Heart homogenate from a single fish

Heart homogenate from a single fish (F1) was also used to challenge a single fish (smolt). A volume of 0.2 mL of tissue homogenate was i.p. injected into a healthy naïve smolt The aim was to examine if infections virus could be retrieved from salmon heart tissue that had been decomposing for 120 h. Blood (for haematocrit), gills, kidney and heart (for real-time RT-PCR) were sampled from this fish after 11 days. 2.4.4. RNA extraction and real-time RT-PCR of water samples.
Prior to RNA extraction, salmonid alphavirus (SAV) was cultured as described in Andersen et al. (2010) and 7 µL of SAV was added to each sample as an exogenous control.
The nsP1 real-time RT-PCR assay targeting the SAV nsP1 (Andersen et al., 2010) and the assay ISAV7 (Plarre et al., 2005) targeting the segment 7 of the ISA virus were used to detect SAV and ISA virus RNA, respectively. Verso TM 1-step qRT-PCR ROX kit was used for the real-time RT-PCR, using the following modifications for each reaction:6.25 µL 5 × buffer, 0.625 µL RT-enhancer, 0.125 µL enzyme mix, 2.0 µL template and DEPC treated water up to a final volume of 12.5 µL. The primers and probe volumes were adjusted to the optimised concentration of each assay as described below. Non-template controls were used in all runs. Analysis was performed in an ABI 7500 sequence detection system (Applied Biosystems). The reaction was 15 min at 50 ºC (reverse transcription), 15 min at 95 ºC (polymerase activation), followed by 45 cycles of 95 ºC for 15 s (DNA-dissociation) and 60 ºC for 1 min (annealing and elongation). The threshold was fixed at 0.1 for all runs. All real-time RT-PCR samples were performed in triplicates and no cut-off values were used in the subsequent analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

homogenate หัวใจจากปลาเดียว (f1) นอกจากนี้ยังถูกใช้ในการท้าทายปลาเดียว (smolt) ปริมาณ 0.2 มิลลิลิตร homogenate เนื้อเยื่อเป็น i.p. ฉีดเข้าไปใน smolt ไร้เดียงสาที่มีสุขภาพดีมีจุดมุ่งหมายคือการตรวจสอบว่าการติดเชื้อไวรัสที่สามารถดึงออกมาจากปลาแซลมอนเนื้อเยื่อหัวใจที่ได้รับการย่อยสลายเป็นเวลา 120 ชั่วโมง เลือด (ตัวอย่าง hematocrit) เหงือกไตและหัวใจ (เวลาจริง RT-PCR) มีตัวอย่างจากปลานี้หลังจาก 11 วัน 2.4.4 การสกัดอาร์เอ็นเอและเรียลไทม์ RT-PCR ของตัวอย่างน้ำ.
ก่อนที่จะมีการสกัดอาร์เอ็นเอ salmonid alphavirus (sav) เป็นที่เลี้ยงตามที่อธิบายไว้ในเซนตอัล (2010) และ 7 ไมโครลิตรของ sav ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละตัวอย่างเช่นการควบคุมจากภายนอก
