Male sablefish (average weight 2.8

Male sablefish (average weight 2.8 kg) were caught via hook and line 20 km off of Westport, WA (N 047 17 W 124 52) at a depth of approximately 200 m. They were transported to the Manchester Research Station (Port Orchard, WA N 047 16 W 122 33) and held at 5–6°C in 3 m round tanks supplied with recirculating sea-water. All males were held separate from females with dissolved oxygen maintained between 5 ppm and 9 ppm and flow rates of 95–132 L/min. During the spawning season (January to April) males were implanted in the right dorsal sinus with Ovaplant (Western Chemical, Ferndale, WA), a salmon gonadotropin releasing hormone analog, at 50–60 μg/kg body weight. This treatment initiated or enhanced spermiation within one–two weeks and ovulation in three-four weeks. To collect milt, spermiating males were anesthetized with Tricaine-S (Western Chemical Ferndale, WA) and a 5 ml pipette was used to collect the milt directly from the vent following pressure applied to the abdomen. The milt was placed in a Whirl-Pak bag (Nasco, Modesto, CA) to which pure oxygen was added over the milt prior to closing. Milt was held under these conditions at 4°C until experimentation which occurred within 24 h of collection. For egg collection, anesthetized females were dried and the eggs were strip spawned into glass 1000 ml beakers and held at 4°C until fertilization (within 4 h).

2.2. Extender

For sperm dilution, a modified Cortland's solution comprised of 124.1 mM NaCl, 5.1 mM KCl, 1.6 mM CaCl2·2H2O, 1.0 mM MgSO4·7H2O, 5.6 mM glucose, and 20 mM HEPES was used (Goetz and Coffman, 2000). The average pH of the sablefish milt was 7.7 ± 0.12 (N = 6) as determined using a handheld pH meter (Hanna Ann Arbor, MI). Based on this, the pH of the extender was adjusted to 7.7 with 1 M NaOH for all experiments.

2.3. Sperm activation and analysis

To determine sperm density, sablefish milt was diluted to 1:1000 in the Cortland extender. This dilution factor yielded an appropriate density for counting using a hemocytometer. Diluted milt (10 μl) was pipetted between the hemocytometer slide and cover slip. Using darkfield microscopy at 10 × magnification it was determined that the sablefish sperm density was 2.0 × 1010–2.5 × 1010 ml− 1. Given the recommended sperm concentration (104–106 ml− 1) for computer assisted sperm analysis (CASA) (Kaupp et al., 2003, Riffell et al., 2002 and Spehr et al., 2004), sablefish milt was diluted in the Cortland extender at a ratio of 1:100 and held overnight in 50 ml falcon tubes at 4 °C. For sperm analysis, the motility was recorded at 97 frames per second on a microscope-mounted (Olympus IM, Center Valley PA) video camera (Allied Prosilica GC, Stadtroda Germany) at 10 × magnification with dark field illumination. To keep the sperm from sticking to the glass slide, 0.2 μl of a 10% gelatin solution derived from cold-water fish skin (#G7765 Sigma-Aldrich St. Louis, MO) was placed into the channel before adding the sperm. To activate the sperm, 100 μl of diluted sperm (1:100) was mixed with 900 μl of activating solution and 1.5 μl of the activated sperm mixture was loaded into a 20-micron channel of a Leja sperm analysis slide (Leja, Netherlands).

High osmolality stock solutions of KCl, NaCl, urea, glucose, MgSO4, and CaCl2 were made and diluted to create working solutions ranging from 400–1050 mOsm/kg in increments of 25 mOsm/kg. Sperm was activated with the working solutions at each osmolality starting with the lowest osmolality solution for which activation was observed, continuing incrementally through the next three higher concentrations, and again at 800 mOsm/kg and 1050 mOsm/kg. Sperm from 2–7 males were tested individually and three replicate tests were conducted per male/test solution. The video files of the sperm were opened in ImageJ (Schneider et al., 2012) and a variance filter was applied to remove background gradation and the threshold was adjusted to observe white sperm against a black background. The video was then analyzed from 17 s (frame 1649) to 18 s (frame 1746) post activation using the CASA plugin (Wilson-Leedy and Ingermann, 2007) to determine the percent motility, curvilinear velocity and linearity. Linearity is defined as straight-line velocity over average path velocity and describes the curvature of the sperm path. All velocity units were measured in μm/s.

