Samples were delipidated by adding

Samples were delipidated by adding 1.5 mL of ice cold acetone
and mixing well, put at −80 °C overnight and one tenth fraction removed
for protein quantification. Samples were centrifuged at
7000 rpm for 1 h at 4 °C. Acetone was removed and the pellet dried
down in a nitrogen stream and stored at −80 °C. Protein quantification
of the aliquot was determined using the BCA quantification kit
(Thermo Fisher Scientific 23225) as directed. Lipid droplet protein
fractions were pooled for at least 50 μg protein per sample. The sample
preparation was done in three biological replicates (3 N2 versus 3
daf-2) to evaluate reproducibility and statistical significance of the
differential abundance values.
Given the small sample amount we decided on the trifluoroethanol
based protocol [25] for preparation of the samples for the LC–MS/MS
analysis. Briefly, the sample was resolubilized in 50 μl of NH4HCO3
(pH 7.8) using short pulses in 5510 Branson ultrasonic water bath
(Branson Ultrasonics) for 3 min. After adding 50 μl of trifluoroethanol,
to denature the proteins the samples were incubated at 60 °C for 2 h
with gentle shaking (1000 rpm). Upon incubation the samples were diluted
5-fold with NH4HCO3 (pH 7.8), supplemented with trypsin
(Promega) 1:25 w/w trypsin-to-protein ratio and additionally incubated
for 3 h at 37 °C to digest the proteins into peptides. After the digestion,
the samples were dried up using Speed-Vac and resolubilized in
nanopure water. The 0.5-μg aliquots were analyzed on an LTQ Orbitrap
Velos mass spectrometer that was interfaced with a 75 μm i.d. 65 cm
long LC column packed with 3-μm Jupiter C18 particles (Phenomenex)
as has been described before [26]. The acquiredMS/MS spectra datasets
were preprocessed with DeconMSn [27] and DtaRefinery [28] software
followed by spectra interpretation using MSGFplus [29] software by
matching against WormBase WS210 protein fasta file. The resulting
peptide-to-spectrum matches were processed by MSnID Bioconductor
package to ensure the maximum number of peptide identifications
while not exceeding 1% of false discovery rate. After exporting the results
as a spectral counting cross-tab (rows are proteins, columns are
samples and values in the table are the number ofMS/MS identifications
of peptides belonging to a given protein) we applied Poisson-based
model (using msmsTests Bioconductor package) to discover proteins
differentially abundant between the lipid droplets from N2 and daf-2
mutant strains.
2.4. Fatty acid composition and lipid analysis of isolated lipid

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่าง delipidated โดยการเพิ่ม 1.5 mL ของน้ำแข็งเย็นอะซิโตนและผสมดี −80 ° C แอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์และหนึ่งสิบเศษออกสำหรับโปรตีนนับ ตัวอย่างที่ centrifuged ที่7000 rpm สำหรับ h 1 ที่ 4 องศาเซลเซียส อะซีโตนถูกเอาออก และเม็ดที่แห้งลงในกระแสไนโตรเจน และเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส โปรตีนนับของส่วนลงตัวถูกกำหนดโดยใช้ชุดนับ BCA(เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ 23225) ตามด้วย โปรตีนหยดไขมันเศษส่วนได้ถูกทางถูกพูสำหรับโปรตีน μg 50 ต่อตัวอย่าง ตัวอย่างเตรียมทำในสามชีวภาพสามารถจำลอง (3 N2 กับ 3เยอรมัน-2) เพื่อประเมิน reproducibility และนัยสำคัญทางสถิติของการค่าความแตกต่างจำนวนตัวอย่างขนาดเล็กที่ให้ เราตัดสินใจในการ trifluoroethanolใช้โพรโทคอล [25] สำหรับการเตรียมตัวอย่างสำหรับ LC – MS/MSวิเคราะห์ ตัวอย่างสั้น ๆ ถูก resolubilized ใน μl 50 ของ NH4HCO3กะพริบ (pH 7.8) ใช้ย่อในอ่างน้ำ ultrasonic แบรนสัน 5510(แบรนสัน Ultrasonics) ใน 3 นาที หลังจากเพิ่ม 50 μl ของ trifluoroethanolการ denature โปรตีน ตัวอย่างที่ incubated ที่ 60 ° C สำหรับ 2 hด้วยใจที่สั่น (1000 rpm) เมื่อบ่ม ตัวอย่างถูกทำให้เจือจาง5-fold กับ NH4HCO3 (pH 7.8), เสริม ด้วยทริปซิน(Promega) 1:25 w/w อัตราส่วนทริปซินโปรตีน และ incubated นอกจากนี้สำหรับ h 3 ที่ 37 ° C ย่อยโปรตีนให้เป็นเปปไทด์ หลังจากย่อยอาหารเหือดแห้งโดยใช้ความเร็ว Vac และ resolubilized ในตัวอย่างน้ำ nanopure Aliquots 0.5 μg ได้วิเคราะห์ในการ Orbitrap LTQVelos โดยรวมสเปกโตรมิเตอร์ที่ถูก interfaced กับประชาชน 75 μm 65 ซม.