed
to determine the statistical difference between means (SPSS, version
13). A p-value

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ระดับนิพจน์ของ cytochrome สามระบุใหม่P450 (CYP6A40, CYP6D8 และ CYP6G4) ในขั้นตอนของชีวิต (ไข่หนอน 3d, 3d-ดักแด้ และ 3d-ผู้ใหญ่) ในสายพันธุ์ห้องปฏิบัติการ 2(ทีเจเอสและ BJD) และโพรไฟล์การ transcription เนื้อเยื่อของ P450 แปดยีน (P450s นวนิยายสามและห้า P450s ก่อนหน้านี้รายงานการเกินแสดงในอื่น ๆ pyrethroid ต้านทานบ้านบินประชากร)ในประชากรที่แตกต่างกัน บ้านลอย (ผู้ใหญ่ 3d-หญิง)ได้วิเคราะห์เชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qRT-PCR) โดยใช้การMx3000P qPCR RealMasterMix SYBR และระบบ (Stratagene สหรัฐอเมริกา)ชุดเขียว PCR (Tiangen จีน) ยีน b-แอกตินและ RPS3 (ribosomalโปรตีนที่ S3) ใช้เป็นอ้างอิงยีนปกตินิพจน์การระดับของยีน P450 ในหมู่ตัวอย่างที่แตกต่างกัน สิบไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ qRT PCR ได้แสดงในตารางที่ 1 การรองพื้นspecificity ถูกตรวจสอบ โดยการวิเคราะห์โค้งละลาย (MxPro 4.0 โปรแกรมStratagene) และจัดลำดับผลิตภัณฑ์ PCR ขยายประสิทธิภาพเป็นไปตามเส้นโค้งมาตรฐานตามพับ 10 ชุดเจือจางของ cDNA ต้นแบบ และประสิทธิภาพในการขยายของ 100 ± 5% ยอมรับการ ปฏิกิริยาถูกเรียกใช้ใน 25 จะส่วนผสมที่ประกอบด้วยโซลูชัน RealMasterMix/SYBR จะ 12.5, 0.5 จะแต่ละพื้นไปข้างหน้า และย้อนกลับ (10 lM), และแม่แบบของ cDNA จะ 3.5ด้วยเงื่อนไขของปฏิกิริยาต่อไปนี้: C 95 ใน 10 นาที ตามโดยรอบ 45 ของ 95 C 15 s, 58 C s และ C 68 สำหรับ 3015 s อุณหภูมิการละลายของ amplicons ถูกวัดโดยการอ่าน fluorescence อย่างต่อเนื่องในขณะที่อุณหภูมิเพิ่มขึ้นจาก 58 ถึง 95 C กับ 0.5 C 10 s ในแต่ละขั้นตอน แต่ละการทดลองไม่ซ้ำกับสามอาร์เอ็นเอตัวอย่างอิสระเป็นเหมือน กับชีวภาพ และแต่ละอย่าง cDNA หรือฟรีแม่แบบตัวควบคุมทำสามครั้งเป็นเหมือนกับเทคนิคการ ญาติมีคำนวณนิพจน์ในระดับยีน P450 โดย 2 DDCTวิธีตามที่อธิบายไว้ โดย Livak และ Schmittgen [35] ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นเฉลี่ย± SE ของเหมือนกับชีวภาพ 3 ทางเดียวดำเนินการวิเคราะห์ผลต่างของ (การวิเคราะห์ความแปรปรวน) และ t-ทดสอบของนักเรียนเพื่อกำหนดความแตกต่างทางสถิติระหว่างวิธี (โปรแกรม รุ่น13) . p-ค่า < 0.05 ถือเป็นสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เชิงปริมาณแบบ real-time PCR
ระดับการแสดงออกของสาม cytochrome ระบุใหม่
P450 (CYP6A40, CYP6D8 และ CYP6G4) ในช่วงชีวิตที่แตกต่างกัน (ไข่
3d-อ่อน, 3d-ดักแด้และ 3d ผู้ใหญ่) ในสองสายพันธุ์ในห้องปฏิบัติการ
(TJS และ BJD) และรูปแบบการถอดความเนื้อเยื่อแปด P450
ยีน (สามนวนิยาย P450s และห้า P450s
รายงานก่อนหน้านี้ที่จะเป็นมากกว่าการแสดงในบ้านต้านทานอื่นๆ ไพรีทรอยด์ประชากรบิน)
ในแมลงวันบ้านประชากรแตกต่างกัน (ผู้ใหญ่ 3 มิติหญิง)
วิเคราะห์ตามเวลาจริงเชิงปริมาณ PCR (qRT-PCR) โดยใช้
Mx3000P qPCR ระบบ (Stratagene สหรัฐอเมริกา) และ RealMasterMix SYBR
ชุดสีเขียว PCR (Tiangen, จีน) ยีน B-โปรตีนและ RPS3
(ไรโบโซมโปรตีนS3)
ถูกนำมาใช้เป็นยีนอ้างอิงที่จะปรับระดับการแสดงออกของยีนP450 หมู่ตัวอย่างที่แตกต่างกัน สิบไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ qRT-PCR มีการระบุไว้ในตารางที่ 1 ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์โค้งละลาย(MxPro 4.0 โปรแกรมStratagene) และลำดับของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ ขยายประสิทธิภาพถูกกำหนดโดยเส้นโค้งมาตรฐานขึ้นอยู่กับ10? พับชุดลดสัดส่วนของแม่ cDNA และประสิทธิภาพการขยาย100 ± 5% ได้รับการยอมรับ ปฏิกิริยาวิ่งใน 25 จะมีส่วนผสมที่มี12.5 จะ RealMasterMix / แก้ปัญหา SYBR, 0.5 LL แต่ละข้างหน้าและไพรเมอร์กลับ (10 LM) และ 3.5 แม่แบบของยีนจะมีเงื่อนไขปฏิกิริยาต่อไปนี้: 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตาม45 รอบ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 วินาที, 58 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 และ 68 องศาเซลเซียสสำหรับ15 วินาที อุณหภูมิหลอมละลายของ amplicons ถูกวัดโดยการอ่านอย่างต่อเนื่องในขณะที่เรืองแสงเพิ่มอุณหภูมิ58-95 องศาเซลเซียส 0.5? C เป็นเวลา 10 วินาทีในแต่ละขั้นตอน แต่ละการทดลองซ้ำกับสามตัวอย่าง RNA อิสระซ้ำทางชีวภาพและแต่ละตัวอย่างยีนหรือการควบคุมแม่แบบฟรีได้ดำเนินการสามครั้งเป็นซ้ำทางเทคนิค เทียบระดับการแสดงออกของยีน P450 ถูกคำนวณโดย 2? DDCT วิธีการตามที่อธิบาย Livak และ Schmittgen [35] ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SE สามซ้ำทางชีวภาพ วิธีการหนึ่งที่วิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) และนักศึกษา t-test ได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบความแตกต่างทางสถิติระหว่างหมายความว่า(SPSS, รุ่น13) p-value <0.05 ได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

