AbstractQuorum sensing, bacterial c

Abstract
Quorum sensing, bacterial cell-to-cell communication, has been linked to the virulence of pathogenic bacteria. Indeed, in vitro experiments have shown that many bacterial pathogens regulate the expression of virulence genes by this cell-to-cell communication process. Moreover, signal molecules have been detected in samples retrieved from infected hosts and quorum sensing disruption has been reported to result in reduced virulence in different host–pathogen systems. However, data on in vivo quorum sensing activity of pathogens during infection of a host are currently lacking. We previously reported that quorum sensing regulates the virulence of Vibrio harveyi in a standardised model system with gnotobiotic brine shrimp (Artemia franciscana) larvae. Here, we monitored quorum sensing activity in Vibrio harveyi during infection of the shrimp, using bioluminescence as a read-out. We found that wild-type Vibrio harveyi shows a strong increase in quorum sensing activity early during infection. In this respect, the bacteria behave remarkably similar in different larvae, despite the fact that only half of them survive the infection. Interestingly, when expressed per bacterial cell, Vibrio harveyi showed around 200-fold higher maximal quorum sensing-regulated bioluminescence when associated with larvae than in the culture water. Finally, the in vivo quorum sensing activity of mutants defective in the production of one of the three signal molecules is consistent with their virulence, with no detectable in vivo quorum sensing activity in AI-2- and CAI-1-deficient mutants. These results indicate that AI-2 and CAI-1 are the dominant signals during infection of brine shrimp.

Keywords: quorum sensing, infection, vibriosis, host-microbe interaction
Go to:
Introduction
Quorum sensing, bacterial cell-to-cell communication, is a mechanism of gene regulation in which bacteria coordinate the expression of certain genes in response to the presence of small signal molecules (Jayaraman and Wood, 2008). Quorum sensing was first discovered in the marine bacterium Vibrio fischeri and was thought to be restricted to only a limited number of species. Later on, similar systems were found to be present in many other bacteria, including a still growing list of bacteria that are pathogenic to plants, animals and humans (Williams et al., 2000; Rasko and Sperandio, 2010). Moreover, signal molecules have been detected in samples retrieved from infected hosts (Singh et al., 2000) and quorum sensing disruption has been reported to result in reduced virulence in different host–pathogen systems (Hentzer et al., 2003; von Bodman et al., 2003; Defoirdt et al., 2008). Until now, studies reporting on quorum sensing activity in animal pathogens were mostly either performed in vitro in nutrient-rich synthetic growth media, or based on samples taken from infected hosts. However, data on in vivo quorum sensing activity of pathogens during infection of a host are currently lacking (Defoirdt et al., 2010a).

Vibrio harveyi, the causative agent of luminescent vibriosis, is one of the most important pathogens of aquatic animals, causing significant losses in the aquaculture industry worldwide (Defoirdt et al., 2007). The species is also one of the model organisms in studies on quorum sensing in bacteria (Ng and Bassler, 2009). Vibrio harveyi contains a three-channel quorum sensing system, with three different types of signal molecules (HAI-1, AI-2 and CAI-1, respectively) feeding a common signal transduction cascade (Figure 1). HAI-1, harveyi autoinducer-1, is 3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone; AI-2, autoinducer-2, is the furanosyl borate diester 3A-methyl-5,6-dihydro-furo(2,3-D)(1,3,2)diox-aborole-2,2,6,6A-tetraol; and CAI-1, cholerae autoinducer-1, is (S)-3-hydroxytridecan-4-one. In addition to bioluminescence, Vibrio harveyi quorum sensing has been found to control the expression of different virulence genes in vitro, including a type III secretion system (Henke and Bassler, 2004a), extracellular toxin (Manefield et al., 2000), metalloprotease (Mok et al., 2003), siderophore (Lilley and Bassler, 2000), chitinase (Defoirdt et al., 2010b) and phospholipase (Natrah et al., 2011). However, scientists are becoming increasingly aware that growth in complex environments of the ‘real world' (such as a host) contrasts with the standardised and idealised conditions in laboratory monocultures (Smith, 2000; Virgin, 2007). Hence, although in vitro work has revealed much information on quorum sensing in bacterial pathogens, it is important to develop systems that allow studying the phenomenon as it actually occurs, during infection of a host.

Figure 1
Figure 1
The Vibrio harveyi quorum sensing system. The LuxM, LuxS and CqsA enzymes synthesise the autoinducers HAI-1, AI-2 and CAI-1, respectively. These autoinducers are detected at the cell surface by the LuxN, LuxP-LuxQ and CqsS receptor proteins, respectively. ...
We previously reported that quorum sensing regulates the virulence of Vibrio harveyi in a standardised model system in which gnotobiotic brine shrimp (Artemia franciscana) larvae are challenged by immersion (Defoirdt et al., 2005). As brine shrimp are particle filter feeders, the challenge procedure allows infection to develop in a natural way, with the vibrios being accumulated in the gastro-intestinal tract and causing damage to the gut epithelium (Gunasekara et al., 2012). Recently, we developed an experimental procedure allowing us to measure virulence gene expression of vibrios in vivo during infection of brine shrimp larvae and found that the Vibrio harveyi quorum sensing master regulator gene luxR showed a peak in in vivo expression levels in virulent isolates early during infection, whereas the expression levels remained low in an avirulent isolate (Ruwandeepika et al., 2011b). However, to obtain good quantification, we needed to take 500 larvae per sample for these analyses. As a consequence, the assay did not allow us to determine the variability in the pathogen's quorum sensing activity between different larvae (which is quite relevant given the fact that some larvae survive the infection, whereas others die) nor did it allow to monitor the activity in specific individuals over time. Furthermore, the culture conditions were different from those of our standardised challenge test (for example, no feeding, much larger culture volumes).

