This suppressive function of ฮิวเมน

This suppressive function of ฮิวเมน Tregs was dampened in the presence of mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ in the presence of ฮิวเมน OX4OL.
Mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 showed no effect on ฮิวเมน Tregs suppressive function.
Example 4. Molecular genetic characterization of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 5 โมโนโคลนอล antibodies clones 20E5 and 12H3


(a). Isotyping and Edman degradation
Mouse immunoglobulin class, ไอโซไทป์, and สายเบา type of Protein G-
purified mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 20E5 and 12H3 10 were determined using the IsoStripTM Mouse โมโนโคลนอล Antibody ไอโซไทป์ Kit
(Roche), and showed that both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies
clones 20E5 and 12H3 consisted of IgG1 สายหนักs and kappa (lc) สายเบาs.
After standard SDS-PAGE electrophoresis, using the pre-cast gel NuPage®
Novex® system (Invitrogen) under reduced (DTT and 70°C heating) conditions,
15 mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 was electro-blotted onto
a polyvinylidene fluoride (PDVF/Immobilon-P) transfer membrane (Millipore), and
stained with Coomassie brilliant blue (BioRad). Then, heavy and สายเบาs
bands (50 kDa and 25 kDa, ตามลำดับ) were excised from the PVDF membrane,
and used for Edman degradation analysis (performed by EuroSequence,
20 Groningen, The Netherlands) to determine the N-terminal amino acid sequences.
The results are shown in SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.61 for mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5. Eleven amino acids of the N-terminus
from สายหนักs and 11 amino acids of the N-terminus from สายเบาs were
determined.
25
(b). RT PCR
Hybridoma cells of clone 20E5 and 12H3 were harvested from cell culture.
Cells were washed with PBS, aliquoted in vials containing 5 x 106 cells, and stored
as pellets at -80°C. Cell pellets were used to isolate RNA by using RNeasy Mini 30 Isolation Kit (QIAGEN). RNA concentration was determined (A260 nm) and RNA
was stored at -80°C. Total yield of isolated RNA: 27.3 lig and 58.4 pig for clone 20E5
and clone 12H3, ตามลำดับ (A260/A280 ratio for both 1.9). By reverse
transcriptase, cDNA was synthesized from 1 lig of RNA using the RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas), and stored at -20°C.
Based on the ไอโซไทป์ (mouse kappa/IgG1) and Edman degradation analysis of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5, following primers
5 were designed to amplify V-regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 20E5:


Primer No.* Sequence** SEQ ID No. Direction Gene
* no. according to Bioceros internal coding system;
** degenerated primers: N = A, C, G, หรือ T, Y = C หรือ T, R = A หรือ G, W = A หรือ T, and S = G หรือ C.
20
Based on the ไอโซไทป์ (mouse kappa/IgG1) of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 and sense primers annealing to cDNAs encoding mouse signal peptides (partially based on Antibody Engineering Volume 1
Kontermann, Roland E.; Diibel, Stefan (Eds.), Springer Lab Manuals, 2nd ed.,
25 2010), following primers were designed to amplify V-regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3:


Primer No.* Sequence** SEQ ID No. Direction Gene
* no. according to Bioceros internal coding system;
** degenerated primers: N = A, C, G, หรือ T, Y = C หรือ T, R = A หรือ G, W = A หรือ T, and S = G หรือ C, M = C หรือ A and K = G หรือ T.
5
Primers 201 and 266 are antisense designed to anneal within the บิบิคงที่ of the mouse kappa gene at position 214-232 and 236-255 ตามลำดับ (based on accession number V00807 [version V00807.1]).
Primers 203 and 204 are antisense designed to anneal within the constant 10 region of mouse IgG1 at position 115-134 and 221-240 ตามลำดับ (based on
accession number J00453 [version J00453.1]).
Primers 259 and 260 are sense degenerate primers (degeneracy ตามลำดับ 512 and 256) annealing at the N-terminus (amino acid 1-8 and 2-9 ตามลำดับ) of the สายหนัก of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 based on
15 Edman degradation.
Primer 265 คือ a sense degenerate primer (degeneracy of 16) annealing at the N-terminus (amino acid 1-7) of the สายเบา of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibody clone 20E5 based on Edman degradation.