-
ปริมาณและระดับการแสดงออกของโปรตีนใหม่ ระบุ 3
( cyp6a40 พี , และ cyp6d8 cyp6g4 ) ในชีวิตที่แตกต่างกัน ( ไข่ตัวอ่อนดักแด้
3D , 3D และ 3D ผู้ใหญ่ ) ใน 2 สายพันธุ์ ( และห้องปฏิบัติการ
. บีเจดี ) และเนื้อเยื่อที่ถอดความโปรไฟล์ของยีนพี 8
( สามใหม่ p450s และห้า p450s ก่อนหน้านี้รายงาน
จะแสดงในประชากรบ้านต้านทานแมลงบินอื่นๆ )
บ้านประชากรต่างบิน ( ผู้ใหญ่ 3 มิติหญิง )
วิเคราะห์โดยปริมาณเรียลไทม์พีซีอาร์ ( PCR ข้าพเจ้า ) โดยใช้ระบบ qpcr เป็น
mx3000p ( stratagene , USA ) และ realmastermix SYBR
สีเขียว PCR Kit ( tiangen , จีน ) การ b-actin ยีนและ rps3 ( Protein โปรตีน S3
) ใช้เป็นยีนปกติ
อ้างอิงระดับการแสดงออกของยีนพีของกลุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกัน สิบวิธีเพื่อข้าพเจ้า
เฉพาะ PCR ถูกแสดงไว้ในตารางที่ 1 ไพรเมอร์
เพาะเป็นตรวจสอบโดยละลายการวิเคราะห์ทางโค้ง ( mxpro 4.0 โปรแกรม
stratagene ) และโดยการจัดลำดับของผลิตภัณฑ์ PCR ประสิทธิภาพ (
ถูกกำหนดโดยมาตรฐานเส้นโค้งตาม
10  พับเจือจางยีนชุดของแม่แบบและ
ประสิทธิภาพเพิ่มจำนวน100 ± 5% ได้รับการยอมรับ ปฏิกิริยาที่ถูกใช้ใน 25 ll
ผสมที่ประกอบด้วย 12.5 จะ realmastermix / SYBR สารละลาย 0.5 ll
แต่ละไปข้างหน้าและย้อนกลับ ( 10 รองพื้น LM ) และ 3.5 จะดีเอ็นเอแม่แบบ
ต่อไปนี้ด้วยปฏิกิริยา สภาพ : 95  C นาน 10 นาที ตาม
45 รอบ 95  C 15 , 58  C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 68  C
15 วินาที อุณหภูมิละลายของ amplicons
วัดโดยถ่ายต่อเนื่องจากการอ่านในขณะที่เพิ่มอุณหภูมิ
จาก 58 95  C 0.5  C 10 วินาทีในแต่ละขั้นตอน แต่ละการทดลองกันสามคน

ซ้ำ RNA ที่เป็นอิสระเป็นชีวภาพ และแต่ละสายพันธุ์ตัวอย่างหรือแม่แบบ
ฟรีการควบคุมได้สามครั้งแบบเทคนิค เทียบกับระดับการแสดงออกของยีนพี

2  ddct คำนวณโดยวิธีการตามที่อธิบายไว้โดย livak และ schmittgen [ 35 ] ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±เซ
3 แบบชีวภาพ วิธีวิเคราะห์
หนึ่งของความแปรปรวน ( ANOVA ) และการทดสอบค่าที ( t-test ) นักเรียนมีการปฏิบัติ
เพื่อตรวจสอบความแตกต่างระหว่างค่าเฉลี่ยทางสถิติ ( SPSS เวอร์ชั่น
13 ) p < 0.05 คือการพิจารณาที่สำคัญ