Here, we aimed at investigating Vibrio harveyi quorum sensing activity in individual brine shrimp larvae cultured under the same conditions as applied in our standard challenge test, without needing to kill the animals to perform the measurements. As brine shrimp larvae are transparent, using bioluminescence as a read-out of quorum sensing activity allowed us to perform this kind of analysis. Quorum sensing-regulated bioluminescence has been used before in many studies investigating the quorum sensing activity of Vibrio harveyi (Bassler et al., 1994; Freeman and Bassler, 1999; Surette et al., 1999; Lilley and Bassler, 2000; Mok et al., 2003; Henke and Bassler, 2004b). We found that the bacteria behave remarkably similar in different larvae, despite the fact that only half of them survive the infection. The in vivo quorum sensing activity of mutants defective in the production of one of the three signal molecules is consistent with their virulence, confirming that AI-2 and CA-1 are the dominant signals during infection of brine shrimp.

Go to:
Materials and methods
Vibrio harveyi strains and growth conditions

Wild-type strain BB120 (ATCC BAA-1116) and quorum sensing mutants BB152 (luxM::Tn5; Bassler et al., 1994), MM30 (luxS::Tn5; Surette et al., 1999), JMH603 (cqsA::CmR; Henke and Bassler, 2004b) and JAF548 (luxO D47E linked to KnR; Freeman and Bassler, 1999) were grown in Luria-Bertani medium containing 35 g l−1 Instant Ocean synthetic sea salt (Aquarium Systems Inc., Sarrebourg, France).

Brine shrimp culture conditions and challenge tests

Sterile brine shrimp larvae were obtained as described previously (Defoirdt et al., 2005). The shrimp were cultured in groups of 20 larvae in glass tubes containing 10 ml synthetic sea water (35 g l−1 Instant Ocean) or individually in the wells of black 96-well plates containing 200 μl synthetic sea water. The larvae were fed an autoclaved suspension of Aeromonas sp. LVS3 bacteria at 107 cells ml−1 and Vibrio harveyi strains were added at 105 CFU ml−1, as described previously (Defoirdt et al., 2006).

Luminescence measurements

Luminescence was measured using a Tecan Infinite 200 microplate reader (Tecan, Mechelen, Belgium). Luminescence per larva of vibrios associated with brine shrimp larvae was determined by measuring luminescence of the wells containing challenged larvae (either individuals or groups of five larvae) and by correcting for bioluminescence of wells containing culture water without larvae (containing feed and vibrios only). In case of measurements on individuals, larvae were first stocked in glass tubes containing 10 ml synthetic sea water. After addition of the feed suspension and the Vibrio harveyi strains, 200 μl aliquots with one single larva or without larva were transferred into the wells of a 96-well plate. The plate was incubated in the Tecan microplate reader at 28 °C and luminescence of the wells was measured every 6 h. For measurements on groups of larvae, the larvae were cultured in the glass tubes until the sampling point. At the sampling point, 200 μl aliquots with or without larvae were transferred into the wells of a 96-well plate and luminescence was measured immediately. All reported results are representative of at least two independent experiments.

Determination of bacterial cell density

Bacterial cell density in the brine shrimp culture water was determined by spread plating on Luria-Bertani agar containing 35 g l−1 Instant Ocean. Bacterial numbers associated with shrimp larvae were determined by homogenising rins

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

นามธรรม
ควอรัมไร้สาย การสื่อสารเซลล์เซลล์แบคทีเรีย มีการเชื่อมโยงกับ virulence ของแบคทีเรียอุบัติ แน่นอน ในหลอดทดลองได้แสดงว่า โรคแบคทีเรียในควบคุมค่าของยีน virulence โดยกระบวนการสื่อสารของเซลล์เซลล์นี้ นอกจากนี้ สัญญาณโมเลกุลพบในตัวอย่างที่ดึงมาจากโฮสต์ที่ติดไวรัส และตรวจทรัพยองค์ประชุมมีรายงานว่า virulence ลดลงผลในระบบ host–pathogen แตกต่างกัน อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับองค์ประชุมในสัตว์ทดลองที่ตรวจของโรคในระหว่างการติดเชื้อของโฮสต์ในปัจจุบันไม่มีการ เราเคยรายงานว่า ตรวจองค์ประชุมกำหนด virulence ของผล harveyi ในระบบแบบจำลองที่มีตัวอ่อนของกุ้งในน้ำเกลือ (Artemia franciscana) gnotobiotic ที่นี่ เราตรวจสอบตรวจวัดกิจกรรมในผล harveyi ในระหว่างการติดเชื้อของกุ้ง ควอรัมใช้ bioluminescence เป็น read-out การ เราพบการ harveyi ต่อป่าชนิดที่แสดงการเพิ่มขึ้นแข็งแกร่งองค์ประชุมตรวจกิจกรรมก่อนระหว่างการติดเชื้อ ประการนี้ แบคทีเรียทำเหมือนในตัวอ่อนแตกต่างกัน แม้ว่า เพียงครึ่งหนึ่งของพวกเขาอยู่รอดเชื้อ เรื่องน่าสนใจ เมื่อแสดงต่อเซลล์แบคทีเรีย ต่อ harveyi พบประมาณ 200-fold สูงควอรัมสูงสุดการตรวจระเบียบ bioluminescence เมื่อเชื่อมโยงกับตัวอ่อนกว่าน้ำวัฒนธรรม สุดท้าย ควอรัมในสัตว์ทดลองที่ตรวจวัดกิจกรรมของสายพันธุ์ที่มีข้อบกพร่องในการผลิตของสัญญาณโมเลกุลสามคือสอดคล้องกับ virulence ของพวกเขา ควอรัมในสัตว์ทดลองไม่สามารถตรวจวัดกิจกรรมในสายพันธุ์ AI-2 - และไก-1-ไม่ ผลลัพธ์เหล่านี้ระบุว่า AI-2 และ 1 ไก สัญญาณหลักในระหว่างการติดเชื้อของน้ำเกลือกุ้ง

คำสำคัญ: ตรวจ ติดเชื้อ vibriosis โฮสต์จุลชีพควอรัม
ไป:
แนะนำ
องค์ประชุมการตรวจ การสื่อสารของเซลล์เซลล์แบคทีเรีย มีกลไกการควบคุมยีนแบคทีเรียประสานงานค่าของยีนบางอย่างในการตอบสนองของโมเลกุลสัญญาณขนาดเล็ก (Jayaraman และไม้ 2008) องค์ประชุมตรวจถูกค้นพบครั้งแรกใน fischeri ต่อแบคทีเรียทะเล และมีความคิดที่จะจำกัดเพียงจำนวนจำกัดของสปีชีส์ ในภายหลัง มีระบบคล้ายพบจะมีอยู่ในแบคทีเรียอื่น ๆ มากมาย รวมถึงรายการยังคงเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่อุบัติพืช สัตว์ และมนุษย์ (วิลเลียมส์และ al., 2000 Rasko ก Sperandio, 2010) นอกจากนี้ สัญญาณโมเลกุลพบในตัวอย่างที่ดึงมาจากโฮสต์ที่ติดเชื้อ (สิงห์ร้อยเอ็ด al., 2000) และควอรัมทรัพยการตรวจได้รับรายงานผลในระบบ host–pathogen แตกต่างกัน (Hentzer และ al., 2003; virulence ลดลง ฟอน Bodman et al., 2003 Defoirdt et al., 2008) จนถึงขณะนี้ ศึกษารายงานในองค์ประชุมตรวจกิจกรรมในโรคสัตว์ส่วนใหญ่ทำการเพาะเลี้ยงในสื่อที่อุดมไปด้วยสารสังเคราะห์เติบโต หรือตามตัวอย่างที่นำมาจากโฮสต์ที่ติดเชื้อ อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับองค์ประชุมในสัตว์ทดลองที่ตรวจของโรคในระหว่างการติดเชื้อของโฮสต์จะขาด (Defoirdt et al., 2010a) ปัจจุบัน

ต่อ harveyi ตัวแทนสาเหตุการของ luminescent vibriosis เป็นหนึ่งในโรคสำคัญของสัตว์น้ำ ทำให้ขาดทุนอย่างมีนัยสำคัญในอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำทั่วโลก (Defoirdt et al., 2007) สายพันธุ์แห่งหนึ่งของสิ่งมีชีวิตจำลองในองค์ประชุมตรวจในแบคทีเรีย (Ng และ Bassler, 2009) การศึกษา ต่อ harveyi ประกอบด้วยองค์ประชุมสามช่องตรวจระบบ มีสามชนิดต่าง ๆ ของสัญญาณโมเลกุล (ไฮ-1, AI 2 และไก-1 ตามลำดับ) อาหารแบบทั่วไปสัญญาณ transduction ทั้งหมด (รูปที่ 1) ไฮ-1, autoinducer harveyi-1, 3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone เป็น AI-2, autoinducer-2 เป็น furanosyl borate diester 3A-methyl-5,6-dihydro-furo(2,3-D) (1,3,2) diox-aborole-2,2,6, 6A-tetraol และไก-1, cholerae autoinducer-1 เป็น (S) -3-hydroxytridecan-4-หนึ่ง นอกจาก bioluminescence ผล harveyi ควอรัมตรวจพบการควบคุมค่าของยีน virulence ต่าง ๆ การเพาะเลี้ยง รวมถึงระบบหลั่ง III (Henke และ Bassler, 2004a), ชนิดพิษ extracellular (Manefield et al., 2000), metalloprotease (หมอกและ al., 2003), siderophore (Lilley และ Bassler, 2000), chitinase (Defoirdt et al., 2010b) และ phospholipase (Natrah et al., 2011) อย่างไรก็ตาม นักวิทยาศาสตร์จะกลายเป็นมากขึ้นทราบว่า เจริญเติบโตในสภาพแวดล้อมที่ซับซ้อนของ 'โลกจริง' (เช่นโฮสต์) ความแตกต่างกับเงื่อนไขแบบ และ idealised ในห้องปฏิบัติการ monocultures (Smith, 2000 เวอร์จิน 2007) ดังนั้น แม้ ว่าในงานได้เปิดเผยข้อมูลมากตรวจควอรัมในโรคแบคทีเรีย เป็นสิ่งสำคัญในการพัฒนาระบบที่ช่วยให้การศึกษาปรากฏการณ์จะเกิดขึ้น ในระหว่างการติดเชื้อของการโฮสต์