Primer 416 คือ antisense designed to anneal within the บิบิคงที่ of 20 mouse IgG1 at position 111-131 (based on accession number J00453 [version
J00453.1]).
Primer 394 คือ antisense designed to anneal within the บิบิคงที่ of the mouse kappa gene at position 235-254 (based on accession number V00807 [version V00807.1]).
25 Primers 389, 405 and 410 are degenerated primers (degeneracy ตามลำดับ
2, 8 and 8) annealing with signal peptide sequences of murine antibodies. Primer 389 was designed for the สายเบา, primers 405 and 410 for the สายหนัก.
Primers 201, 266, 203, 204, 259, 260, and 265 were used in various
combinations to amplify variable regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody 30 clone 20E5, and primers 416, 394, 405, 410, and 389 were used in various
combinations to amplify variable regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 12H3. Various different PCRs were done using generated cDNA of both
clones as template.







96
AccuprimeTM Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) was used to amplify variable regions of heavy and สายเบาs of both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 and clone 12H3. The PCR products were analyzed on a 1% agarose gel.
Products of PCR reactions were gel-purified and cloned in the pCR-Blunt II-
5 TOPO® vector for sequence analysis. From plasmids containing a PCR insert,
cloned inserts were analysed by DNA sequencing (performed by ServicXS B.V.,
Leiden, The Netherlands หรือ Macrogen, Amsterdam, The Netherlands) using T7 to
obtain the consensus sequence for V-regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
antibodies clones 20E5 and 12H3. Eleven informative sequences สายหนัก
10 reactions and 3 informative สายเบา sequence reactions were obtained for mouse
แอนติ-CD134 antibody clone 20E5. Five informative sequences สายหนัก reactions
and 3 informative สายเบา sequence reactions were obtained for mouse แอนติ-
CD134 antibody clone 12H3. Based on this information, consensus sequences of V-
regions of both antibodies were determined (see SEQ ID NO. 4, 5, 12 and 13).
15
Example 5. Generation of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4/kappa and/or ฮิวเมน
IgGlikappa (i.e., swapping mouse constant domains for constant ฮิวเมน IgG/kappa domains) แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 20E5 an 12H3


20 Based on determined murine V-regions (see Example 4 (b) above) of mouse
แอนติ-CD134 antibodies clones 20E5 and 12H3, a design was made to generate
ไคเมริก ฮิวเมน antibody versions. To this end, CHO cell-optimized cDNA
sequences (see SEQ ID NO. 20 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน heavy IgG4 chain clone
20E5), SEQ ID NO. 21 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน light K. chain clone 20E5), SEQ 25 ID NO. 22 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน heavy IgG1 chain clone 20E5), SEQ ID NO.
23 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน heavy IgG4 chain clone 12H3), and SEQ ID NO. 24 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน light lc chain clone 12H3)), were ordered at GENEART (Regensburg, Germany), which encoded for a murine signal peptide followed by
either the variable สายเบา linked to ฮิวเมน kappa บิบิคงที่, หรือ followed 30 by the variable สายหนัก linked to ฮิวเมน IgG บิบิคงที่. This design was
done for both antibodies; for clone 20E5, the variable สายหนัก was linked to
ฮิวเมน IgG4 หรือ to ฮิวเมน IgG1 บิบิคงที่; for clone 12H3, the variable heavy
chain region was linked to ฮิวเมน IgG4 บิบิคงที่. Using suitable restriction







97


enzymes, generated cDNAs were subcloned in pcDNA3.1-derived expression
plasmids. ไคเมริก antibodies were expressed using FreeStyleTM MAX CHO (CHO-
S cells) Expression System (Invitrogen). Expressed antibodies were purified using
affinity chromatography protein A columns (GE Healthcare). For ไคเมริก amino 5 acid sequences, see SEQ ID NO. 25, 26, 27, 28, and 29.