2.4. Cryopreservation

Sperm was diluted in the Cortland extender at a 1:50 ratio and held overnight at 4 °C. Cryoprotectant at two times the desired final strength was slowly added to the sperm over a period of 10 min to create a sperm dilution of 1:100. To accomplish this, the sperm was held in a Petri dish on a shaker providing continuous rotary agitation as the cryoprotectant was added. Cryoprotectant was added to the sperm in a cold-room maintained at 4 °C. Following the addition of the cryoprotectant, the sperm was loaded into 0.25 ml cryopreservation straws and frozen at different rates. Cryoprotectants tested were glycerol, propylene glycol and DMSO at 5% and 10% concentrations. For all six cryoprotectant treatments, three freezing rates (Table 1) were tested. All freezing protocols started at − 4 °C and were performed using the Crysalys PTC-9500 (Biogenics Napa, CA) cryogenic programmable freezing system. Straws were loaded into the freezing chamber and the program was initiated. After the freezing was completed, the straws were held in liquid nitrogen for 7 days before assessment. Sperm was thawed by holding the straw in 28 °C water for seven seconds (Butts et al., 2010). The sperm (100 μl) was then activated in 900 μl of 1050 mOsm/kg NaCl and assessed using CASA. For controls, sperm activation was also tested by CASA prior to dilution in the extender, prior to adding the cryoprotectant, and following the addition of the cryoprotectant but prior to freezing. This also allowed us to verify that the cryoprotectant at 5 and 10% concentrations was not toxic to the sperm following 10–13 min of exposure.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ปลาหิมะชาย (ค่าเฉลี่ยน้ำหนัก 2.8 กิโลกรัม) ก็ติดเบ็ดและบรรทัด 20 กิโลเมตรออกจากถนนเวสต์พอร์ท WA (N 047 17 W 124 52) ที่ความลึกประมาณ 200 เมตร พวกเขาอพยพไปยังสถานีวิจัยแมนเชสเตอร์ (ออร์ชาร์ด WA N 047 16 W 122 33) ขึ้นที่ 5-6 องศา C ใน 3 m รอบถังให้กับ recirculating น้ำทะเล ชายทั้งหมดถูกจับแยกจากหญิง มีปริมาณออกซิเจนละลายที่รักษาระหว่าง 5 ppm และอัตรา 9 ppm และกระแส L 95-132/min ในระหว่างฤดูกาล spawning (มกราคมถึงเมษายน) ชายถูก implanted ในไซนัสขวา dorsal มี gonadotropin แซลมอนที่ปล่อยฮอร์โมนแบบแอนะล็อก ที่ 50 – 60 กิโลกรัม μg น้ำหนัก (เวสเทิร์นเคมี Ferndale, WA), Ovaplant รักษานี้เริ่มต้น หรือเพิ่ม spermiation ภายใน 1 2 