รูปที่ 1
1 รูป
องค์ประชุมการ harveyi ต่อระบบไร้สาย เอนไซม์ LuxM, LuxS และ CqsA synthesise autoinducers ไฮ-1, AI 2 และไก-1 ตามลำดับ Autoinducers เหล่านี้ตรวจพบที่ผิวเซลล์ โดย LuxN, LuxP LuxQ และ CqsS ตัวรับ โปรตีน ตามลำดับ ...
เราเคยรายงานว่า ตรวจองค์ประชุมกำหนด virulence ของผล harveyi ในระบบแบบจำลองแบบใน gnotobiotic ใดท้าทายน้ำเกลือกุ้ง (Artemia franciscana) ตัวอ่อน โดยการแช่ (Defoirdt et al., 2005) เป็นกุ้งน้ำเกลือ feeders กรองอนุภาค ท้าทายกระบวนการช่วยให้การพัฒนาในลักษณะธรรมชาติ การติดเชื้อ กับ vibrios ที่ถูกสะสมในงดและก่อให้เกิดความเสียหายของไส้ epithelium (Gunasekara et al., 2012) ล่าสุด เราพัฒนาขั้นตอนการทดลองที่ทำให้เราสามารถวัด virulence ยีนของสัตว์ทดลองในระหว่างเชื้อของตัวอ่อนกุ้งน้ำเกลือ vibrios และพบว่าองค์ประชุม harveyi ผลที่ตรวจพบสูงสุดในระดับสัตว์ทดลองในนิพจน์ใน virulent แยกก่อนในระหว่างการติดเชื้อ luxR ยีนควบคุมหลัก ในขณะที่ระดับนิพจน์ยังคงต่ำในการ avirulent แยก (Ruwandeepika et al, 2011b) อย่างไรก็ตาม รับนับดี ที่เราต้องการใช้ตัวอ่อน 500 ต่อตัวอย่างสำหรับวิเคราะห์เหล่านี้ ผล วิเคราะห์ไม่อนุญาตให้เรากำหนดความแปรผันในควอรัมของศึกษาตรวจกิจกรรมระหว่างตัวอ่อนแตกต่างกัน (ซึ่งจะเกี่ยวข้องค่อนข้างให้ความจริงที่ว่า ตัวอ่อนบางอยู่รอดเชื้อ ในขณะที่คนอื่นตาย) หรือไม่ก็อนุญาตให้ติดตามการทำงานในกำหนดเวลา นอกจากนี้ สภาพวัฒนธรรมแตกต่างจากการทดสอบความท้าทายแบบของเรา (เช่น ไม่มีอาหาร ไดรฟ์ข้อมูลวัฒนธรรมที่ใหญ่มาก)

ที่นี่ เรามุ่งตรวจสอบองค์ประชุมการ harveyi ผลตรวจกิจกรรมในตัวอ่อนกุ้งน้ำเกลือแต่ละอ่างภายใต้เงื่อนไขเดียวกันกับที่ใช้ในการทดสอบของเราท้าทายมาตรฐาน ไม่จำเป็นต้องฆ่าสัตว์เพื่อทำการประเมิน ตัวอ่อนจะไม่โปร่งใส ใช้ bioluminescence เป็น read-out ขององค์ประชุมตรวจกิจกรรมให้เราทำการวิเคราะห์ชนิดนี้เป็นกุ้งน้ำเกลือ องค์ประชุมการตรวจระเบียบ bioluminescence ได้ใช้ก่อนในหลายการศึกษาตรวจสอบองค์ประชุมตรวจการ harveyi ผล (Bassler et al., 1994 ฟรีแมนและ Bassler, 1999 Surette et al., 1999 Lilley และ Bassler, 2000 หมอกและ al., 2003 Henke ก Bassler, 2004b) เราพบว่า แบคทีเรียที่ทำงานเหมือนในตัวอ่อนแตกต่างกัน ทั้ง ๆ ที่เพียง ครึ่งหนึ่งของพวกเขาอยู่รอดเชื้อ ควอรัมในสัตว์ทดลองที่ตรวจวัดกิจกรรมของสายพันธุ์ที่มีข้อบกพร่องในการผลิตของสัญญาณโมเลกุลสามอย่างใดอย่างหนึ่งจะสอดคล้องกับ virulence ของพวกเขา ยืนยันว่า AI-2 และ CA-1 เป็นสัญญาณหลักในระหว่างการติดเชื้อของน้ำเกลือกุ้ง