Example 6. Binding characterization of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4/kappa and/or IgGl/kappa แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ฟังก์ชันนี้ suppressive ของฮิวเมน Tregs ถูกชุบในต่อหน้าของเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 หรือในต่อหน้าของฮิวเมน OX4OLเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 แสดงให้เห็นว่าไม่มีผลต่อฟังก์ชัน suppressive Tregs ฮิวเมนตัวอย่างที่ 4 คุณสมบัติทางพันธุกรรมระดับโมเลกุลของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 5 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 20E5 และ 12H 3(ก) การสลายตัวของ Isotyping และ Edmanเมาส์ immunoglobulin คลาส ไอโซไทป์ และสายเบาชนิดของโปรตีน G- เมาส์ที่บริสุทธิ์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 20E5 แอนตี้โคลนและ H 12 3 10 ถูกกำหนดใช้โมโนโคลนอล IsoStripTM เมาส์แอนติบอดีไอโซไทป์ชุด (Roche), และแสดงให้เห็นว่า ทั้งเมาส์แอนตี้โมโนโคลนอล CD134 แอนติ-ฮิวเมน 20E5 โคลนและ 12H 3 ประกอบด้วย IgG1 สายหนักs และ สายเบาs กัปปะ (lc)หลังมาตรฐานองค์กรหน้า electrophoresis ใช้เจลก่อนหล่อ NuPage ® ระบบ Novex ® (Invitrogen) ลดลง (DTT และ 70° C ความร้อน) เงื่อนไข มีเมาส์ 15 แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโมโนโคลนอลโคลน 20E5 blotted จี้ไป การ polyvinylidene ฟลูออไรด์ (PDVF/Immobilon-P) โอนเมมเบรน (มาก), และ สี มีสีฟ้าสดใส Coomassie (BioRad) นั้น หนัก และ สายเบาs วง (50 kDa และ 25 kDa ตามลำดับ) ได้ excised จากเมมเบรน PVDF และใช้สำหรับวิเคราะห์การลด Edman (ดำเนินการ โดย EuroSequence 20 โกรนิงเกน ประเทศเนเธอร์แลนด์) เพื่อกำหนดลำดับกรดอะมิโนเอ็นเทอร์มินัล ผลลัพธ์จะแสดงในลำดับรหัส NO.3 และลำดับครั้งที่ 61 รหัสสำหรับเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 กรดอะมิโนที่สิบเอ็ดของ N-เทอร์มินัส จาก สายหนักs และกรดอะมิโนที่ 11 ของ N-นัสจาก สายเบาs ได้ กำหนด25(ข) การ RT PCRเซลล์ hybridoma 20E5 โคลนและ 12H 3 ได้เก็บเกี่ยวผลผลิตจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ ล้าง ด้วย PBS, aliquoted ในเซลล์ 5 x 106, vials และเก็บเซลล์ เป็นขี้ที่-80 องศาเซลเซียส ขี้เซลล์ถูกใช้เพื่อแยกอาร์เอ็นเอ โดยใช้ RNeasy มินิ 30 แยกชุด (QIAGEN) ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอถูกกำหนด (A260 nm) และอาร์เอ็นเอ ถูกเก็บไว้ที่-80 องศาเซลเซียส ผลผลิตรวมของอาร์เอ็นเอที่แยก: 27.3 lig และหมู 58.4 สำหรับ 20E5 โคลน และโคลน 12H 3 ตามลำดับ (A260/A280 อัตราส่วนสำหรับทั้ง 1.9) โดยย้อนกลับtranscriptase, cDNA ถูกสังเคราะห์จาก lig 1 ของอาร์เอ็นเอโดยใช้ cDNA RevertAidTM H ลบแรกสาระชุดสังเคราะห์ (Fermentas), และจัดเก็บที่-20 องศาเซลเซียส ไอโซไทป์ (กัปปะเมาส์ IgG1) และวิเคราะห์การลด Edman เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 สังกะสี วัสดุต่อไปนี้5 ถูกออกแบบมาเพื่อขยาย V-ภูมิภาคของเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5:รองพื้น No.