Pharmacological studyPrimary cell c

Pharmacological study
Primary cell culture and treatment
Primary cell culture was carried out as described previously
(Bawankule et al., 2008). In brief, the macrophage cells were collected
from the peritoneal cavities of mice (8-week-old female
swiss albino mice) after an intra peritoneal (i.p.) injection of
1.0 mL of 1% peptone (BD Biosciences, USA) 3 days before harvesting.
Mice were euthanized by cervical dislocation under ether
anesthesia and peritoneal macrophages were obtained by intraperitoneal
(i.p.) injection of Phosphate Buffer Saline (PBS), pH-
7.4. Membrane debris was removed by filtering the cell suspensions
through sterile gauze. The viability of the cells was determined
by trypan blue exclusion and the viable macrophage cells
at the concentration of 0.5 106 live cells/mL were used for the
experimentation. The cells were suspended in RPMI 1640 medium
(Sigma–Aldrich, USA) containing 10% heat-inactivated fetal bovine
serum (Gibco, USA), 100 U/mL of penicillin and 100 lg/mL of streptomycin
and incubated in a culture plate (Nunc, Germany) at 37 C
in 5% CO2 in an incubator. Non-adherent cells were removed after
4 h by removing the culture media and the adherent cells were resuspended
in RPMI 1640 medium containing 10% heat-inactivated
fetal calf serum. Cells were pre-treated with 1 lg/mL and 10 lg/mL
of test compounds and standard anti-inflammatory drug, Dexamethasone
(Sigma–Aldrich, USA) at 1 and 10 lg/mL for 30 min.
The cells were stimulated with lipo-polysaccharide (LPS, 0.5 lg/
mL). After incubation with LPS for 24 h, supernatants were collected
and immediately frozen at 80 C. Harvested supernatants
were tested for quantification of pro-inflammatory mediators, NO
by Griess reagent method and TNF-a, IL-6 by ELISA method according
to the manufacturer’s instructions (BD Biosciences, USA).
Measurement of nitric oxide production
The nitric oxide (NO) production in cell culture were determined
by measuring the nitrite (NO2) formation by using Griess assay
as described previously (Kim et al., 2008). Briefly, 100 lL of
griess reagent (Sigma–Aldrich, USA) containing 1% sulfanilamide
and 0.1% naphtylethyenediamine dihydrochloride in 2.5% H3PO4
was added to 100 lL of cell culture supernatant and incubate for
15 min at room temperature in the dark. The colour density was
measured at 540 nm using a microplate reader (Molecular Devices,
USA). A standard curve was generated in the same method using
NaNO2.
Quantification of pro-inflammatory cytokines
Quantification of TNF-a and IL-6 at protein level in cell culture
supernatant was carried out using Enzyme Immuno Assay (EIA)
Kits from BD Biosciences, USA following the manufacturer’s protocol.
Briefly, the ELISA plates (96 well) were coated (100 lL per
well) with specific mouse TNF-a and IL-6 capture antibody, respectively
and incubate overnight at 4 C. The plate was blocked with
200 lL/well assay diluents. Culture supernatant and standard
(100 lL) were added into the appropriate coated wells and incubated
for 2 h at room temperature (20–25 C). After incubation,
the plates were washed thoroughly 5 times with wash buffer.
100 lL of detecting solution (detection antibody and streptavidin
HRP) were added into each well. Plate incubated for 1 h at room
temperature and then washed thoroughly 5 times with wash buffer.
100 lL of tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution was
added to each well and incubated for 30 min at room temperature
in the dark. Finally 50 lL of stop solution was added to each well.
The colour density was measured at 450 and 570 nm using a
microplate reader (Molecular Devices, USA). Subtract absorbance
at 570 nm from absorbance 450 nm. The values of TNF-a and IL-
6 were expressed as pg/mL.
Measurement of the cell viability
Effect of extracts/compounds on cell viability was carried out in
peritoneal macrophage cells using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyltetrazolium (MTT) assay (Sharma et al., 2012). Peritoneal
macrophage cells (0.5 106 cells/well) isolated from mice
were suspended in RPMI 1640 medium (Sigma, USA) containing
10% heat-inactivated fetal bovine serum (Gibco, USA) and incubated
in a culture 96 well plate at 37 C in 5% CO2 in an incubator
and left overnight to attach. Cells treated with 1% DMSO served as
a vehicle control for cell cytotoxicity study. Compounds were dissolved
in DMSO. Cells were treated (110 lg/mL and 10 lg/mL) and
incubated for 24 h at 37 C in 5% CO2. After incubation, cells with
treatment, 20 lL aliquots of MTT solution (5 mg/mL in PBS) were
added to each well and left for 4 h. Then, the MTT containing medium
was carefully removed and the cells were solubilised in DMSO
(100 lL) for 10 min. The culture plate was placed on a micro-plate
reader (Spectramax; Molecular Devices, USA) and the absorbance
was measured at 550 nm. The amount of colour produced is directly
proportional to the number of viable cells. Cell cytotoxicity
was calculated as the percentage of MTT absorption as follows:
Percentage (%) of survival = (mean experimental absorbance/mean
control absorbance 100).
Statistical analysis
Results were presented as the means ± SE and analyzed using
GraphPad Prism 4. The ANOVA followed by Tukey’s Multiple Comparison
Test was used to assess the statistical significance of vehicle
verses treatment groups. Results are presented as the
means ± SE. Differences with a P value