เรียลไทม์วิเคราะห์ RT-PCR nsp1 เป้าหมาย nsp1 sav (เซน et al,.2010) และ isav7 ทดสอบ (plarre และคณะ. 2005) การกำหนดเป้​​าหมายส่วนที่ 7 จากไวรัส ISA ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบ sav และไวรัสอาร์เอ็นเอไอซาตามลำดับ ซ้าย TM 1 ขั้นตอนชุด Rox QRT-PCR ที่ใช้สำหรับเรียลไทม์ RT-PCR โดยใช้การปรับเปลี่ยนต่อไปนี้สำหรับแต่ละปฏิกิริยา: 6.25 ไมโครลิตร 5 ×บัฟเฟอร์, 0.625 ไมโครลิตร RT-เพิ่ม, 0.125 ผสมเอนไซม์ไมโครลิตร 2.0 ไมโครลิตรและแม่ depc รักษาน้ำได้ถึงเล่มสุดท้ายจาก 125 ไมโครลิตร ไพรเมอร์และปริมาณการสอบสวนได้รับการปรับให้มีความเข้มข้นที่ดีที่สุดของแต่ละทดสอบตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง ควบคุมไม่ได้แม่แบบถูกนำมาใช้ในการทำงานทั้งหมด การวิเคราะห์ได้ดำเนินการใน ABI 7500 ระบบการตรวจสอบลำดับ (ศาสตร์ประยุกต์) ปฏิกิริยา 15 นาทีที่ 50 องศาเซลเซียส (ถอดความกลับ), 15 นาทีที่ 95 º C (การเปิดใช้โพลิเมอร์)ตามด้วย 45 รอบจาก 95 º C เป็นเวลา 15 วินาที (dna-แยกออกจากกัน) และ 60 º C เป็นเวลา 1 นาที (การหลอมและการยืดตัว) เกณฑ์คงที่ 0.1 วิ่งทั้งหมด ทั้งหมดในเวลาจริงตัวอย่าง RT-PCR ได้ดำเนินการใน triplicates และไม่มีค่าตัดถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ที่ตามมา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Homogenate หัวใจจากปลาเดี่ยว (F1) ยังใช้ท้าปลาเดี่ยว (smolt) ปริมาตรของ 0.2 mL ของเนื้อเยื่อ homogenate ถูกฉีดเข้าไปใน smolt ขำน่าเพื่อสุขภาพที่มีจุดมุ่งหมายเพื่อ ตรวจสอบว่าการติดเชื้อไวรัสสามารถถูกดึงจากเนื้อเยื่อหัวใจปลาแซลมอนที่มีแล้วพืชพันธุ์สำหรับเลือด h. 120 (สำหรับ haematocrit), gills, i.p. ไตและหัวใจ (ในแบบเรียลไทม์ RT-PCR) ได้ตัวอย่างจากปลานี้หลังวันที่ 11 2.4.4 การอาร์เอ็นเอสกัดและ RT-PCR แบบเรียลไทม์ของน้ำตัวอย่าง
ก่อนสกัดอาร์เอ็นเอ alphavirus salmonid (SAV) มี cultured ได้ตามที่อธิบายไว้ในแอนเดอร์ et al. (2010) และ 7 µL ของ SAV ถูกเพิ่มเข้าไปแต่ละอย่างเป็นตัวควบคุมบ่อย
การ nsP1 แบบเรียลไทม์ RT-PCR วิเคราะห์กำหนดเป้าหมาย SAV nsP1 (แอนเดอร์ et al., 2010) และทดสอบ ISAV7 (Plarre et al., 2005) การกำหนดเป้าหมายส่วน 7 ของไวรัส ISA ใช้ตรวจ SAV และอาร์เอ็นเอไวรัส ISA ตามลำดับ ใช้สำหรับในแบบเรียลไทม์ RT-PCR ใช้ปรับเปลี่ยนต่อไปนี้สำหรับแต่ละปฏิกิริยา: 6.25 µL 5 ×บัฟเฟอร์ verso TM 1 ขั้น qRT PCR ROX ชุด 0.625 µL เพิ่ม RT, 0.125 µL เอนไซม์ผสม 2.0 µL แม่ และ DEPC รักษาน้ำได้ปริมาตรสุดท้ายของ 125 ΜL ไพรเมอร์และโพรบไดรฟ์ข้อมูลถูกปรับปรุงเพื่อความเข้มข้นของแต่ละการทดสอบตามที่อธิบายไว้ด้านล่างบวม