* ลำดับ ** ลำดับรหัสหมายเลข ทิศทางของยีน* ไม่ ตาม Bioceros รหัสระบบ ภายใน** ไพรเมอร์ degenerated: N = A, C, G หรือ T, Y = C หรือ T, R =การหรือ G, W =หรือ T และ S = G หรือ c20ตามไอโซไทป์ (กัปปะเมาส์ IgG1) ของเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134แอนติบอดีโมโนโคลนอลโคลน 12H 3 และไพรเมอร์รู้สึกการอบเหนียวใน cDNAs เข้าเมาส์สัญญาณเปปไทด์ (บางส่วนตามปริมาณแอนติบอดีวิศวกรรม 1 Kontermann, E. โรแลนด์ Diibel, Stefan (Eds.) คู่มือ Lab Springer, 2 ed.,25 2010), ต่อไปนี้ไพรเมอร์ออกแบบมาเพื่อขยาย V-ภูมิภาคของเมาส์แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดีโมโนโคลนอล CD134 โคลน 12H 3:รองพื้น No.* ลำดับ ** ลำดับรหัสหมายเลข ทิศทางของยีน* ไม่ ตาม Bioceros รหัสระบบ ภายใน** ไพรเมอร์ degenerated: N = A, C, G หรือ T, Y = C หรือ T, R =การหรือ G, W =หรือ T และ S = G หรือ C, M = C หรือ A และ K = G หรือต.5Primers 201 and 266 are antisense designed to anneal within the บิบิคงที่ of the mouse kappa gene at position 214-232 and 236-255 ตามลำดับ (based on accession number V00807 [version V00807.1]).Primers 203 and 204 are antisense designed to anneal within the constant 10 region of mouse IgG1 at position 115-134 and 221-240 ตามลำดับ (based on accession number J00453 [version J00453.1]).Primers 259 and 260 are sense degenerate primers (degeneracy ตามลำดับ 512 and 256) annealing at the N-terminus (amino acid 1-8 and 2-9 ตามลำดับ) of the สายหนัก of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 based on15 Edman degradation.Primer 265 คือ a sense degenerate primer (degeneracy of 16) annealing at the N-terminus (amino acid 1-7) of the สายเบา of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 based on Edman degradation.Primer 416 คือ antisense designed to anneal within the บิบิคงที่ of 20 mouse IgG1 at position 111-131 (based on accession number J00453 [version J00453.1]).Primer 394 คือ antisense designed to anneal within the บิบิคงที่ of the mouse kappa gene at position 235-254 (based on accession number V00807 [version V00807.1]).25 Primers 389, 405 and 410 are degenerated primers (degeneracy ตามลำดับ2, 8 and 8) annealing with signal peptide sequences of murine antibodies. Primer 389 was designed for the สายเบา, primers 405 and 410 for the สายหนัก.Primers 201, 266, 203, 204, 259, 260, and 265 were used in variouscombinations to amplify variable regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody 30 clone 20E5, and primers 416, 394, 405, 410, and 389 were used in various combinations to amplify variable regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3. Various different PCRs were done using generated cDNA of both clones as template. 96AccuprimeTM Pfx DNA Polymerase (Invitrogen) was used to amplify variable regions of heavy and สายเบาs of both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 and clone 12H3. The PCR products were analyzed on a 1% agarose gel.Products of PCR reactions were gel-purified and cloned in the pCR-Blunt II-5 TOPO® vector for sequence analysis. From plasmids containing a PCR insert, cloned inserts were analysed by DNA sequencing (performed by ServicXS B.V., Leiden, The Netherlands หรือ Macrogen, Amsterdam, The Netherlands) using T7 to obtain the consensus sequence for V-regions of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 20E5 and 12H3. Eleven informative sequences สายหนัก 10 reactions and 3 informative สายเบา sequence reactions were obtained for mouseแอนติ-CD134 antibody clone 20E5. Five informative sequences สายหนัก reactions and 3 informative สายเบา sequence reactions were obtained for mouse แอนติ- CD134 antibody clone 12H3. Based on this information, consensus sequences of V- regions of both antibodies were determined (see SEQ ID NO. 4, 5, 12 and 13). 15Example 5. Generation of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4/kappa and/or ฮิวเมนIgGlikappa (i.e., swapping mouse constant domains for constant ฮิวเมน IgG/kappa domains) แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 20E5 an 12H320 Based on determined murine V-regions (see Example 4 (b) above) of mouseแอนติ-CD134 antibodies clones 20E5 and 12H3, a design was made to generateไคเมริก ฮิวเมน antibody versions. To this end, CHO cell-optimized cDNAsequences (see SEQ ID NO. 20 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน heavy IgG4 chain clone 20E5), SEQ ID NO. 21 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน light K. chain clone 20E5), SEQ 25 ID NO. 22 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน heavy IgG1 chain clone 20E5), SEQ ID NO.23 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน heavy IgG4 chain clone 12H3), and SEQ ID NO. 24 (coding for ไคเมริก ฮิวเมน light lc chain clone 12H3)), were ordered at GENEART (Regensburg, Germany), which encoded for a murine signal peptide followed byeither the variable สายเบา linked to ฮิวเมน kappa บิบิคงที่, หรือ followed 30 by the variable สายหนัก linked to ฮิวเมน IgG บิบิคงที่. This design was done for both antibodies; for clone 20E5, the variable สายหนัก was linked to ฮิวเมน IgG4 หรือ to ฮิวเมน IgG1 บิบิคงที่; for clone 12H3, the variable heavy chain region was linked to ฮิวเมน IgG4 บิบิคงที่. Using suitable restriction 97enzymes, generated cDNAs were subcloned in pcDNA3.1-derived expressionplasmids. ไคเมริก antibodies were expressed using FreeStyleTM MAX CHO (CHO- S cells) Expression System (Invitrogen). Expressed antibodies were purified using affinity chromatography protein A columns (GE Healthcare). For ไคเมริก amino 5 acid sequences, see SEQ ID NO. 25, 26, 27, 28, and 29.Example 6. Binding characterization of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4/kappa and/or IgGl/kappa แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ฟังก์ชั่นปราบนี้ของฮิวเมน Tregs ได้รับผลกระทบในการปรากฏตัวของเมาส์แอนติ - การฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 หรือในการปรากฏตัวของฮิวเมน OX4OL.
หนูแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโน โคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 แสดงให้เห็นว่าไม่มีผลกระทบต่อฮิวเมน Tregs ฟังก์ชั่นปราบ.
