Water samples were concentrated as previously described by
Calgua and co-workers (Calgua et al., 2013a, 2013b, 2008). Briefly, a
pre-flocculated 1% (w/v) skimmed milk solution (PSM) was prepared
by dissolving 10 g skimmed milk powder (Difco, Detroit, MI,
USA) in 1 L of artificial seawater at pH 3.5 (SigmaeAldrich Chemie
GMBH, Steinheim, Germany). All samples were carefully acidified to
pH 3.5 using 1N HCl and the conductivity was adjusted to 1.5 mS/
cm2. Then, the PSM solution was added to each of the previously
conditioned samples to obtain a final concentration of skimmed
milk in the sample of 0.01%. Samples were stirred for 8 h at room
temperature and flocks were allowed to sediment by gravity for 8 h.
Supernatants were carefully removed using a vacuum pump
without disturbing the sediment. The sediment was resuspended
using 10 mL of phosphate buffer at pH 7.5, with the exception of the
raw sewage samples and secondary treated effluents that were
suspended in 1 mL. On the same day, viral DNA was extracted from
all samples using the QIAamp Viral RNA kit (Qiagen, Inc., Valencia,
CA). Adenovirus type 35 and UltraPure™ DNase/RNase-Free
distilled water were used as positive and negative controls of the
nucleic acid (NA) extraction experiment, respectively. Finally, NA
elutants were stored at 20 C until use.
Water samples were concentrated as previously described byCalgua and co-workers (Calgua et al., 2013a, 2013b, 2008). Briefly, apre-flocculated 1% (w/v) skimmed milk solution (PSM) was preparedby dissolving 10 g skimmed milk powder (Difco, Detroit, MI,USA) in 1 L of artificial seawater at pH 3.5 (SigmaeAldrich ChemieGMBH, Steinheim, Germany). All samples were carefully acidified topH 3.5 using 1N HCl and the conductivity was adjusted to 1.5 mS/cm2. Then, the PSM solution was added to each of the previouslyconditioned samples to obtain a final concentration of skimmedmilk in the sample of 0.01%. Samples were stirred for 8 h at roomtemperature and flocks were allowed to sediment by gravity for 8 h.Supernatants were carefully removed using a vacuum pumpwithout disturbing the sediment. The sediment was resuspendedusing 10 mL of phosphate buffer at pH 7.5, with the exception of theraw sewage samples and secondary treated effluents that weresuspended in 1 mL. On the same day, viral DNA was extracted fromall samples using the QIAamp Viral RNA kit (Qiagen, Inc., Valencia,CA). Adenovirus type 35 and UltraPure™ DNase/RNase-Freedistilled water were used as positive and negative controls of thenucleic acid (NA) extraction experiment, respectively. Finally, NAelutants were stored at 20 C until use.
การแปล กรุณารอสักครู่..
ตัวอย่างน้ำมีความเข้มข้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย
Calgua และเพื่อนร่วมงาน (Calgua et al., 2013a, 2013b, 2008) สั้น ๆ
ก่อน flocculated 1% (w / v) การแก้ปัญหานมไขมันต่ำ (PSM) ถูกจัดทำขึ้น
โดยการละลาย 10 กรัมผงนมไขมันต่ำ (Difco, ดีทรอยต์, MI,
USA) ใน 1 ลิตรของน้ำทะเลเทียมที่ pH 3.5 (SigmaeAldrich Chemie
GMBH , Steinheim, เยอรมนี) ตัวอย่างทั้งหมดถูกกรดอย่างรอบคอบเพื่อให้
ค่า pH 3.5 โดยใช้ 1N HCl และการนำปรับ 1.5 mS /
cm2 แล้ววิธีการแก้ปัญหา PSM ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละก่อนหน้านี้
ตัวอย่างปรับอากาศเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของไขมันต่ำ
นมในกลุ่มตัวอย่าง 0.01% ตัวอย่างกวน 8 ชั่วโมงที่ห้อง
อุณหภูมิและฝูงได้รับอนุญาตให้ตะกอนโดยแรงโน้มถ่วงเป็นเวลา 8 ชั่วโมง.
supernatants ถูกลบออกอย่างระมัดระวังโดยใช้ปั๊มสุญญากาศ
โดยไม่ต้องรบกวนตะกอน ตะกอนถูก resuspended
ใช้ 10 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่ pH 7.5 มีข้อยกเว้นของ
ตัวอย่างเน่าและน้ำเสียได้รับการรักษาที่สองที่ถูก
ระงับใน 1 มิลลิลิตร ในวันเดียวกันนั้นดีเอ็นเอไวรัสถูกสกัดจาก
กลุ่มตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ชุด QIAamp ไวรัสอาร์เอ็นเอ (Qiagen, Inc, วาเลนเซีย,
CA) ประเภท adenovirus 35 และบริสุทธิ์™ DNase / RNase ฟรี
น้ำกลั่นถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมบวกและลบของ
กรดนิวคลีอิก (NA) การทดลองสกัดตามลำดับ สุดท้าย NA
elutants ถูกเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน
การแปล กรุณารอสักครู่..
ตัวอย่างน้ำมีความเข้มข้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดย
calgua และเพื่อนร่วมงาน ( calgua et al . , ที่มีมากกว่า 2013b , 2551 ) สั้น ๆ ,
ก่อน flocculated 1% ( w / v ) โซลูชั่นนมไขมันต่ำ ( PSM ) เตรียมโดยละลาย
10 กรัม นมผง ( difco ดีทรอยต์ , มิชิแกน ,
1 L USA ) ในน้ำทะเลเทียมที่ pH 3.5 ( sigmaealdrich CHEMIE
steinheim GmbH , Germany ) ตัวอย่างดีๆ
ปรับ pH 35 ใช้ HCl อย่างสม่ำเสมอและนำปรับ 1.5 ms /
cm2 แล้วโซลูชั่น PSM ถูกเพิ่มของแต่ละตัวอย่างก่อนหน้านี้
เครื่องปรับอากาศเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายตัก
นมในตัวอย่าง 0.01 % จำนวนคนเป็นเวลา 8 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง
และฝูงได้รับอนุญาตให้ตะกอนโดยแรงโน้มถ่วง 8 H .
supernatants ถูกลบออกอย่างระมัดระวังโดยใช้ปั๊มสูญญากาศ
โดยไม่ต้องรบกวนตะกอน . ตะกอนที่ถูก resuspended
ใช้ 10 มล. ฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 7.5 , มีข้อยกเว้นของ
กากดิบตัวอย่างและระดับปฏิบัติที่แขวนลอยในน้ำเสีย
1 มล. ในวันเดียวจากไวรัสดีเอ็นเอจากตัวอย่างการใช้ qiaamp
ทั้งหมดไวรัส RNA ชุด ( เพิ่ม , อิงค์ , วาเลนเซีย ,
CA ) . 35 และบริสุทธิ์มาก™ตรวจหา ADNase / เลสฟรี
ชนิดอะดิโนไวรัสน้ำกลั่นที่ใช้เป็นบวกและลบในการควบคุมของ
กรดนิวคลีอิก ( na ) การสกัดการทดลองตามลำดับ ในที่สุด นา
elutants เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C จนใช้
การแปล กรุณารอสักครู่..