ไป:
วัสดุและวิธีการ
ผล harveyi สายพันธุ์และสภาพการเจริญเติบโต

ชนิดป่าต้องใช้ BB120 (ATCC บา-1116) และการตรวจสายพันธุ์ BB152 ควอรัม (luxM::Tn5 Bassler et al., 1994), MM30 (luxS::Tn5 Surette et al., 1999), JMH603 (cqsA::CmR Henke และ Bassler, 2004b) และ JAF548 (D47E กับ KnR; luxO ฟรีแมนและ Bassler, 1999) ถูกปลูกใน Luria Bertani ขนาดกลางที่มี 35 g l−1 เกลือสังเคราะห์ทะเลมหาสมุทรทันที (พิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำระบบ Inc., Sarrebourg ฝรั่งเศส)

น้ำเกลือกุ้งวัฒนธรรมเงื่อนไข และท้าทายทดสอบ

ตัวอ่อนกุ้งน้ำเกลือฆ่าเชื้อได้รับตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Defoirdt et al., 2005) กุ้งมีอ่างในกลุ่ม 20 ตัวอ่อน ในหลอดแก้วที่ประกอบด้วยน้ำทะเลสังเคราะห์ 10 ml (35 g l−1 มหาสมุทรทันที) หรือแยกกัน ในบ่อของแผ่นดี 96 สีดำที่ประกอบด้วยน้ำทะเลสังเคราะห์ μl 200 ตัวอ่อนได้รับการระงับ autoclaved แบคทีเรีย Aeromonas sp. LVS3 ที่ ml−1 107 เซลล์ และมีเพิ่มสายพันธุ์การ harveyi ต่อที่ 105 CFU ml−1 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Defoirdt และ al., 2006) .

Luminescence วัด

Luminescence ถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่าน microplate Tecan อนันต์ 200 (Tecan, Mechelen เบลเยียม) Luminescence ต่อหนอน vibrios ที่เกี่ยวข้องกับตัวอ่อนกุ้งน้ำเกลือที่ถูกกำหนด โดยวัด luminescence ของบ่อที่ประกอบด้วยตัวอ่อนสนุก ๆ (บุคคลหรือกลุ่มของตัวอ่อนห้า) และการแก้ไขสำหรับ bioluminescence บ่อประกอบด้วยน้ำวัฒนธรรม โดยตัวอ่อน (ประกอบด้วยอาหารและ vibrios เท่านั้น) ในกรณีบุคคล วัด ตัวอ่อนได้ก่อนเก็บในหลอดแก้วที่ประกอบด้วยน้ำทะเลสังเคราะห์ 10 ml หลังจากนี้ระงับอาหารและสายพันธุ์การ harveyi ผล aliquots μl 200 มีหนอนหนึ่งเดียว หรือไม่ มีหนอนมีการถ่ายโอนในบ่อของจานดี 96 จานมี incubated ในเครื่องอ่าน microplate Tecan ที่ 28 ° C และ luminescence ของบ่อถูกวัดทุก h 6 สำหรับการประเมินในกลุ่มของตัวอ่อน ตัวอ่อนมีอ่างในหลอดแก้วจนถึงจุดสุ่มตัวอย่าง จุดสุ่ม aliquots μl 200 มี หรือไม่ มีตัวอ่อนถูกโอนย้ายไปยังบ่อของจานดี 96 และ luminescence ถูกวัดทันที ทั้งหมดรายงานผลเป็นตัวแทนของน้อยสองอิสระทดลอง

กำหนดความหนาแน่นของเซลล์แบคทีเรีย

ความหนาแน่นของเซลล์แบคทีเรียในน้ำกุ้งน้ำเกลือวัฒนธรรมถูกกำหนด โดยชุบแพร่กระจายบน Luria Bertani agar ที่ประกอบด้วยมหาสมุทรทันที l−1 กรัม จำนวนแบคทีเรียที่เกี่ยวข้องกับตัวอ่อนของกุ้งถูกกำหนด โดย homogenising rins

