2.4. Cytological evaluation of CTCs

2.4. Cytological evaluation of CTCs
For cytological detection ofCTCs, 3mL bloodwas filtered according
to themanufacturer’s instructions using the ScreenCell Cyto
kit (Screencell, Sarcelles, France) (Desitter et al., 2011). After
completing the filtration, the filter was rinsed with 500 mL of
phosphate-buffered saline, dried on absorbent tissue, and
stained with either Hematoxylin/eosin (H/E), Giemsa (G) or
May-Grunewald (MGG). The stained filters were analyzed by
an experienced cytopathologist (JW) blinded to the histological
diagnosis. Cells were categorized as “negative”, “suspicious”,
or “malignant” based on cytomorphological features. Cells
considered as “malignant” displayed an epithelial phenotype
with enlarged nuclei, coarse chromatin, and irregular nuclear
membranes. Cells classified as “suspicious”, also demonstrated
an epithelial phenotype, but displayed bland nuclear features
with round smooth nuclei and even chromatin.
2.5. Preparation of CTCs samples for detection of KRAS
status
For molecular characterization of the CTCs, 6 mL blood was
filtered using the ScreenCell MB (ScreenCell, Sarcelles,
France) device according to the manufacturer’s instructions
(Desitter et al., 2011). DNA from cells captured on the filter
was isolated using QIAampDNA Micro Kit (Qiagen, Courtaboeuf,
France). Next, Whole Genome Amplification (WGA)
was performed using GenomePlex Single Cell Whole Genome
Amplification Kit (SigmaeAldrich, Saint-Quentin Fallavier,
France). For each WGA reactions, DNA libraries were separated
on a 1.5% agarose gel for visual confirmation of product
amplification and quality. Then, they were diluted 1/50 before
determination of KRAS status.
2.6. Detection of KRAS status in CRCs by droplet digital
PCR (ddPCR), TaqMelt PCR, High Resolution Melting (HRM)
or Sanger sequencing
For HRM, we used a home-made assay performed in routine
for clinical samples with LightCycler 480 (Roche Diagnostics,
Meylan, France) using the following primers: for codon 12, F:
GGCCTGCTGAAAATGACTGAA, R: GGTCCTGCACCAGTAATATGC
and codon 13 F: CAGACTGTGTGTTTCTCCCTTCTCAGG,
R: AGAAAGCCCTCCCCAGTCCTCA. For TaqMelt PCR,
we used the Cobas KRAS mutation kit with the COBAS z480
system (Roche Diagnostics, Meylan, France). At last, for
ddPCR, we used the KRAS Screening Multiplex Kit able to
detect the 7 most common mutations in KRAS genes with
QX200 droplet digital PCR System (Biorad, Marne-laCoquette,
France).
2.7. Detection of KRAS status in tumor tissues
DNA was extracted from several 10 mm sections of paraffinembedded
tissues using Qiasymphony and QiampDNA minikit
(Qiagen, Courtaboeuf, France) according to the manufacturer’s
instructions. The KRAS status was determined using
the Trusight Tumor Panel on MiSeq System (Illumina Inc.,
San Diego, USA) with a detection limit of about 5%. DNA of
lower quality was tested by HRM and Sanger sequencing.