Pharmacological study
Primary cell culture and treatment
Primary cell culture was carried out as described previously
(Bawankule et al., 2008). In brief, the macrophage cells were collected
from the peritoneal cavities of mice (8-week-old female
swiss albino mice) after an intra peritoneal (i.p.) injection of
1.0 mL of 1% peptone (BD Biosciences, USA) 3 days before harvesting.
Mice were euthanized by cervical dislocation under ether
anesthesia and peritoneal macrophages were obtained by intraperitoneal
(i.p.) injection of Phosphate Buffer Saline (PBS), pH-
7.4. Membrane debris was removed by filtering the cell suspensions
through sterile gauze. The viability of the cells was determined
by trypan blue exclusion and the viable macrophage cells
at the concentration of 0.5  106 live cells/mL were used for the
experimentation. The cells were suspended in RPMI 1640 medium
(Sigma–Aldrich, USA) containing 10% heat-inactivated fetal bovine
serum (Gibco, USA), 100 U/mL of penicillin and 100 lg/mL of streptomycin
and incubated in a culture plate (Nunc, Germany) at 37 C
in 5% CO2 in an incubator. Non-adherent cells were removed after
4 h by removing the culture media and the adherent cells were resuspended
in RPMI 1640 medium containing 10% heat-inactivated
fetal calf serum. Cells were pre-treated with 1 lg/mL and 10 lg/mL
of test compounds and standard anti-inflammatory drug, Dexamethasone
(Sigma–Aldrich, USA) at 1 and 10 lg/mL for 30 min.
The cells were stimulated with lipo-polysaccharide (LPS, 0.5 lg/
mL). After incubation with LPS for 24 h, supernatants were collected
and immediately frozen at 80 C. Harvested supernatants
were tested for quantification of pro-inflammatory mediators, NO
by Griess reagent method and TNF-a, IL-6 by ELISA method according
to the manufacturer’s instructions (BD Biosciences, USA).
Measurement of nitric oxide production
The nitric oxide (NO) production in cell culture were determined
by measuring the nitrite (NO2) formation by using Griess assay
as described previously (Kim et al., 2008). Briefly, 100 lL of
griess reagent (Sigma–Aldrich, USA) containing 1% sulfanilamide
and 0.1% naphtylethyenediamine dihydrochloride in 2.5% H3PO4
was added to 100 lL of cell culture supernatant and incubate for
15 min at room temperature in the dark. The colour density was
measured at 540 nm using a microplate reader (Molecular Devices,
USA). A standard curve was generated in the same method using
NaNO2.
Quantification of pro-inflammatory cytokines
Quantification of TNF-a and IL-6 at protein level in cell culture
supernatant was carried out using Enzyme Immuno Assay (EIA)
Kits from BD Biosciences, USA following the manufacturer’s protocol.
Briefly, the ELISA plates (96 well) were coated (100 lL per
well) with specific mouse TNF-a and IL-6 capture antibody, respectively
and incubate overnight at 4 C. The plate was blocked with
200 lL/well assay diluents. Culture supernatant and standard
(100 lL) were added into the appropriate coated wells and incubated
for 2 h at room temperature (20–25 C). After incubation,
the plates were washed thoroughly 5 times with wash buffer.
100 lL of detecting solution (detection antibody and streptavidin
HRP) were added into each well. Plate incubated for 1 h at room
temperature and then washed thoroughly 5 times with wash buffer.
100 lL of tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution was
added to each well and incubated for 30 min at room temperature
in the dark. Finally 50 lL of stop solution was added to each well.
The colour density was measured at 450 and 570 nm using a
microplate reader (Molecular Devices, USA). Subtract absorbance
at 570 nm from absorbance 450 nm. The values of TNF-a and IL-
6 were expressed as pg/mL.
Measurement of the cell viability
Effect of extracts/compounds on cell viability was carried out in
peritoneal macrophage cells using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyltetrazolium (MTT) assay (Sharma et al., 2012). Peritoneal
macrophage cells (0.5  106 cells/well) isolated from mice
were suspended in RPMI 1640 medium (Sigma, USA) containing
10% heat-inactivated fetal bovine serum (Gibco, USA) and incubated
in a culture 96 well plate at 37 C in 5% CO2 in an incubator
and left overnight to attach. Cells treated with 1% DMSO served as
a vehicle control for cell cytotoxicity study. Compounds were dissolved
in DMSO. Cells were treated (110 lg/mL and 10 lg/mL) and
incubated for 24 h at 37 C in 5% CO2. After incubation, cells with
treatment, 20 lL aliquots of MTT solution (5 mg/mL in PBS) were
added to each well and left for 4 h. Then, the MTT containing medium
was carefully removed and the cells were solubilised in DMSO
(100 lL) for 10 min. The culture plate was placed on a micro-plate
reader (Spectramax; Molecular Devices, USA) and the absorbance
was measured at 550 nm. The amount of colour produced is directly
proportional to the number of viable cells. Cell cytotoxicity
was calculated as the percentage of MTT absorption as follows:
Percentage (%) of survival = (mean experimental absorbance/mean
control absorbance  100).
Statistical analysis
Results were presented as the means ± SE and analyzed using
GraphPad Prism 4. The ANOVA followed by Tukey’s Multiple Comparison
Test was used to assess the statistical significance of vehicle
verses treatment groups. Results are presented as the
means ± SE. Differences with a P value