ไม่ใช่แม่แบบตัวควบคุมถูกใช้ในการเรียกใช้ทั้งหมด ทำการวิเคราะห์ในระบบตรวจสอบลำดับ ABI 7500 (Biosystems ใช้) ปฏิกิริยา 15 นาทีที่ 50 ºC (ย้อน transcription), 15 นาทีที่ 95 ºC (พอลิเมอเรสเปิดใช้งาน), ตามวงจร 45 ของ 95 ºC 15 s (dissociation ดีเอ็นเอ) และ 60 ºC ใน 1 นาที (การอบเหนียวและ elongation) กำหนดขีดจำกัดที่ 0.1 สำหรับการใช้งาน ตัวอย่าง RT-PCR แบบเรียลไทม์ทั้งหมดได้ดำเนินการใน triplicates และไม่มีค่าตัดถูกใช้ในการวิเคราะห์ต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

homogenate ใจกลางจากปลาตัวเดียว( F 1 )ถูกใช้เพื่อความท้าทายปลาตัวเดียว( smolt ) ระดับเสียงของ 0.2 มล.ของ homogenate เนื้อเยื่อเป็น i.p. ฉีดเข้าไปใน smolt จึงกลายเป็นเรื่องที่ดีต่อ สุขภาพ มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาว่าการติดไวรัสไม่สามารถเรียกคืนได้จากเนื้อเยื่อบริเวณใจกลางปลาแซลมอนที่ได้รับการปฎิบัติสำหรับ 120 ชั่วโมง เลือด(สำหรับ haematocrit )หน้าซีดหัวใจและไต(สำหรับแบบ real - time Rt - pcr )เป็นตัวอย่างจากปลาแห่งนี้หลังจาก 11 วัน 2.4.4 . การขุดเจาะ rna และแบบ real - time Rt - pcr ของตัวอย่างน้ำ.
ก่อนที่จะคัดลอก rna alphavirus salmonid ( sav )เป็นทางวัฒนธรรมเช่นที่อธิบายไว้ในแอนเดอร์เซ่น et al . ( 2010 )และ 7 μ L ของ sav ถูกเพิ่มในตัวอย่างแต่ละครั้งเป็นการควบคุม exogenous ที่
สอบ Rt - pcr 1 แบบเรียลไทม์ NSP ที่ตั้งเป้าหมายไว้ sav NSP 1 (แอนเดอร์เซ่น et al .2010 )และ isav สอบที่ 7 ( plarre et al . 2005 )ส่วนเป้าหมายที่ 7 ของไวรัส ISA ได้ถูกใช้เพื่อตรวจหา sav isa ,ไวรัสและ rna ตามลำดับ. หน้าซ้ายมือของหนังสือ TM 1 - ขั้นตอน QRT - pcr rox ชุดนั้นถูกใช้สำหรับ Real - Time Rt - pcr ,การใช้ที่ต่อไปนี้:การแก้ไขสำหรับแต่ละการตอบสนอง: 6.25 μ L 5 × buffer , 0.625 μ L Rt - Contrast Enhancer , 0.125 μ L เอนไซม์ผสม, 2.0 μ L เทมเพลตและ depc ได้รับการปฏิบัติน้ำได้ถึงสุดท้ายระดับเสียงของ 12 .5 µl. อุปกรณ์ตรวจสอบปริมาณและ primers ที่มีการปรับเปลี่ยนการรวมกลุ่มซึ่งได้รับการปรับแต่งด้านการสอบแต่ละครั้งเช่นที่อธิบายไว้ด้านล่างนี้ การควบคุมแบบไม่มีเทมเพลตได้ถูกนำมาใช้ในการวิ่งทั้งหมด การวิเคราะห์ได้ดำเนินการในระบบ 7500 ตามลำดับการตรวจจับ ABI (ใช้ biosystems ) ปฏิกริยาที่เป็น 15 นาทีที่ 50 ºC (การถอดสคริปต์ย้อนกลับ) 15 นาทีที่ 95 ºC (การเปิดใช้งาน polymerase )ตามมาด้วย 45 รอบของ 95 ºC สำหรับ 15 วินาที(ดีเอ็นเอ - ไม่ลงเนื้อเห็นด้วย)และ 60 ºC สำหรับ 1 นาที( elongation และ annealing ) เกณฑ์ขั้นต่ำที่กำหนดไว้ที่ 0.1 สำหรับการวิ่งทั้งหมด แบบ real - time Rt - pcr ตัวอย่างทั้งหมดนั้นดำเนินการใน triplicates และไม่มีค่าตัด - ปิดจะถูกใช้ในการวิเคราะห์ใน ภายหลัง ได้