ยาว LC คอลัมน์ที่บรรจุ ด้วยอนุภาค C18 จูปิเตอร์ 3-μm (Phenomenex)เป็นได้ถูกอธิบายไว้ก่อน [26] Datasets แรมสเป็คตรา acquiredMS/MSมี preprocessed กับ DeconMSn [27] และซอฟต์แวร์ DtaRefinery [28]ตาม ด้วยแรมสเป็คตราตีโดยใช้ซอฟต์แวร์ MSGFplus [29] โดยจับคู่กับแฟ้ม fasta โปรตีน WormBase WS210 การส่งผลเพปไทด์สเปกตรัมตรงถูกประมวลผล โดย MSnID Bioconductorแพคเกจให้จำนวนรหัสเพปไทด์ในขณะที่ไม่เกิน 1% ของอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด หลังจากส่งออกผลลัพธ์เป็นสเปกตรัมการนับข้ามแท็บ (โปรตีนอยู่แถว คอลัมน์ตัวอย่างและค่าในตารางคือ รหัส ofMS/MS หมายเลขของเปปไทด์ของโปรตีนกำหนด) เราใช้ใช้ปัวซองรูปแบบ (ใช้แพคเกจ Bioconductor msmsTests) ได้โปรตีนdifferentially อุดมสมบูรณ์ระหว่างหยดไขมันจาก N2 และเยอรมัน 2สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์2.4 กรดไขมันองค์ประกอบและกระบวนการวิเคราะห์แยกไขมัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่าง delipidated โดยการเพิ่ม 1.5 ml
ของน้ำแข็งเย็นอะซีโตนและการผสมกันใส่ที่-80
องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืนและส่วนหนึ่งในสิบลบออกสำหรับปริมาณโปรตีน ตัวอย่างหมุนเหวี่ยงที่
7000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส อะซีโตนจะถูกลบออกและเม็ดแห้งลงในกระแสไนโตรเจนและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส
ปริมาณโปรตีนของ aliquot ถูกกำหนดโดยใช้ชุดปริมาณ BCA (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ 23225) เป็นผู้กำกับ หยดไขมันโปรตีนเศษส่วนถูกรวบรวมเป็นเวลาอย่างน้อย 50 ไมโครกรัมโปรตีนต่อตัวอย่าง ตัวอย่างการเตรียมการได้ทำในสามซ้ำทางชีวภาพ (3 N2 เมื่อเทียบกับ 3 DAF-2) เพื่อประเมินการทำสำเนาและนัยสำคัญทางสถิติของความแตกต่างค่าความอุดมสมบูรณ์. ได้รับจำนวนเงินที่กลุ่มตัวอย่างขนาดเล็กที่เราตัดสินใจใน trifluoroethanol ตามโปรโตคอล [25] สำหรับการเตรียมการของกลุ่มตัวอย่าง สำหรับ LC-MS / MS วิเคราะห์ สั้น ๆ , ตัวอย่างถูก resolubilized 50 ไมโครลิตรของ NH4HCO3 (pH 7.8) โดยใช้พัลส์สั้น ๆ ใน 5510 แบรนสันอ่างน้ำอัลตราโซนิก(Ultrasonics แบรนสัน) เป็นเวลา 3 นาที หลังจากเพิ่ม 50 ไมโครลิตรของ trifluoroethanol, การลบล้างโปรตีนตัวอย่างที่ถูกบ่มที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่มีความอ่อนโยนสั่น(1000 รอบต่อนาที) เมื่อบ่มตัวอย่างที่ถูกปรับลด5 เท่าด้วย NH4HCO3 (pH 7.8) เสริมด้วย trypsin (Promega) 01:25 w / w การ trypsin อัตราส่วนต่อการบ่มโปรตีนและยังเป็นเวลา3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในการย่อยโปรตีนเปปไทด์เข้า . หลังจากการย่อยอาหาร, ตัวอย่างแห้งใช้ความเร็ว-Vac และ resolubilized ในน้ำnanopure 0.5 ไมโครกรัม-aliquots วิเคราะห์บน LTQ Orbitrap สเปกโตรมิเตอร์มวล Velos ที่เชื่อมต่อกับรหัส 75 ไมโครเมตร 65 ซมคอลัมน์ยาวLC เต็มไปด้วย 3 ไมโครเมตรอนุภาคดาวพฤหัสบดี C18 (Phenomenex) ตามที่ได้รับการอธิบายก่อน [26] acquiredMS / MS ชุดข้อมูลสเปกตรัมถูกpreprocessed กับ DeconMSn [27] และ DtaRefinery [28] ซอฟแวร์ตามด้วยการตีความสเปกตรัมใช้MSGFplus [29] ซอฟแวร์โดยการจับคู่กับWormBase WS210 โปรตีนไฟล์ FASTA ผลการแข่งขันที่เปปไทด์ถึงคลื่นความถี่ที่ถูกประมวลผลโดย MSnID Bioconductor แพคเกจเพื่อให้แน่ใจว่าจำนวนสูงสุดของเปปไทด์ระบุในขณะที่ไม่เกิน 1% ของอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด หลังจากที่การส่งออกผลเป็นนับข้ามแท็บสเปกตรัม(แถวที่มีโปรตีนคอลัมน์ตัวอย่างและค่าในตารางที่มีจำนวนOFMs / MS ระบุเปปไทด์ที่เป็นโปรตีนที่กำหนด) ที่เรานำมาใช้ Poisson ตามรูปแบบ(ใช้แพคเกจ msmsTests Bioconductor ) ที่จะค้นพบโปรตีนที่แตกต่างกันมากมายระหว่างหยดไขมันจากN2 และ DAF-2 สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์. 2.4 องค์ประกอบของกรดไขมันและการวิเคราะห์ของไขมันไขมันที่แยก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โดยการเพิ่มจำนวน delipidated 1.5 ml เย็นอะซิโตน
และผสมดี วางที่ 80 ° C −ค้างคืนและหนึ่งส่วนสิบเอาออก
สำหรับปริมาณโปรตีน จำนวนระดับที่ 7000 รอบต่อนาที
1 H ที่อุณหภูมิ 4 องศา อะซิโตนจะถูกลบออกและเม็ดแห้ง
ลงในไนโตรเจนกระแสและเก็บไว้ที่− 80 องศา C .