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ความต้องการเทคโนโลยีการนามธรรม
แบคทีเรีย , เซลล์เพื่อการสื่อสารได้ถูกเชื่อมโยงกับความรุนแรงของเชื้อโรคแบคทีเรีย แน่นอน ในหลอดทดลองพบว่าเชื้อโรคแบคทีเรียหลายควบคุมการแสดงออกของยีนในเซลล์ของโรคนี้กระบวนการสื่อสารระหว่างเซลล์ นอกจากนี้โมเลกุลสัญญาณได้ถูกตรวจพบในตัวอย่างที่ดึงจากโฮสต์ที่ติดเชื้อและการหยุดชะงักที่ได้รายงานผลในการลดความรุนแรงในโฮสต์และระบบเชื้อแตกต่างกันองค์ประชุม . อย่างไรก็ตาม ข้อมูลโดยองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมของเชื้อโรคในระหว่างการติดเชื้อของโฮสต์กำลังขาดเราเคยรายงานว่า ความต้องการเทคโนโลยีการควบคุมความรุนแรงของ Vibrio harveyi ในแบบมาตรฐานด้วยระบบ gnotobiotic กุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่ง ( อาร์ทีเมีย franciscana ) ตัวอ่อน ที่นี่เราตรวจสอบองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรม Vibrio harveyi ในระหว่างการติดเชื้อของกุ้ง โดยใช้ไบโอลูมิเนสเซนเป็นอ่านออก .เราพบว่าของ Vibrio harveyi พบเพิ่มแข็งแรงในองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมแรกในระหว่างการติดเชื้อ ในส่วนนี้ แบคทีเรียทำตัวอย่างน่าทึ่งที่คล้ายกันในวัยที่แตกต่างกัน แม้จะมีความจริงที่ว่าเพียงครึ่งหนึ่งของพวกเขารอดจากการติดเชื้อ ทั้งนี้ เมื่อแสดงออกต่อเซลล์ แบคทีเรียVibrio harveyi พบประมาณ 200 เท่า สูงกว่าสูงสุดองค์ประชุมสัมผัสไบโอลูมิเนสเซนควบคุมเมื่อเกี่ยวข้องกับตัวอ่อนกว่าในวัฒนธรรมน้ำ ในที่สุด โดยองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมของพวกกลายพันธุ์ที่บกพร่องในการผลิตของหนึ่งในสามของโมเลกุลสัญญาณสอดคล้องกับความรุนแรงของพวกเขา ไม่พบฤทธิ์ในองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมใน ai-2 - cai-1-deficient มนุษย์กลายพันธุ์ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า ai-2 และ cai-1 เป็นเด่นสัญญาณในระหว่างการติดเชื้อของกุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่ง

คำสำคัญ : องค์ประชุมจากการติดเชื้อวิบริโอซีส , โฮสต์จุลชีพปฏิสัมพันธ์ :


ไปเบื้องต้นทราบจากแบคทีเรีย , เซลล์เพื่อการสื่อสารของเซลล์เป็นกลไกของยีนกฎระเบียบที่แบคทีเรียประสานงานการแสดงออกของยีนบางอย่างในการปรากฏตัวของโมเลกุลสัญญาณขนาดเล็ก ( jayaraman และไม้ , 2008 ) องค์ประชุมสัมผัสถูกค้นพบครั้งแรกในทะเลแบคทีเรีย Vibrio fischeri และคิดว่าจะถูก จำกัด เพียงจำนวน จำกัด ของชนิด ต่อมา ระบบที่คล้ายกันที่พบจะอยู่ในแบคทีเรียอื่น ๆรวมทั้งยังรายชื่อการเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่เป็นเชื้อโรคพืช สัตว์ และมนุษย์ ( วิลเลียม et al . , 2000 ; rasko และ sperandio , 2010 ) นอกจากนี้โมเลกุลสัญญาณได้ถูกตรวจพบในตัวอย่างที่ดึงจากโฮสต์ที่ติดเชื้อ ( Singh et al . , 2000 ) และจากการได้รับรายงานผลในการลดความรุนแรงในระบบโฮสต์และองค์ประชุม ( เชื้อโรคต่าง hentzer et al . , 2003 ;ฟอน บ็อดเมิ่น et al . , 2003 ; defoirdt et al . , 2008 ) จนถึงตอนนี้ ศึกษาความต้องการเทคโนโลยีการรายงานกิจกรรมสัตว์เชื้อโรค ส่วนใหญ่ทั้งในหลอดทดลองอุดมไปด้วยสารอาหารสังเคราะห์ในการสื่อ หรือจากตัวอย่างจากโฮสต์ที่ติดเชื้อ อย่างไรก็ตาม ข้อมูลโดยองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมของเชื้อโรคในระหว่างการติดเชื้อของโฮสต์กำลังขาด ( defoirdt et al . ,