สัปดาห์และตกไข่ในสัปดาห์ที่ 3 4 เก็บ milt, spermiating ชายได้ด้วยกับ Tricaine-S (เวสเทิร์นเคมี Ferndale, WA) และเปตต์ 5 ml ใช้ milt รวบรวมโดยตรงจากปล่องตามความดันที่ใช้กับช่องท้อง Milt ถูกวางในวนปากถุง (Nasco โมเดสโต CA) ซึ่งถูกเพิ่มออกซิเจนบริสุทธิ์กว่า milt ก่อนปิด Milt ถูกจัดขึ้นภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ที่ 4° C จนถึงการทดลองที่เกิดขึ้นภายใน 24 ชมของชุด สำหรับการรวบรวมไข่ หญิงด้วยได้แห้ง และไข่มีแถบเกิดเป็นแก้ว 1000 มล. beakers และจัดที่ 4° C จนถึงปัจจุบัน (ภายใน 4 h)2.2. extenderสำหรับอสุจิเจือจาง โซลูชันของ Cortland ที่ปรับเปลี่ยนประกอบด้วย NaCl 124.1 มิลลิเมตร 5.1 mM KCl, 1.6 mM CaCl2·2H2O, 1.0 มม. MgSO4·7H2O กลูโคส 5.6 มม. และ 20 มม. HEPES ถูกใช้ (Goetz และ Coffman, 2000) PH เฉลี่ยของ milt ปลาหิมะ 7.7 ± 0.12 (N = 6) ตามที่กำหนดไว้โดยใช้เครื่องวัด pH มือถือ (Hanna Ann Arbor, MI) ตามนี้ ถูกปรับ pH ของ extender ใน 7.7 กับ 1 M NaOH สำหรับการทดลองทั้งหมด2.3. สเปิร์มเรียกใช้และวิเคราะห์กำหนดความหนาแน่นของสเปิร์ม ปลาหิมะ milt ถูกผสมกับ 1:1000 ใน Cortland extender ปัจจัยเจือจางนี้หามีความหนาแน่นที่เหมาะสมสำหรับการตรวจนับโดยใช้การ hemocytometer Milt แตกออก (10 μl) ที่ pipetted ระหว่างภาพนิ่ง hemocytometer และครอบคลุมการจัดส่ง ใช้ darkfield microscopy ที่ขยาย× 10 ได้กำหนดว่า ความหนาแน่นของอสุจิปลาหิมะ 2.0 × 1010 – 2.5 × 1010 ml− 1 ให้ความเข้มข้นแนะนำสเปิร์ม (104-106 ml− 1) สำหรับคอมพิวเตอร์ช่วยวิเคราะห์อสุจิ (CASA) (Kaupp และ al., 2003, Riffell และ al., 2002 และ Spehr et al., 2004), ปลาหิมะ milt ผสมใน extender Cortland ที่อัตราส่วน 1: 100 และจัดข้ามคืน 50 ml เหยี่ยวหลอดที่ 4 องศาเซลเซียส สำหรับการวิเคราะห์อสุจิ motility ที่เป็นบันทึกที่ 97 เฟรมต่อวินาทีในการติดตั้งกล้องจุลทรรศน์ (โอลิมปัส IM หุบเขากลางป่า) กล้องวิดีโอ (GC Prosilica พันธมิตร Stadtroda เยอรมนี) ที่ขยาย× 10 กับฟิลด์มืดแสงสว่าง เพื่อให้อสุจิติดไปภาพนิ่งแก้ว μl 0.2 ของโซลูชันตุ๋น 10% มาจากผิวปลา cold-water (#G7765 ซิก Aldrich St. Louis, MO) ถูกจัดอยู่ในสถานีก่อนที่จะเพิ่มอสุจ๊าก เพื่อเรียกใช้อสุจ๊าก μl 100 ของอสุจิแตกออก (1: 100) ที่ผสมกับ μl 900 ของเรียกใช้โซลูชัน และ μl 1.5 ของผสมอสุจิเปิดถูกโหลดเข้าไปในช่องสัญญาณ 20 ไมครอนของ Leja จ๊ากวิเคราะห์ภาพนิ่ง (Leja เนเธอร์แลนด์)โซลูชั่นหุ้น osmolality สูง KCl, NaCl ยูเรีย กลูโคส MgSO4 และ CaCl2 ที่ทำ และทำให้การสร้างโซลูชั่นการทำงานตั้งแต่ 400 – 1050 mOsm/kg ที 25 mOsm/kg อสุจิเรียกใช้ ด้วยโซลูชั่นทำงาน osmolality แต่ละเริ่มต้น ด้วยโซลูชัน osmolality