ตัวอย่าง 4. ลักษณะทางพันธุกรรมระดับโมเลกุลของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 5 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 และ 12H3 (ก) Isotyping และการย่อยสลาย Edman ระดับอิมมูโน Mouse, ไอโซไทป์และสายชนิดเบา G- โปรตีนบริสุทธิ์เมาส์แอนติ- ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 12H3 และ 10 ได้รับการพิจารณาโดยใช้ IsoStripTM เมาส์โมโนโคลนอ ลแอนติบอดีไอโซไทป์ Kit (Roche) และแสดงให้เห็นว่าทั้งเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน20E5 และ 12H3 ประกอบด้วย IgG1 สายหนักและคัปปา (LC) สายเบาเอส. หลังจากที่ได้มาตรฐาน อิ SDS-PAGE โดยใช้เจลก่อนโยนNuPage®ระบบNovex® (Invitrogen) ภายใต้ลดลง (DTT และ 70 องศาเซลเซียสความร้อน) เงื่อนไข 15 เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 เป็นไฟฟ้า -blotted บนฟลูออไรPolyvinylidene (ที่ PDVF / Immobilon-P) เมมเบรนโอน (ค) และย้อมด้วยสีCoomassie สดใสสีฟ้า (BioRad) จากนั้นหนักและสายเบาของวงดนตรี (50 กิโลดาลตันและ 25 กิโลดาลตันตามลำดับ) ถูกตัดจากเมมเบรน PVDF ที่และใช้ในการวิเคราะห์การย่อยสลายEdman (แสดงโดย EuroSequence, 20 Groningen, เนเธอร์แลนด์) เพื่อตรวจสอบกรดอะมิโน n- ขั้ว ลำดับ. ผลที่ได้แสดงไว้ในฉบับที่ 3 ID SEQ และ SEQ ID No.61 เมาส์แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี 20E5 โคลน อีเลฟเว่กรดอะมิโนของ N-ปลายทางจากสายหนักและกรดอะมิโน11 ของ N-ปลายทางจากสายเบาของถูกกำหนด. 25 (ข) RT PCR เซลล์ไฮบริโคลน 20E5 และ 12H3 ถูกเก็บเกี่ยวจากการเพาะเลี้ยงเซลล์. เซลล์ที่ถูกล้างด้วยพีบีเอส aliquoted ในขวดที่มีขนาด 5 x 106 เซลล์และเก็บไว้เป็นเม็ดที่-80 องศาเซลเซียส เม็ดมือถือที่ถูกนำมาใช้เพื่อแยกอาร์เอ็นเอโดยใช้ RNeasy มินิ 30 แยก Kit (QIAGEN) ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอที่ถูกกำหนด (A260 นาโนเมตร) และ RNA ถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส อัตราผลตอบแทนรวมของอาร์เอ็นเอที่แยก: 27.3 และ 58.4 lig หมูสำหรับ 20E5 โคลนและโคลน12H3, ตามลำดับ (A260 / A280 อัตราส่วนทั้ง 1.9) โดยย้อนกลับtranscriptase, ยีนสังเคราะห์จาก 1 lig ของอาร์เอ็นเอโดยใช้ RevertAidTM H ลบแรก Strand ยีนสังเคราะห์ Kit (Fermentas) และเก็บไว้ที่ -20 ° C. ขึ้นอยู่กับไอโซไทป์ (คัปปาเมาส์ / IgG1) และการย่อยสลาย Edman การวิเคราะห์เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 ตามไพรเมอร์5 ได้รับการออกแบบเพื่อขยาย V ภูมิภาคเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล20E5 โคลนแอนติบอดี: ไพรเมอร์ครั้งที่ * ลำดับ ** SEQ ID ฉบับทิศทางยีน* ไม่มี ตามระบบการเข้ารหัสภายใน Bioceros; ** ถดถอยไพรเมอร์: ยังไม่มี = A, C, G, หรือ T, Y = C หรือ T, R = a หรือ G, W = a หรือ T และ S = G หรือซี20 ตาม บนไอโซไทป์ (คัปปาเมาส์ / IgG1) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และความรู้สึกไพรเมอร์หลอมเพื่อ cDNAs เข้ารหัสเปปไทด์สัญญาณเมาส์ (ส่วนบนพื้นฐานของปริมาณวิศวกรรมแอนติบอดี 1 Kontermann โรลันด์ . E .; Diibel สเตฟาน (. สหพันธ์) สปริงคู่มือการใช้งานแล็บ, 2 เอ็ด, 25 2010), ไพรเมอร์ต่อไปนี้ถูกออกแบบมาเพื่อขยาย V ภูมิภาคเมาส์แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3: ไพรเมอร์ครั้งที่ * ลำดับ ** SEQ ID