MO

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. cytological ประเมิน CTCsสำหรับการตรวจหา cytological ofCTCs, bloodwas 3 มิลลิลิตรกรองตามคำแนะนำของ themanufacturer ใช้ ScreenCell Cytoชุด (Screencell, Sarcelles ฝรั่งเศส) (Desitter et al. 2011) หลังจากเสร็จสิ้นการกรอง ตัวกรองถูกล้าง ด้วย 500 มล.น้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ แห้งซับเนื้อเยื่อ และเลอะทั้ง Hematoxylin/eosin (H/E), Giemsa (G) หรือพฤษภาคม-Grunewald (MGG) ตัวกรองที่ย้อมถูกวิเคราะห์โดยการมีประสบการณ์ cytopathologist (บลิว) ตาบอดเพื่อให้คนวินิจฉัย เซลล์ถูกแบ่งประเภทเป็น "เชิงลบ" "น่าสงสัย"หรือ "ร้าย" ตามคุณลักษณะ cytomorphological เซลล์ถือว่า "ร้าย" แสดงกนิเยื่อบุผิวมีนิวเคลียสขนาดใหญ่ โครมาตินหยาบ และนิวเคลียร์ที่ผิดปกติเยื่อหุ้มนี้ เซลล์ที่จัดเป็น "น่าสงสัย" ยัง แสดงให้เห็นกนิเยื่อบุผิว แต่แสดงคุณลักษณะนิวเคลียร์สูงมีนิวเคลียสกลมเรียบและโครมาตินแม้2.5 การเตรียม CTCs ตัวอย่างสำหรับการตรวจจับของคราสสถานะลักษณะโมเลกุลของ CTCs ใน เลือด 6 มล.เป็นกรองใช้ MB ScreenCell (ScreenCell, Sarcellesฝรั่งเศส) อุปกรณ์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต(Desitter et al. 2011) ดีเอ็นเอจากเซลล์จับตัวกรองถูกแยกโดยใช้ชุดไมโคร QIAampDNA (Qiagen, Courtaboeufฝรั่งเศส) ถัดไป ทั้งจีโนมที่ขยาย (WGA)ดำเนินการโดยใช้ GenomePlex เดียวเซลล์ทั้งกลุ่มชุดขยาย (SigmaeAldrich, Saint-Quentin Fallavierฝรั่งเศส) ไลบรารีดีเอ็นเอแยกจากกันสำหรับแต่ละปฏิกิริยา WGAจาก 1.5% agarose เจลยืนยันภาพของผลิตภัณฑ์ขยายและมีคุณภาพ แล้ว พวกเขาถูกเจือจาง 1/50 ก่อนการกำหนดสถานะคราส2.6. การตรวจจับสถานะคราสใน CRCs โดยหยดดิจิตอลPCR (ddPCR), TaqMelt PCR สูงความละเอียดละลาย (HRM)หรือจัดลำดับ Sangerสำหรับ HRM เราใช้ทดสอบทำที่บ้านที่ดำเนินการในขั้นตอนการตัวอย่างคลินิกกับ 480 LightCycler (โรชวินิจฉัยMeylan ฝรั่งเศส) โดยใช้ไพรเมอร์ดังต่อไปนี้: สำหรับรหัสพันธุกรรม 12, f:GGCCTGCTGAAAATGACTGAA, R: GGTCCTGCACCAGTAATATGCและรหัสพันธุกรรม 13 f: CAGACTGTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGR: AGAAAGCCCTCCCCAGTCCTCA สำหรับ TaqMelt PCRเราใช้ชุดการกลายพันธุ์คราส Cobas COBAS z480ระบบ (การวินิจฉัยโรช Meylan ฝรั่งเศส) ในที่สุด สำหรับddPCR เราใช้คราสคัดกรองมัลติเพล็กซ์ชุดสามารถตรวจยีนคราสกับพันธุ์ทั่วไป 7QX200 หยดดิจิตอลระบบ PCR (Biorad มาร์น-laCoquetteฝรั่งเศส)2.7 การตรวจจับสถานะคราสในเนื้อเยื่อของเนื้องอกดีเอ็นเอที่ถูกแยกจากหลาย 10 มม.ส่วนของ paraffinembeddedเนื้อเยื่อที่ใช้ minikit Qiasymphony และ QiampDNA(Qiagen, Courtaboeuf ฝรั่งเศส) ตามผู้ผลิตคำแนะนำ กำหนดสถานะคราสใช้แผง Trusight เนื้องอกในระบบ MiSeq (Illumina Inc.ซานดิเอโก สหรัฐอเมริกา) กับระยะตรวจจับประมาณ 5% ดีเอ็นเอของคุณภาพต่ำถูกทดสอบ โดยลำดับ HRM และ SangerMO

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การประเมินผลของเซลล์ของ CTCs