ต่ำที่เปิดใช้งานได้สังเกต ต่อแบบเพิ่มหน่วยผ่านที่ถัดไปสามสูงกว่าความเข้มข้น และอีก 800 mOsm/kg และ 1050 mOsm/kg อสุจิจากเพศชาย 2 – 7 ทดสอบแต่ละรายการ และได้ดำเนินการทดสอบสาม replicate ต่อโซลูชันชาย/ทดสอบ เปิดไฟล์วิดีโอของอสุจ๊ากใน ImageJ (ชไนเดอร์ et al., 2012) และตัวต่างใช้การไล่ระดับสีพื้นหลังเอาออก และมีการปรับปรุงขีดจำกัดสังเกตอสุจิสีขาวกับพื้นหลังสีดำ วิดีโอที่ถูกวิเคราะห์แล้วจาก 17 s (เฟรมค.ศ. 1649) เพื่อเรียกใช้ลง s (เฟรมค.ศ. 1746) 18 ที่ใช้ปลั๊กอินคา (Wilson Leedy และ Ingermann, 2007) เพื่อกำหนดเปอร์เซ็นต์ motility ความเร็ว curvilinear และแบบดอกไม้ แบบดอกไม้ถูกกำหนดให้เป็นเส้นตรงความเร็วเหนือความเร็วเส้นทางเฉลี่ย และอธิบายขนาดของเส้นทางอสุจิ มีวัดหน่วยความเร็วทั้งหมดใน μm/s2.4. cryopreservationสเปิร์มถูกทำให้เจือจางใน Cortland extender ที่ 1:50 อัตราและค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส ช้า cryoprotectant ที่สองครั้งต้องสุดท้ายแรงถูกเพิ่มกับอสุจ๊ากนาน 10 นาทีเพื่อสร้างเจือจางสเปิร์มของ 1: 100 การทำ อสุจ๊ากวันที่ในจานเพาะเชื้อเชคเกอร์ที่ให้อาการกังวลต่อโรตารี่อย่างต่อเนื่องเป็น cryoprotectant ที่เพิ่ม Cryoprotectant ถูกเพิ่มสเปิร์มในเย็นห้องเก็บที่ 4 องศาเซลเซียส ต่อเพิ่ม cryoprotectant อสุจ๊ากถูกโหลดลงในหลอด cryopreservation 0.25 ml และแช่แข็งที่ Cryoprotectants ทดสอบมีกลีเซอร โพรพิลีน glycol และ DMSO ที่ความเข้มข้น 5% และ 10% สำหรับการรักษา 6 cryoprotectant ทั้งหมด มีทดสอบ 3 ตรึงราคา (ตาราง 1) โพรโทคอตรึงทั้งหมดเริ่มต้นที่− 4 ° C และได้ดำเนินการโดยใช้ Crysalys PTC-9500 (Biogenics ปา CA) cryogenic โปรแกรมตรึงระบบ หลอดถูกโหลดเข้าไปในห้องเย็นช่ำ และเริ่มโปรแกรม หลังจากที่เสร็จสิ้นที่จุดเยือกแข็ง หลอดถูกจัดขึ้นในไนโตรเจนเหลว 7 วันก่อนการประเมิน อสุจิเป็น thawed ตามเก็บฟางในน้ำ 28 ° C 7 วินาที (Butts et al., 2010) อสุจ๊าก (100 μl) แล้วถูกเรียกใช้ใน μl 900 ของ 1050 mOsm/kg NaCl และประเมินการใช้คา สำหรับควบคุม เรียกใช้อสุจิยังทดสอบ โดยคา ก่อนเจือจางใน extender ก่อนเพิ่ม cryoprotectant นี้ และแห่ง cryoprotectant ต่อ แต่ ก่อนถึงจุดเยือกแข็ง นี้ยังอนุญาตให้เราตรวจสอบ cryoprotectant ที่ความเข้มข้น 5 และ 10% ไม่ใช่พิษกับอสุจ๊ากต่อ 10 – 13 นาทีของการสัมผัส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ชาย sablefish (น้ำหนักเฉลี่ย 2.8 กิโลกรัม) ถูกจับผ่านเบ็ดและสาย 20 กิโลเมตรออกจากเวสต์พอร์ต, WA (ยังไม่มี W 047 17 124 52) ที่ระดับความลึกประมาณ 200 เมตร พวกเขาถูกเคลื่อนย้ายไปแมนเชสเตอร์สถานีวิจัย (พอร์ตออชาร์ด, วอชิงตันไม่มี 047 16 122 33 W) และจัดขึ้นที่ 5-6 