PCR amplificationDegenerate oligonu

PCR amplification
Degenerate oligonucleotide primers were designed based on the COI sequences of the head lice (P. humanus capitis) and Phthirus pubis obtained from the GenBank database (GenBank:EU493419, EU493427, EU493433, EU493435, EU493437, EU493439, EU493441 for P. humanus capitis
and EF152554, AY696000 to AY696005 for Ph. pubis) as forward primer 5'-GGTACTGGCTGGACTRTTTATCC-
3', and the degenerate reverse primer sequences were 5'-CTAAARACTTTYACTCCCGTTGG-3'. The primers were synthesized by 1st BASE Oligonucleotide (Oligo) Synthesis services company (1st BASE Laboratories, Malaysia). PCR was used to detect Bartonella spp. or Acinetobacter spp.
The DNA in the head louse samples were targeted from the gltA gene and rpoB gene for Bartonella spp. [24] and Acinetobacter spp. [23], respectively. The PCR reaction was set up in a final volume of 25 μl containing approximately 50 ng/μl of extracted DNA, 10 μM of each primer, 10XTaq
buffer, 2.5 mM of dNTPs, 2.5 mM of MgCl2 and 1 unit of Taq DNA polymerase (Fermentas, Pittsburgh, PA); double distilled water was the negative control. The PCR amplification
conditions were as follows: initial denaturation at 95°C for 3 minutes; 40 cycles of 95°C for 1 minute, 50, 60, and 62°C for COI, gltA, and rpoB gene, respectively for 1 minute and 72°C for 1 minute; and the final extension at 72°C for 7 minutes. The PCR amplicons were determined via 1.5% agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and visualized with Quantity One Quantification Analysis Software version 4.5.2 (Gel DocEQ System; Bio- Rad, Hercules, CA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยาย PCRไพรเมอร์ degenerate oligonucleotide ถูกออกแบบตามลำดับ COI หัวเหา (P. humanus capitis) และ Phthirus pubis รับจากฐานข้อมูล GenBank (GenBank:EU493419, EU493427, EU493433, EU493435, EU493437, EU493439, EU493441 สำหรับ P. humanus capitisและ EF152554, AY696000 เพื่อ AY696005 สำหรับ Ph. pubis) เป็นรองพื้นไปข้างหน้า 5' - GGTACTGGCTGGACTRTTTATCC -3 และที่พื้น degenerate ย้อนลำดับ 5'-CTAAARACTTTYACTCCCGTTGG-3' ไพรเมอร์ที่ถูกสังเคราะห์ โดยบริษัทบริการสังเคราะห์ Oligonucleotide (Oligo) พื้นฐาน 1 (1 พื้นฐานห้องปฏิบัติการ มาเลเซีย) ใช้ PCR ในการตรวจ Bartonella โอหรือโอ Acinetobacterดีเอ็นเอในตัวอย่างใหญ่ louse มีเป้าหมายจากยีน gltA และยีน rpoB Bartonella โอ [24] และ Acinetobacter โอ [23], ตามลำดับ ปฏิกิริยา PCR ถูกติดตั้งในไดรฟ์ขั้นสุดท้ายของ μl 25 ประกอบด้วยประมาณ 50 ng/μl ของดีเอ็นเอแยก μM 10 แต่ละพื้น 10XTaqบัฟเฟอร์ 2.5 มม.ของ dNTPs, 2.5 มม.ของ MgCl2 และ 1 หน่วยของ Taq DNA พอลิเมอเรส (Fermentas พิตส์เบิร์ก PA); น้ำกลั่นคู่ควบคุมค่าลบได้ ขยาย PCRเงื่อนไขมีดังนี้: denaturation เริ่มต้นที่ 95° C 3 นาที รอบ 40 95 องศาเซลเซียส 1 นาที 50, 60 และ 62° C สำหรับ COI, gltA และ rpoB ยีน ตามลำดับใน 1 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสใน 1 นาที และส่วนขยายที่ 72° C 7 นาทีสุดท้าย PCR amplicons ถูกกำหนดผ่าน agarose 1.5% เจล electrophoresis สีกับโบรไมด์ ethidium และ visualized ด้วยปริมาณหนึ่งนับวิเคราะห์ซอฟต์แวร์รุ่น 4.5.2 (เจระบบ DocEQ ไบโอ - Rad เฮอร์คิวลิส CA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยาย PCR
ไพรเมอร์ oligonucleotide เลวได้รับการออกแบบขึ้นอยู่กับลำดับ COI ของเหา (พี humanus capitis) และ Phthirus หัวหน่าวที่ได้รับจากฐานข้อมูล GenBank (GenBank: EU493419, EU493427, EU493433, EU493435, EU493437, EU493439, EU493441 สำหรับพี humanus capitis
และ EF152554, AY696000 เพื่อ AY696005 สำหรับ Ph. หัวหน่าว) เป็นไพรเมอร์ไปข้างหน้า 5'-GGTACTGGCTGGACTRTTTATCC-
3 'และคนเลวกลับลำดับไพรเมอร์เป็น 5'-CTAAARACTTTYACTCCCGTTGG-3' ไพรเมอร์สังเคราะห์โดย 1 BASE Oligonucleotide (Oligo) บริษัท ที่ให้บริการการสังเคราะห์ (ห้องปฏิบัติการฐานที่ 1, มาเลเซีย) PCR ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบเอสพีพี Bartonella หรือ Acinetobacter spp.