สำหรับ ofCTCs การตรวจหาเซลล์วิทยา, 3ml bloodwas กรองตาม
คำแนะนำ themanufacturer โดยใช้ ScreenCell Cyto
Kit (Screencell, Sarcelles ฝรั่งเศส) (Desitter et al. 2011) หลังจาก
เสร็จสิ้นการกรองกรองที่ถูกล้างด้วย 500 มล
น้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์แห้งเนื้อเยื่อดูดซับและ
ย้อมด้วยสีทั้ง Hematoxylin / Eosin (H / E) Giemsa (G) หรือ
พฤษภาคม Grunewald (MGG) ตัวกรองเปื้อนมาวิเคราะห์โดย
cytopathologist ประสบการณ์ (เจดับบลิว) ตาบอดไปยังเนื้อเยื่อวิทยา
วินิจฉัย เซลล์ที่ถูกแบ่งออกเป็น "เชิงลบ", "น่าสงสัย"
หรือ "มะเร็ง" ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติ cytomorphological เซลล์
ถือว่าเป็น "มะเร็ง" ที่แสดงฟีโนไทป์เยื่อบุผิว
กับนิวเคลียสขยายโครมาติหยาบและนิวเคลียร์ที่ผิดปกติ
เยื่อ เซลล์จัดเป็น "น่าสงสัย" ยังแสดงให้เห็นถึง
ฟีโนไทป์เยื่อบุผิว แต่แสดงคุณลักษณะนิวเคลียร์อ่อนโยน
กับนิวเคลียสเรียบรอบและแม้กระทั่งโครมาติ
2.5 การเตรียมการของกลุ่มตัวอย่าง CTCs สำหรับการตรวจสอบของ KRAS
สถานะ
ลักษณะโมเลกุลของ CTCs, 6 มลเลือด
กรองโดยใช้ ScreenCell MB (ScreenCell, Sarcelles,
ฝรั่งเศส) อุปกรณ์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
(Desitter et al. 2011) ดีเอ็นเอจากเซลล์จับตัวกรอง
ที่แยกได้โดยใช้ไมโคร QIAampDNA Kit (Qiagen, Courtaboeuf,
ฝรั่งเศส) ถัดไปทั้งจีโนมขยาย (WGA)
ได้ดำเนินการโดยใช้ GenomePlex เซลล์เดียวทั้งจีโนม
Amplification Kit (SigmaeAldrich, Saint-Quentin Fallavier,
ฝรั่งเศส) สำหรับปฏิกิริยา WGA แต่ละห้องสมุดดีเอ็นเอถูกแยก
บน agarose gel ที่ 1.5% สำหรับการยืนยันภาพของสินค้าที่มี
การขยายและคุณภาพ จากนั้นพวกเขาก็ถูกปรับลด 1/50 ก่อนที่จะ
กำหนดสถานะ KRAS
2.6 การตรวจสอบสถานะของ KRAS ใน CRCs โดยหยดดิจิตอล
PCR (ddPCR) TaqMelt PCR ละเอียดสูง Melting (HRM)
หรือลำดับแซงเจอร์
สำหรับการบริหารทรัพยากรมนุษย์เราใช้ทดสอบทำที่บ้านดำเนินการในกิจวัตรประจำวัน
สำหรับตัวอย่างทางคลินิกที่มี LightCycler 480 (Roche Diagnostics,
เมย์ลัน , ฝรั่งเศส) โดยใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้: สำหรับ codon 12 F:
GGCCTGCTGAAAATGACTGAA, R: GGTCCTGCACCAGTAATATGC
และ codon 13 F: CAGACTGTGTGTTTCTCCCTTCTCAGG,
R: AGAAAGCCCTCCCCAGTCCTCA สำหรับ TaqMelt PCR,
เราใช้ชุด Cobas KRAS การกลายพันธุ์ที่มี COBAS z480
ระบบ (วินิจฉัยโรชเมย์ลัน, ฝรั่งเศส) ที่ล่าสุดสำหรับ
ddPCR เราใช้ KRAS การคัดกรอง Multiplex Kit สามารถที่จะ
ตรวจสอบการกลายพันธุ์ที่พบมากที่สุดในยีน KRAS 7 กับ
QX200 หยดระบบดิจิตอล PCR (Biorad, Marne-laCoquette,
ฝรั่งเศส)
2.7 การตรวจสอบสถานะของ KRAS ในเนื้อเยื่อของเนื้องอก
ดีเอ็นเอที่สกัดจากหลายส่วน 10 มิลลิเมตร paraffinembedded
เนื้อเยื่อโดยใช้ Qiasymphony และ QiampDNA minikit
(Qiagen, Courtaboeuf ฝรั่งเศส) ตามที่ผู้ผลิต
คำแนะนำ สถานะ KRAS ถูกกำหนดโดยใช้
แผงเนื้องอก Trusight บน MiSeq ระบบ (Illumina อิงค์
ซานดิเอโกสหรัฐอเมริกา) มีวงเงินการตรวจสอบประมาณ 5% ดีเอ็นเอ