องศาเซลเซียสในถัง 3 เมตรรอบหมุนเวียนมาพร้อมกับน้ำทะเล ผู้ชายทุกคนที่ถูกจัดขึ้นที่แยกต่างหากจากหญิงที่มีออกซิเจนละลายรักษาระหว่าง 5 ppm และ 9 ppm และอัตราการไหลของ 95-132 ลิตร / นาที ในช่วงฤดูวางไข่ (มกราคม-เมษายน) เพศชายที่ถูกฝังอยู่ในไซนัสหลังที่เหมาะสมกับ Ovaplant (เวสเทิร์เคมีเฟิร์นเดล, WA) gonadotropin ปลาแซลมอนปล่อยฮอร์โมนอะนาล็อกที่ 50-60 ไมโครกรัม / กิโลกรัมน้ำหนักตัว การรักษานี้เริ่มต้นหรือเพิ่มขึ้นหลั่งน้ำเชื้อภายในหนึ่งสองสัปดาห์และการตกไข่ใน 3-4 สัปดาห์ที่ผ่านมา ในการเก็บรวบรวมน้ำเชื้อ, spermiating เพศได้รับการดมยาสลบกับ Tricaine-S (เวสเทิร์เคมีเฟิร์นเดล, วอชิงตัน) และปิเปต 5 มล. ถูกใช้ในการเก็บน้ำเชื้อโดยตรงจากช่องระบายความดันต่อไปนี้นำไปใช้กับช่องท้อง น้ำเชื้อถูกวางไว้ในถุงวนปาก (Nasco, โมเดสโต, CA) ที่ออกซิเจนบริสุทธิ์ได้เพิ่มมากกว่าน้ำเชื้อก่อนที่จะปิด กล่าวถูกจัดขึ้นภายใต้เงื่อนไขเหล่าที่ 4 ° C จนการทดลองที่เกิดขึ้นภายใน 24 ชั่วโมงของการเก็บ ในการเก็บรวบรวมไข่หญิงอสัญญีแห้งและไข่เป็นแถบกลับกลายลงในบีกเกอร์แก้ว 1,000 มล. และจัดขึ้นที่ 4 ° C จนการปฏิสนธิ (ภายใน 4 ชั่วโมง). 2.2 Extender สำหรับการเจือจางสเปิร์มแก้ไขวิธีการแก้ปัญหาของคอร์ตประกอบด้วย 124.1 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 5.1 มิลลิ KCl 1.6 มิลลิ CaCl2 · 2H2O 1.0 มิลลิ MgSO4 · 7H2O กลูโคส 5.6 มิลลิและ 20 มิลลิ HEPES ถูกนำมาใช้ (เก๊และคอฟฟ์แมน, 2000) ค่า pH เฉลี่ยของน้ำเชื้อ sablefish เป็น 7.7 ± 0.12 (ยังไม่มี = 6) ตามที่กำหนดโดยใช้เครื่องวัดค่า pH แบบพกพา (ฮันนา Ann Arbor, MI) จากนี้ค่า pH ขยายที่ถูกปรับให้ 1 7.7 M NaOH สำหรับการทดลองทั้งหมด. 2.3 การเปิดใช้สเปิร์มและการวิเคราะห์การตรวจสอบความหนาแน่นของสเปิร์ม sablefish น้ำเชื้อถูกเจือจาง 1: 1,000 ในขยายคอร์ต ปัจจัยที่ทำให้เจือจางนี้ให้ผลความหนาแน่นที่เหมาะสมสำหรับการใช้การนับ hemocytometer เจือจางน้ำเชื้อ (10 ไมโครลิตร) ได้รับการปิเปตระหว่างสไลด์ hemocytometer และใบปก การใช้กล้องจุลทรรศน์ Darkfield ที่ 10 ×ขยายมันก็ตั้งใจว่าความหนาแน่นของสเปิร์ม sablefish เป็น 2.0 × 1010-2.5 × 1010 ml- 1. ให้ความเข้มข้นของสเปิร์มแนะนำ (104-106 ml- 1) สำหรับคอมพิวเตอร์ช่วยวิเคราะห์สเปิร์ม (CASA) (Kaupp ... et al, 2003 Riffell, et al, 2002 และ Spehr, et al, 2004), sablefish น้ำเชื้อถูกเจือจางในขยายคอร์ตในอัตราส่วน 1: 100 และถือค้างคืนใน 50 มลหลอดเหยี่ยวที่ 4 ° C สำหรับการวิเคราะห์อสุจิ, การเคลื่อนที่ที่ถูกบันทึกไว้ที่ 97 เฟรมต่อวินาทีในกล้องจุลทรรศน์ติด (โอลิมปั IM ศูนย์วัลเลย์ PA) กล้องวิดีโอ (พันธมิตร Prosilica GC, Stadtroda เยอรมนี) 10 ×ขยายที่มีไฟส่องสว่างสนามมืด เพื่อให้สเปิร์มจากการเกาะสไลด์แก้ว 0.2 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาเจลาติน 10% มาจากหนังปลาน้ำเย็น (# G7765 Sigma-Aldrich เซนต์หลุยส์) ถูกวางลงในช่องก่อนที่จะเพิ่มสเปิร์ม เพื่อเปิดใช้งานสเปิร์ม 100 ไมโครลิตรของตัวอสุจิเจือจาง (1: 100) ผสมกับ 900 ไมโครลิตรของการเปิดใช้งานการแก้ปัญหาและ 1.5 ไมโครลิตรของผสมอสุจิเปิดใช้งานถูกโหลดลงในช่อง 20 ไมครอนของการวิเคราะห์อสุจิ Leja สไลด์ (Leja, เนเธอร์แลนด์) . osmolality สูงแก้ปัญหาสต็อกของโพแทสเซียมคลอไรด์, โซเดียมคลอไรด์, ยูเรียกลูโคส MgSO4 และ CaCl2 ถูกสร้างขึ้นมาและปรับลดการสร้างโซลูชั่นที่ทำงานตั้งแต่ 400-1,050 mOsm / kg ในการเพิ่มขึ้น 25 mOsm / kg สเปิร์มถูกเปิดใช้งานด้วยโซลูชั่นการทำงานที่แต่ละ osmolality เริ่มต้นด้วยการแก้ปัญหา osmolality ต่ำสุดที่ยืนยันการใช้งานที่ถูกตั้งข้อสังเกตอย่างต่อเนื่องเพิ่มขึ้นผ่านไปสามความเข้มข้นสูงและอีกครั้งที่ 800 mOsm / กิโลกรัมและ 1,050 mOsm / kg สเปิร์ม 2-7 เพศได้รับการทดสอบรายบุคคลและสามการทดสอบซ้ำได้ดำเนินการต่อชาย / วิธีการแก้ปัญหาการทดสอบ ไฟล์วิดีโอของตัวอสุจิที่ถูกเปิดใน ImageJ (ชไนเดอ et al., 2012) และกรองความแปรปรวนถูกนำมาใช้ในการลบการไล่ระดับสีพื้นหลังและเกณฑ์การปรับที่จะสังเกตเห็นสเปิร์มสีขาวกับพื้นหลังสีดำ วิดีโอที่ถูกวิเคราะห์จาก 17 (กรอบ 1649) ถึง 18 s (กรอบ 1746) โพสต์ยืนยันการใช้งานโดยใช้ปลั๊กอิน CASA (วิลสัน-Leedy และ Ingermann 2007) เพื่อตรวจสอบการเคลื่อนไหวของร้อยละความเร็วโค้งและเส้นตรง เส้นตรงถูกกำหนดให้เป็นความเร็วเส้นตรงตลอดเส้นทางความเร็วเฉลี่ยและอธิบายความโค้งของเส้นทางที่สเปิร์ม หน่วยความเร็วทั้งหมดอยู่ในวัดไมครอน / s. 2.4 เก็บรักษาสเปิร์มถูกเจือจางในขยายคอร์ตในอัตราส่วน 01:50 และจัดขึ้นในชั่วข้ามคืนที่ 4 ° C cryoprotectant สองครั้งสุดท้ายที่ต้องการความแข็งแรงถูกเพิ่มเข้ามาช้าไปที่สเปิร์มในช่วงเวลา 10 นาทีในการสร้างสเปิร์มลดสัดส่วน 1: 100 เพื่อให้บรรลุนี้สเปิร์มที่จัดขึ้นในจานเลี้ยงเชื้อในเครื่องปั่นให้กวนหมุนอย่างต่อเนื่องเป็น cryoprotectant ถูกเพิ่ม cryoprotectant ถูกบันทึกอยู่ในสเปิร์มในห้องเย็นเก็บรักษาไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส ต่อไปนี้การเพิ่มขึ้นของ cryoprotectant ที่สเปิร์มที่ถูกโหลดลง 0.25 มล. หลอดเก็บรักษาและแช่แข็งที่อัตราที่แตกต่าง cryoprotectants ทดสอบเป็นกลีเซอรีนไกลคอลโพรพิลีนและ DMSO ที่ 5% และความเข้มข้น 10% สำหรับการรักษา cryoprotectant ทั้งหกสามอัตราการแช่แข็ง (ตารางที่ 1) ได้รับการทดสอบ โปรโตคอลการแช่แข็งทั้งหมดเริ่มต้นที่ - 4 องศาเซลเซียสและถูกดำเนินการโดยใช้ Crysalys PTC-9500 (Biogenics