0/5000

จาก: -

เป็น: -

ผลลัพธ์ (ไทย) 1: [สำเนา]

คัดลอก!

Pharmacological ศึกษาเซลล์หลักวัฒนธรรมและการรักษาเซลล์ปฐมภูมิวัฒนธรรมได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Bawankule et al., 2008) สังเขป เซลล์ macrophage ถูกเก็บรวบรวมจากฟันผุ peritoneal ของหนู (อายุ 8 สัปดาห์เพศหญิงหนู albino สวิส) หลังจากฉีด peritoneal (i.p.) ภายในของ1.0 mL ของ peptone 1% (เวลาออก BD สหรัฐอเมริกา) 3 วันก่อนเก็บเกี่ยวหนูได้ euthanized โดยเคลื่อนปากมดลูกภายใต้อีเทอร์ได้รับยาและบังเอิญ peritoneal โดย intraperitoneal(i.p.) ฉีดของฟอสเฟตบัฟเฟอร์ Saline (PBS), ค่า pH-7.4 เยื่อเศษถูกเอาออก โดยการกรองพักเซลล์โดยใช้ผ้ากอซ กำหนดชีวิตของเซลล์โดยแยกสี trypan และเซลล์ macrophage ได้ที่ความเข้มข้น 0.5 ใช้ 106 สด เซลล์/mL สำหรับการทดลอง เซลล์ถูกหยุดชั่วคราวใน RPMI 1640(ซิก-Aldrich สหรัฐอเมริกา) ที่มี 10% ยกเลิกร้อนครรภ์วัวเซรั่ม (Gibco สหรัฐอเมริกา), U 100 mL ของยาเพนนิซิลลินและ lg 100 mL ของ streptomycinและ incubated ในจานวัฒนธรรม (Nunc เยอรมนี) ที่ 37 Cใน 5% CO2 ในการบ่มเพาะวิสาหกิจ เซลล์ไม่มี adherent ออกหลัง4 h โดยการเอาสื่อวัฒนธรรมและเซลล์นฤมลได้ resuspendedใน RPMI 1640 ประกอบด้วย 10% ความร้อนยกเลิกเซรั่มลูกและทารกในครรภ์ เซลล์ถูกบำบัดก่อน lg 1 mL และ lg 10 mLสารทดสอบและมาตรฐานยาแก้อักเสบ Dexamethasone(ซิก-Aldrich สหรัฐอเมริกา) ที่ 1 และ 10 lg/mL ใน 30 นาทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น ด้วย lipo polysaccharide (LPS, 0.5 lg /มล) หลังจากบ่มด้วย LPS ใน 24 h, supernatants ถูกเก็บรวบรวมและน้ำแข็งทันทีที่ 80 C. Harvested supernatantsทดสอบการนับของ pro-อักเสบ ไม่โดยวิธี Griess รีเอเจนต์ และ TNF เป็น IL-6 โดยตามวิธี ELISAการแนะนำของผู้ผลิต (เวลาออก BD สหรัฐอเมริกา)การวัดผลิตไนตริกออกไซด์การผลิตไนตริกออกไซด์ (NO) ในเซลล์วัฒนธรรมถูกกำหนดโดยการวัดการก่อตัวของไนไตรต์ (NO2) โดยใช้ Griess ทดสอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Kim et al., 2008) สั้น ๆ 100 จะของgriess รีเอเจนต์ (ซิก-Aldrich สหรัฐอเมริกา) มี 1% ซัลฟานิลาไมด์และ dihydrochloride naphtylethyenediamine 0.1% เป็น 2.5% H3PO4เพิ่ม 100 จะเซลล์วัฒนธรรม supernatant และฟักสำหรับ15 นาทีที่อุณหภูมิห้องในมืด มีความหนาแน่นสีวัดที่ 540 nm ใช้อ่าน microplate (อุปกรณ์โมเลกุลสหรัฐอเมริกา) มีสร้างเส้นโค้งมาตรฐานในการใช้วิธีการเดียวกันNaNO2นับของ cytokines pro-อักเสบนับ เป็น TNF และ IL-6 ระดับโปรตีนในเซลล์วัฒนธรรมsupernatant ถูกดำเนินการโดยใช้เอนไซม์ Immuno Assay (EIA)ชุดจากเวลาออก BD สหรัฐอเมริกาดังต่อไปนี้ของโพรโทคอลสั้น ๆ ถูกเคลือบแผ่น