2010a )Vibrio harveyi ตัวแทนที่เป็นสาเหตุของโรคเรืองแสง , เป็นหนึ่งในโรคที่สำคัญของสัตว์น้ำ ก่อให้เกิดความสูญเสียที่สำคัญในอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำทั่วโลก ( defoirdt et al . , 2007 ) ชนิดที่เป็นหนึ่งในรูปแบบสิ่งมีชีวิตในการศึกษาข้อมูลในแบคทีเรีย ( และองค์ประชุมของ bassler , 2009 ) Vibrio harveyi ที่มีสามช่องระบบการตรวจจับองค์ประชุม ,สามประเภทที่แตกต่างกันของโมเลกุลสัญญาณ ( hai-1 ai-2 cai-1 , และ , ตามลำดับ ) การให้สัญญาณทั่วไปผ่านน้ำตก ( รูปที่ 1 ) hai-1 5 , autoinducer-1 , 3-hydroxybutanoyl-l-homoserine แลคโตน ; ai-2 autoinducer-2 , เป็น furanosyl บอเรต diester 3a-methyl-5,6-dihydro-furo ( 2,3-d ) ( 1,3,2 ) diox-aborole-2,2,6,6a-tetraol และ cai-1 autoinducer-1 อ , ,( S ) - 3-hydroxytridecan-4-one . นอกจากไบโอลูมิเนสเซน Vibrio harveyi , องค์ประชุมสัมผัสได้รับการพบในการควบคุมการแสดงออกของยีนของโรคที่แตกต่างกันในหลอดทดลอง รวมถึงสามประเภทของระบบการหลั่ง ( เฮงก์ และ bassler 2004a , ) และสารพิษ ( manefield et al . , 2000 ) metalloprotease ( ม็อค et al . , 2003 ) , pH และ bassler ( ลิลลี่ , 2000 ) , ไคติเนส ( defoirdt et al . ,2010b ) และชิ้น ( natrah et al . , 2011 ) อย่างไรก็ตาม นักวิทยาศาสตร์จะกลายเป็นมากขึ้นตระหนักถึงการเจริญเติบโตในสภาพแวดล้อมที่ซับซ้อนของ ' จริง ' ( เช่นโฮสต์ ) แตกต่างกับมาตรฐานห้องปฏิบัติการ และ idealised เงื่อนไขในทรีตเมนต์ ( Smith , 2000 ; บริสุทธิ์ , 2007 ) ดังนั้น ถึงแม้ว่าในหลอดทดลองทำงานได้เปิดเผยข้อมูลมากในการตรวจจับองค์ประชุมในแบคทีเรียเชื้อโรค ,มันเป็นสิ่งสำคัญที่จะพัฒนาระบบที่อนุญาตให้ศึกษาปรากฏการณ์ที่เป็นจริงเกิดขึ้นในระหว่างการติดเชื้อของโฮสต์ รูปที่ 1


รูปที่ 1
Vibrio harveyi องค์ประชุมสัมผัสระบบ การ luxm luxs cqsa , และเอนไซม์สังเคราะห์ autoinducers hai-1 ai-2 cai-1 , และ ตามลำดับ autoinducers เหล่านี้จะพบในเซลล์ผิว โดย luxn luxp luxq cqss , และโปรตีนตัวรับ ตามลำดับ . . . . . . ..
เราก่อนหน้านี้รายงานว่า ความต้องการเทคโนโลยีการควบคุมความรุนแรงของ Vibrio harveyi ในมาตรฐานรูปแบบระบบที่ gnotobiotic กุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่ง ( อาร์ทีเมีย franciscana ) ตัวอ่อนจะถูกท้าทายโดยการแช่ ( defoirdt et al . , 2005 ) เป็นกุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่งมี feeders กรองอนุภาค ขั้นตอนที่ท้าทายให้ติดเชื้อเพื่อพัฒนาในทางที่เป็นธรรมชาติกับสายพันธุ์ที่ถูกสะสมในระบบทางเดินอาหารระบบย่อยอาหาร และก่อให้เกิดความเสียหายกับลำไส้เยื่อบุผิว ( gunasekara et al . , 2012 ) เมื่อเร็วๆ นี้เราพัฒนาเป็น 2 ขั้นตอนช่วยให้เราสามารถวัดความรุนแรงของการแสดงออกของยีนในสิ่งมีชีวิตสายพันธุ์ในระหว่างการติดเชื้อของกุ้งวัยอ่อนชนิด และพบว่า Vibrio harveyi องค์ประชุมสัมผัสต้นแบบควบคุมยีน luxr พบสูงสุดในระดับการแสดงออกซึ่งความรุนแรงในแยกแรกในระหว่างการติดเชื้อ ส่วนระดับการแสดงออกยังคงต่ำใน avirulent แยก ( ruwandeepika et al .2011b , ) อย่างไรก็ตาม เพื่อให้ได้ปริมาณที่ดี เราต้องใช้ 500 ตัวต่อตัวอย่างเพื่อวิเคราะห์เหล่านี้ ผลที่ตามมา ( ไม่อนุญาตให้เราเพื่อตรวจสอบความหลากหลายของเชื้อโรคในองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมระหว่างวัยที่แตกต่างกัน ( ซึ่งค่อนข้างที่เกี่ยวข้องได้รับความจริงที่ว่าบางตัวอ่อนรอดจากการติดเชื้อในขณะที่คนอื่นตาย ) หรือทำให้การตรวจสอบกิจกรรมเฉพาะบุคคลตลอดเวลา นอกจากนี้ เงื่อนไขวัฒนธรรมแตกต่างจากที่ของเราท้าทายทดสอบมาตรฐาน ( เช่น ไม่มีนมใหญ่มากวัฒนธรรมเล่ม ) .