Napa, CA) อุณหภูมิแช่แข็งระบบโปรแกรม หลอดถูกโหลดเข้าไปในห้องแช่แข็งและโปรแกรมที่ได้ริเริ่มขึ้น หลังจากแช่แข็งเสร็จหลอดที่ถูกจัดขึ้นในไนโตรเจนเหลวเป็นเวลา 7 วันก่อนที่จะประเมิน สเปิร์มที่ถูกละลายโดยถือฟางใน 28 ° C น้ำเจ็ดวินาที (ก้น et al., 2010) สเปิร์ม (100 ไมโครลิตร) ถูกเปิดใช้งานแล้วใน 900 ไมโครลิตรของ 1,050 mOsm / kg โซเดียมคลอไรด์และประเมินโดยใช้ CASA สำหรับการควบคุมการเปิดใช้งานสเปิร์มยังได้รับการทดสอบโดย CASA ก่อนที่จะมีการลดสัดส่วนในการขยายก่อนที่จะเพิ่ม cryoprotectant และต่อไปนี้นอกเหนือจาก cryoprotectant แต่ก่อนที่จะมีการแช่แข็ง นอกจากนี้ยังช่วยให้เราสามารถตรวจสอบว่า cryoprotectant ที่ 5 และ 10% ความเข้มข้นก็ไม่เป็นพิษต่อสเปิร์มต่อไปนี้วันที่ 10-13 นาทีของการเปิดรับแสง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หมากสง ( ชาย น้ำหนักเฉลี่ย 2.8 กก. ) ถูกจับผ่านตะขอและสาย 20 กิโลเมตร จาก เวสต์พอร์ต , WA ( N 047 17 W 124 52 ) ที่ระดับความลึกประมาณ 200 เมตร พวกเขาย้ายไป แมนฯ ยูฯ สถานีวิจัย ( Port Orchard , WA N 047 16 w 122 33 ) และจัดขึ้นที่ 5 – 6 ° C 3 ถังกลม M มาพร้อมกับหมุนเวียนน้ำทะเลผู้ชายทุกคนถูกจับแยกจากตัวเมีย ด้วยออกซิเจน รักษาระหว่าง 5 ppm และ 9 ppm และ อัตราการไหลของ 95 – 132 ลิตร / นาที ในช่วงฤดูวางไข่ ( มกราคม - เมษายน ) ตัวผู้ถูกปลูกฝังในด้านขวาหลังโพรงจมูกด้วย ovaplant ( ตะวันตกเคมี , เฟิร์นเดล , วอชิงตัน ) , แซลมอน gonadotropin ปล่อยฮอร์โมนอะนาล็อกที่ 50 μ– 60 กรัมต่อกิโลกรัมของน้ำหนักตัว .การริเริ่มหรือ spermiation เพิ่มภายใน 1 – 2 สัปดาห์และการตกไข่ในสามสี่อาทิตย์ เก็บน้ำยา spermiating ยาสลบ , ผู้ชายกับ tricaine-s ( เฟิร์นเดล , เคมีตะวันตก WA ) และ 5 มล. ปิเปต ใช้เก็บน้ำยาโดยตรงจากระบายตามแรงดันที่ใช้กับท้อง ส่วนน้ำยาอยู่ในน้ำวน ( NASCO โมเดสโต ปากกระเป๋า ,CA ) ซึ่งออกซิเจนบริสุทธิ์เพิ่มกว่าน้ำยาก่อนที่จะปิด มิลท์ จัดขึ้น ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ 4 ° C ถึงการทดลองที่เกิดขึ้นภายใน 24 ชั่วโมงของคอลเลกชัน เก็บไข่ , ผู้หญิงยาสลบแห้งและไข่ลงในแก้ว 1 , 000 มิลลิลิตร แถบ spawned บีกเกอร์และเก็บที่อุณหภูมิ 4 องศา C จนถึงปฏิสนธิ ( ภายใน 4 H )

. . Extender

สำหรับอสุจิเจือจางแก้ไขคอร์ดแลนด์ โซลูชั่น 124.1 มม. ประกอบด้วย NaCl KCl 5.1 มม. 1.6 มม. ผลิตด้วย 2H2O-dx , 1.0 มม. MgSO4 ใด้วย 7h2o กลูโคส 5.6 มม. และ 20 มม. ใช้ฮีเปส ( โกทซ์ และ คอฟแมน , 2000 ) pH เฉลี่ยของน้ำยาหมากสงคือ 7.7 ± 0.12 ( n = 6 ) เมื่อพิจารณาการใช้เครื่องวัดแบบมือถือ ( ฮันนา Ann Arbor , Mi ) ตามนี้ คือ เพื่อปรับ pH ของ Extender 7.7 กับ 1 M NaOH ในทุกการทดลอง

2.3