ELISA (96 ดี) (100 จะต่อดี) กับเมาส์เฉพาะ TNF เป็น และ IL-6 จับแอนติบอดี ตามลำดับและที่ฟักค้างคืนที่ซี 4 จานที่ถูกบล็อกด้วย200 จะ/ดี assay ตัว วัฒนธรรม supernatant และมาตรฐาน(100 lL) ถูกเพิ่มเข้าไปในบ่อเคลือบที่เหมาะสม และ incubatedสำหรับ h 2 ที่อุณหภูมิห้อง (20-25 C) หลังจากคณะทันตแพทยศาสตร์แผ่นถูกล้างสะอาด 5 ครั้งกับล้างบัฟเฟอร์100 จะตรวจเพิ่ม (ตรวจหาแอนติบอดีและ streptavidinHRP) ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละดี จาน incubated สำหรับ h 1 ห้องอุณหภูมิแล้ว ล้างสะอาด 5 ครั้ง ด้วยล้างบัฟเฟอร์100 จะแก้ปัญหาพื้นผิว tetramethylbenzidine (ทหารไทย)เพิ่มในแต่ละดี และ incubated ใน 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องในมืด สุดท้าย 50 เพิ่มจะต้องแก้ปัญหาให้ดีแต่ละความหนาแน่นสีเป็นวัดที่ 450 และ 570 nm โดยใช้การอ่าน microplate (อุปกรณ์โมเลกุล สหรัฐอเมริกา) ลบ absorbanceที่ 570 nm จาก absorbance 450 nm ค่าของ TNF เป็น และ IL -6 ได้แสดงเป็น pg/mLวัดชีวิตเซลล์ผลของสารสกัด/สารเซลล์นี้ถูกดำเนินการในเซลล์ peritoneal macrophage ใช้ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) วิเคราะห์ (Sharma et al., 2012) Peritonealเซลล์ macrophage (เซลล์ 0.5 106 ดี) แยกต่างหากจากหนูถูกหยุดชั่วคราวใน RPMI 1640 ปานกลาง (ซิก สหรัฐอเมริกา) ที่ประกอบด้วย10% ยกเลิกร้อนครรภ์วัวซีรั่ม (Gibco สหรัฐอเมริกา) และ incubatedในวัฒนธรรม 96 ด้วยแผ่น 37 C ใน 5% CO2 ในการบ่มเพาะวิสาหกิจและซ้ายค้างคืนที่แนบ เซลล์รักษา ด้วย 1% DMSO เสิร์ฟควบคุมรถเซลล์ cytotoxicity ศึกษา สารประกอบมีส่วนยุบใน DMSO เซลล์ได้รับการรักษา (lg 110 มล.และ lg 10 mL) และincubated ใน 24 ชมที่ 37 C ใน 5% CO2 หลังจากบ่ม เซลล์รักษา 20 จะ aliquots ของ MTT (5 mg/mL ใน PBS) ได้เพิ่มในแต่ละดี และซ้ายสำหรับ 4 h แล้ว MTT ที่ประกอบด้วยขนาดกลางอย่างถูกเอาออก และเซลล์ถูก solubilised ใน DMSO(100 lL) สำหรับ 10 นาที วัฒนธรรมจานวางอยู่บนแผ่นไมโครอ่าน (Spectramax อุปกรณ์โมเลกุล สหรัฐอเมริกา) และ absorbance ที่มีวัดที่ 550 nm จำนวนสีที่ผลิตได้โดยตรงสัดส่วนกับจำนวนของเซลล์ทำงานได้ เซลล์ cytotoxicityคำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของการดูดซึมของ MTT เป็นดังนี้:เปอร์เซ็นต์ (%) ของการอยู่รอด = (หมายถึงทดลอง absorbance/ค่า เฉลี่ยควบคุม absorbance 100)วิเคราะห์ทางสถิติผลลัพธ์ที่แสดงเป็นหมายถึง± SE และวิเคราะห์โดยใช้GraphPad ปริซึม 4 วิเคราะห์ความแปรปรวนตาม ด้วยเปรียบเทียบหลายของ Tukeyใช้ทดสอบเพื่อประเมินนัยสำคัญทางสถิติของยานพาหนะข้อกลุ่มบำบัด มีแสดงผลเป็นการหมายถึง ± SE แตกต่างกับค่า P < 0.05 ได้ถืออย่างมีนัยสำคัญ