ดีเอ็นเอในตัวอย่างเหาหัวเป็นเป้าหมายจากยีน gltA และยีน rpoB สำหรับเอสพีพี Bartonella [24] และเอสพีพี Acinetobacter [23] ตามลำดับ ปฏิกิริยา PCR ถูกจัดตั้งขึ้นในเล่มสุดท้าย 25 ไมโครลิตรที่มีประมาณ 50 นาโนกรัม / ไมโครลิตรของดีเอ็นเอที่สกัด 10 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์, 10XTaq
บัฟเฟอร์ 2.5 มิลลิของ dNTPs 2.5 มิลลิของ MgCl2 และ 1 หน่วยดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq (Fermentas พิตส์เบิร์ก, PA); น้ำกลั่นสองคือการควบคุมเชิงลบ ขยาย PCR
เงื่อนไขดังนี้ denaturation เริ่มต้นที่ 95 ° C เป็นเวลา 3 นาที 40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 1 นาที, 50, 60 และ 62 องศาเซลเซียสเป็นเวลา COI, gltA และยีน rpoB ตามลำดับเป็นเวลา 1 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที และขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที amplicons PCR ได้รับการพิจารณาผ่าน 1.5% ข่าวคราว agarose, ย้อมด้วย ethidium bromide และมองเห็นด้วยจำนวนหนึ่งซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ปริมาณเวอร์ชัน 4.5.2 (เจลระบบ DocEQ; Bio- ราดดาว, CA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

PCR (
ทรามซึ่งโดยออกแบบตามผมลำดับของเหา ( หน้า humanus capitis ) และ phthirus หัวหน่าว ) จากฐานข้อมูลขนาด ( ขนาด : eu493419 eu493427 eu493433 eu493435 , , , , eu493439 eu493437 , , eu493441 สำหรับ P .
capitis humanus ef152554 ay696000 เพื่อ ay696005 และ , สำหรับปร . หัวหน่าว ) ไปข้างหน้า ไพรเมอร์ 5 ' - ggtactggctggactrtttatcc -
3 'และย้อนกลับลำดับการรองพื้นเป็น 5 ' - ctaaaractttyactcccgttgg-3 ' ไพรเมอร์ที่สังเคราะห์จากฐาน 1 ( เล็ก ) ซึ่งบริษัทสังเคราะห์ ( ฐาน 1 ห้องปฏิบัติการ มาเลเซีย ) ซึ่งถูกใช้เพื่อตรวจหา Bartonella spp . หรือ Acinetobacter spp .
ดีเอ็นเอในหัวโลนจำนวนเป้าหมายจาก glta ยีนและยีนสำหรับ rpob Bartonella spp . [ 24 ] และ Acinetobacter spp .[ 23 ] ตามลำดับ การตรวจปฏิกิริยาที่ถูกตั้งในหมวดสุดท้าย 25 μ L ที่มีประมาณ 50 กรัม / ลิตรμสกัดดีเอ็นเอ , 10 μ M ของแต่ละคู่ 10xtaq
, บัฟเฟอร์ , 2.5 มม. dntps 2.5 มม. ไอโซโทปและ 1 หน่วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( fermentas , พิตส์เบิร์ก , PA ) ; สองน้ำคือ ควบคุมลบ ร่วมขยาย
เงื่อนไข ดังนี้( เริ่มต้นที่ 95 องศา C เป็นเวลา 3 นาที 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 1 นาที , 50 , 60 , 62 ° C ผม glta , และจีน rpob ตามลำดับ 1 นาที 72 ° C เป็นเวลา 1 นาที และสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที การตรวจวิเคราะห์ทาง amplicons 1.5% ( gel electrophoresis และย้อมด้วยทิเดียมโบรไมด์ , visualized กับปริมาณหนึ่งปริมาณการวิเคราะห์ซอฟแวร์รุ่นที่ 45.2 ( เจล doceq ระบบ Bio - Rad , Hercules , CA )