ที่มีคุณภาพต่ำได้รับการทดสอบโดยการบริหารทรัพยากรมนุษย์และแซงเจอร์ลำดับ
มิสซูรี่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การประเมินสามารถของ ctcsสำหรับ ofctcs สามารถตรวจจับ , bloodwas กรองตามม.กับคำแนะนำของผู้ผลิตที่ใช้ screencell cytoชุด ( screencell sarcelles , ฝรั่งเศส ) ( desitter et al . , 2011 ) หลังจากเสร็จสิ้นการกรอง ไส้กรองก็ล้างด้วย 500 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือแห้งในการดูดซับและย้อมให้ย้อม / โอซิน ( H / e ) จิมซา ( G ) หรืออาจ กรุนเวลด์ ( mgg ) การย้อมโดยใช้ตัวกรอง( 3 ) มีประสบการณ์การ cytopathologist ตาบอดเพื่อการศึกษาการวินิจฉัย เซลล์แบ่งเป็น " เชิงลบ " , " น่าสงสัย "หรือ " เนื้อร้าย " ตามลักษณะ cytomorphological . เซลล์ถือว่าเป็น " มะเร็ง " แสดงการบุด้วยการขยายของหยาบและไม่เรียบนิวเคลียร์เยื่อ เซลล์จัดเป็น " น่าสงสัย " ยังแสดงมีการบุ แต่แสดงคุณสมบัตินิวเคลียร์ธรรมดากับรอบนิวเคลียส และแม้แต่การราบรื่น .2.5 การเตรียม ctcs ตัวอย่างเพื่อตรวจหา krasสถานะสำหรับลักษณะโมเลกุลของ ctcs เลือด 6 มิลลิลิตร คือกรองใช้ screencell MB ( screencell sarcelles , ,ฝรั่งเศส ) อุปกรณ์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต( desitter et al . , 2011 ) ดีเอ็นเอจากเซลล์จับในตัวกรองได้ใช้ qiaampdna ไมโครชุด ( เพิ่ม courtaboeuf , ,ฝรั่งเศส ) อีกทั้งการขยาย ( WGA ) จีโนมการใช้ genomeplex เซลล์เดียวทั้งจีโนมชุดเด็ก ( sigmaealdrich เซนต์เควนติน fallavier , ,ฝรั่งเศส ) สำหรับแต่ละ WGA ปฏิกิริยา , ห้องสมุดดีเอ็นเอแยกกันในเจลเป็นโรส 1.5% สำหรับภาพยืนยันสินค้าเพิ่มปริมาณและคุณภาพ แล้วพวกเขาถูกเจือจาง 1 / 50 ก่อนการกำหนดสถานะ kras .2.6 ตรวจสอบสถานะ kras ใน crcs โดยลูกอมดิจิตอลPCR ( ddpcr ) taqmelt PCR , ความละเอียดสูง ( HRM ) ละลายแซงเจอร์ลำดับหรือสำหรับการบริหารทรัพยากรมนุษย์ เราใช้วิธีดำเนินการในขั้นตอนการทำเองสำหรับตัวอย่างทางคลินิกกับ lightcycler 480 ( โรช การวินิจฉัยเมย์ลัน , ฝรั่งเศส ) โดยใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้ : สำหรับรหัส 12 , F :ggcctgctgaaaatgactgaa , R : ggtcctgcaccagtaatatgcและ รหัส 13 : cagactgtgtgtttctcccttctcagg F ,R : agaaagccctccccagtcctca . สำหรับ taqmelt PCR ,เราใช้ cobas kras ชุดกับ cobas z480 กลายพันธุ์ระบบ ( โรชวินิจฉัยสุด , ฝรั่งเศส ) ตอนสุดท้ายddpcr เราใช้ kras คัดกรองชุดสามารถมัลติเพล็กซ์ตรวจพบการกลายพันธุ์ในยีน kras 7 ที่พบบ่อยที่สุดด้วยระบบเทคนิคดิจิตอล qx200 หยด biorad lacoquette มาร์น ( , ,ฝรั่งเศส )2.7 . การตรวจหา kras สถานะในเนื้อเยื่อมะเร็งดีเอ็นเอจากหลายส่วนของ paraffinembedded 10 มม.ใช้ qiasymphony qiampdna minikit และเนื้อเยื่อ( เพิ่ม courtaboeuf , ฝรั่งเศส ) ตามที่ผู้ผลิตคําแนะนํา ที่ใช้วิเคราะห์ kras สถานะเนื้องอก trusight แผงบนระบบ miseq ( Illumina Inc . ,ซานดิเอโก สหรัฐอเมริกา ) กับขีดจำกัดของประมาณ 5 % ดีเอ็นเอของคุณภาพต่ำ ถูกทดสอบโดย HRM และแซงเจอร์ลำดับ .โม