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:[สำเนา]

คัดลอก!

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:[สำเนา]

คัดลอก!

การศึกษาฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาและการเพาะเลี้ยงเซลล์รักษา

เพาะเลี้ยงเซลล์หลักได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
( bawankule et al . , 2008 ) ในช่วงสั้น ๆ , เซลล์แมคโครฟาจจำนวน
จากโพรงช่องท้องในหนู ( 8-week-old หญิง
สวิส เผือกหนู ) หลังตรวจภายในช่องท้อง ( IP ) ฉีด
1.0 มิลลิลิตร 1 % ตามลำดับ ( BD BIOSCIENCES , USA ) 3 วัน ก่อนเก็บเกี่ยว .
หนู euthanized โดยปากมดลูก เคลื่อนภายใต้อีเทอร์
ยาชา และทางแมคโครฟาจได้ โดยใน
( IP ) การฉีดน้ำเกลือ ( PBS ) , ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.4 -
. เยื่อเศษออกด้วยการกรองเซลล์แขวนลอย
ผ่านผ้าพันแผลเป็นหมัน ความมีชีวิตของเซลล์ ตั้งใจ
โดยไตรแพนสีฟ้าการยกเว้นและใช้แมโครเฟจเซลล์
ที่ความเข้มข้น 0

การแปล กรุณารอสักครู่..

ภาษาอื่น ๆ

การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.