ปริมาณโปรตีนของส่วนลงตัว ตั้งใจใช้ BCA ปริมาณชุด
( เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ 23225 ) เป็นผู้กำกับ ไขมันแตกตัวมีโปรตีน
เศษส่วนรวมอย่างน้อย 50 μกรัมโปรตีนต่อกลุ่มตัวอย่าง ตัวอย่าง
เตรียมเสร็จในสามแบบชีวภาพ ( 3 2 กับ 3
daf-2 ) เพื่อประเมินและตรวจสอบสถิติของความแตกต่างมากมายค่า
.
ให้ขนาดตัวอย่างมียอดเงินที่เราตัดสินใจ trifluoroethanol
ตามพิธีสาร [ 25 ] เตรียมตัวอย่างสำหรับ LC MS / MS
–การวิเคราะห์ สั้น , ตัวอย่าง resolubilized 50 μ l nh4hco3
( pH 7.8 ) โดยใช้พัลส์สั้นใน 5510 นํ้า
( แบรนสันแบรนสันคลื่นอัลตราโซนิกส์ ) เป็นเวลา 3 นาที หลังจากเพิ่ม 50 μ l trifluoroethanol
กับนม , โปรตีนตัวอย่างที่อุณหภูมิ 60 องศา C 2 H
ด้วยความอ่อนโยน เขย่า ( 1000 รอบต่อนาที )เมื่อบ่มตัวอย่างที่เจือจาง
ผู้อื่นด้วย nh4hco3 ( pH 7.8 ) เสริมด้วยเอนไซม์
( promega ) 1 : 25 W / W มีค่าอัตราส่วนโปรตีนและนอกจากนี้บ่ม
3 H ที่ 37 ° C เพื่อย่อยโปรตีนให้เป็นเปปไทด์ หลังจากการย่อย
ตัวอย่างที่แห้งและใช้ความเร็วต่ำสุดใน resolubilized
nanopure น้ำ 0.5 - μ G เฉยๆ วิเคราะห์ใน ltq orbitrap
velos แมสสเปกโทรมิเตอร์ที่ติดต่อกับ 75 μ M 65 ซม. ยาวประจำตัว
LC คอลัมน์บรรจุด้วย 3 - μ M ดาวพฤหัสบดี c18 อนุภาค ( phenomenex )
เมื่อได้รับการอธิบายก่อน [ 26 ] การ acquiredms / MS spectra ข้อมูล
ถูก preprocessed กับ deconmsn [ 27 ] และ dtarefinery [ 28 ] ซอฟต์แวร์
ตามด้วยการตีความ msgfplus [ 29 ] ให้ใช้ซอฟต์แวร์ โดยการจับคู่กับ wormbase
ws210 โปรตีน fasta ไฟล์ผลการแข่งขัน
เปปไทด์สเปกตรัมถูกประมวลผล โดย msnid bioconductor
แพคเกจเพื่อให้แน่ใจว่าจำนวนสูงสุดของเปปไทด์การแสดงตัวของ
ในขณะที่ไม่เกิน 1% ของอัตราการค้นพบที่เป็นเท็จ หลังจากที่การส่งออกผล
เป็นสเปกตรัมนับข้ามแท็บ ( แถวในคอลัมน์
ตัวอย่างและค่าในตารางเป็นจํานวน ofms การแสดงตัวของ
/ MSเปปไทด์ของโปรตีน ) ให้เราใช้ ใช้รูปแบบปัวซอ
( ใช้ msmstests bioconductor แพคเกจ ) ค้นพบโปรตีนต่างกันมากมาย
ระหว่างไขมันพบจากก๊าซไนโตรเจนและสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ daf-2
.
2.4 . องค์ประกอบกรดไขมันและไขมันสกัดไขมัน