ที่นี่เลยเรามุ่งตรวจสอบ Vibrio harveyi องค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมในแต่ละชนิด กุ้งวัยอ่อนที่เพาะเลี้ยงภายใต้เงื่อนไขเดียวกันที่ใช้ในการทดสอบความท้าทายของเรามาตรฐานโดยไม่จำเป็นต้องฆ่าสัตว์ที่จะทำการวัด เป็นกุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่งอ่อนใส ใช้ไบโอลูมิเนสเซนเป็นอ่านออกกิจกรรมตรวจวัดองค์ประชุมให้เราเพื่อดำเนินการชนิดของการวิเคราะห์ไบโอลูมิเนสเซนควบคุมการตรวจจับองค์ประชุมได้ถูกใช้มาก่อนในหลายการศึกษาตรวจสอบองค์ประชุมสัมผัสกิจกรรมของ Vibrio harveyi ( bassler et al . , 1994 ; ฟรีแมน และ bassler , 1999 ; surette et al . , 1999 ; และลิลลี่ bassler , 2000 ; มก et al . , 2003 ; เฮงก์ และ bassler 2004b , ) เราพบว่าแบคทีเรียทำตัวอย่างน่าทึ่งคล้ายกับหนอนต่าง ๆแม้จะมีความจริงที่ว่าเพียงครึ่งหนึ่งของพวกเขารอดจากการติดเชื้อ ในตัวกิจกรรมความต้องการเทคโนโลยีการกลายพันธุ์ บกพร่องในการผลิตของหนึ่งในสามของโมเลกุลสัญญาณสอดคล้องกับความรุนแรงของตน และยืนยันว่า ai-2 ca-1 เป็นเด่นสัญญาณในระหว่างการติดเชื้อของกุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่ง

ไปวัสดุและวิธีการ :



และ Vibrio harveyi สายพันธุ์เงื่อนไขการเจริญเติบโตbb120 สายพันธุ์ชนิดป่าและ baa-1116 ) และสายพันธุ์ bb152 การตรวจจับองค์ประชุม ( luxm : : tn5 ; bassler et al . , 1994 ) mm30 ( luxs : : tn5 ; surette et al . , 1999 ) jmh603 ( cqsa : : CMR ; เฮงก์ และ bassler 2004b , ) และ jaf548 ( el salvador . kgm d47e เชื่อมโยง KNR ; ฟรีแมน และ bassler , 1999 ) ปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 35 กรัมลุเรียแบร์ตานิ L − 1 ( ตู้ปลาทะเลเกลือทะเลสังเคราะห์สำเร็จรูประบบอิงค์ sarrebourg , ฝรั่งเศส ) .

สภาพการเลี้ยงกุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่งและท้าทายทดสอบ

เป็นหมันน้ำเกลือกุ้งตัวอ่อนได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( defoirdt et al . , 2005 ) กุ้งที่เพาะเลี้ยงในกลุ่มของ 20 ตัวอ่อนหลอดแก้วบรรจุ 10 ml สังเคราะห์น้ำทะเล ( 35 g L −มหาสมุทร 1 ทันที ) หรือบุคคลในบ่อสีดำ 96 ดีจานที่มี 200 μผมสังเคราะห์ น้ำทะเลตัวอ่อนที่ได้รับการสังเคราะห์ระงับเชื้อแบคทีเรียที่ sp . lvs3 107 เซลล์ ml − 1 และ Vibrio harveyi สายพันธุ์ที่ 105 CFU ml เป็น− 1 , ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( defoirdt et al . , 2006 ) .



เรืองแสงเรืองแสงวัดวัดโดยใช้ TECAN อนันต์ 200 พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( ทีแคนเมเคเลน , , เครื่องอ่าน เบลเยียม )การต่อสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับตัวอ่อนของกุ้งวัยอ่อนชนิด ถูกกำหนดโดยการวัดแสงของบ่อที่มีความอ่อน ( ทั้งบุคคลหรือกลุ่มของห้าตัวอ่อน ) และการแก้ไขสำหรับไบโอลูมิเนสเซนของบ่อที่มีน้ำวัฒนธรรมโดยตัวอ่อน ( ที่มีอาหารและสายพันธุ์เท่านั้น ) ในกรณีของการวัดในแต่ละบุคคลและเป็นครั้งแรกที่เลี้ยงในหลอดแก้วบรรจุ 10 ml สังเคราะห์น้ำทะเล หลังจากเพิ่มฟีดระงับและ Vibrio harveyi สายพันธุ์ , 200 μผมเฉยๆกับตัวอ่อนหรือดักแด้เดียวโดยไม่ต้องถูกย้ายเข้าไปในบ่อของ 96 ครับจาน จานถูกบ่มในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยที่ 28 ° C TECAN อ่านและเรืองแสงจากบ่อวัดทุก 6 ชั่วโมงสำหรับวัดในกลุ่มของตัวอ่อน ตัวอ่อน เพาะเลี้ยงในหลอดแก้วจนคนจุด ในประเด็นการสุ่มตัวอย่าง , 200 μผมเฉยๆ หรือไม่อ่อนโอนในบ่อของ 96 ดีจานและเรืองแสงได้ทันที ทั้งหมดรายงานผลที่เป็นตัวแทนของอย่างน้อยสองการทดลองอิสระ



ปริมาณความหนาแน่นเซลล์แบคทีเรียความหนาแน่นเซลล์แบคทีเรียในกุ้งกุลาดำน้ำเค็มน้ำกำหนดโดยกระจายชุบบนลุเรียแบร์ตานิวุ้นจำนวน 35 g L − 1 ทันทีมหาสมุทร แบคทีเรียที่เกี่ยวข้องกับตัวเลขของลูกกุ้งวัยอ่อนถูกกำหนดโดย homogenising Rins