ฉบับทิศทางยีน* ไม่มี ตามระบบการเข้ารหัสภายใน Bioceros; ** ถดถอยไพรเมอร์: ยังไม่มี = A, C, G, หรือ T, Y = C หรือ T, R = a หรือ G, W = a หรือ T และ S = G หรือ C, M = C หรือ A และ K = G หรือ T. 5 ไพรเมอร์ 201 และ 266 เป็น antisense ออกแบบมาเพื่อหลอมภายในบิบิคงที่ของยีนคัปปาเมาส์ที่ 214-232 และ 236-255 ตำแหน่งตามลำดับ (ที่ขึ้นอยู่กับจำนวนการเข้า V00807 [รุ่น V00807.1]). ไพรเมอร์ 203 และ 204 เป็น antisense ออกแบบมาเพื่อหลอมภายในคงที่ 10 ภูมิภาคของ IgG1 เมาส์ที่ 115-134 และ 221-240 ตำแหน่งตามลำดับ (ขึ้นอยู่กับจำนวนการเข้าJ00453 [รุ่น J00453.1]). ไพรเมอร์ 259 และความรู้สึกที่ 260 ไพรเมอร์เป็นคนเลว (เสื่อมตามลำดับ 512 และ 256) หลอมที่ N-ปลายทาง (กรดอะมิโน 1-8 และ 2-9 ตามลำดับ) ของสายหนักเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 ขึ้นอยู่กับ. 15 Edman ย่อยสลายPrimer ไพรเมอร์ 265 คือความรู้สึกเลว (เสื่อม 16) หลอมที่ N-ปลายทาง (กรดอะมิโนที่ 1-7) ของสายเบาเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ขึ้นอยู่กับ Edman ย่อยสลาย. ไพรเมอร์ 416 คือ antisense ออกแบบมาเพื่อหลอมภายในบิบิคงที่ของ IgG1 20 เมาส์ที่ 111-131 ตำแหน่ง (ขึ้นอยู่กับจำนวนการเข้า J00453 [รุ่นJ00453.1]). ไพรเมอร์ 394 คือ antisense ออกแบบมาเพื่อหลอมภายในบิบิ คงที่ของยีนคัปปาเมาส์ที่ 235-254 ตำแหน่ง (ขึ้นอยู่กับจำนวนการเข้า V00807 [รุ่น V00807.1]). 25 ไพรเมอร์ 389, 405 และ 410 จะถดถอยไพรเมอร์ (เสื่อมตามลำดับ2, 8 และ 8) การหลอมเปปไทด์ที่มีสัญญาณ ลำดับของแอนติบอดีหมา ไพรเมอร์ 389 ถูกออกแบบมาสำหรับสายเบาที่ไพรเมอร์ 405 และ 410 สำหรับสายหนัก. ไพรเมอร์ 201, 266, 203, 204, 259, 260, และ 265 ถูกนำมาใช้ในหลาย ๆ ด้านรวมกันเพื่อขยายภูมิภาคตัวแปรเมาส์แอนติ- ฮิว แอนติบอดีเมน CD134 30 โคลน 20E5 และไพรเมอร์ 416, 394, 405, 410 และ 389 ถูกนำมาใช้ในหลาย ๆ ด้านรวมกันเพื่อขยายภูมิภาคตัวแปรเมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 PCRs ที่แตกต่างหลากหลายได้ทำใช้สร้าง cDNA ของทั้งสองโคลนเป็นแม่. 96 AccuprimeTM PFX ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Invitrogen) ถูกนำมาใช้เพื่อขยายภูมิภาคตัวแปรหนักและสายเบาของเมาส์ทั้งแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 และโคลน 12H3 ผลิตภัณฑ์ PCR วิเคราะห์ในเจล 1% agarose. ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา PCR เป็นเจลบริสุทธิ์และโคลนใน PCR-Blunt II- 5 TOPO®เวกเตอร์สำหรับการวิเคราะห์ลำดับ จากพลาสมิดที่มีแทรก PCR ที่แทรกโคลนวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอ(แสดงโดย ServicXS BV, Leiden, เนเธอร์แลนด์หรือ Macrogen, อัมสเตอร์ดัม, เนเธอร์แลนด์) โดยใช้ T7 ที่จะได้รับความเห็นลำดับสำหรับV-ภูมิภาคของเมาส์แอนติ - ฮิ วเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 20E5 และ 12H3 อีเลฟเว่ลำดับข้อมูลสายหนัก10 ปฏิกิริยาและ 3 ข้อมูลสายเบาปฏิกิริยาลำดับที่ได้รับเมาส์แอนติ-CD134 แอนติบอดี 20E5 โคลน ห้าลำดับข้อมูลสายหนักปฏิกิริยาและ 3 ข้อมูลสายเบาปฏิกิริยาลำดับที่ได้รับเมาส์แอนติ - แอนติบอดีโคลน CD134 12H3 จากข้อมูลนี้ลำดับฉันทามติของ V- ภูมิภาคของแอนติบอดีทั้งสองได้รับการพิจารณา (ดูรหัส SEQ NO. 4, 5, 12 และ 13). 15 ตัวอย่าง 5. รุ่นของไคเมริกฮิวเมน IgG4 / คัปปาและ / หรือฮิ วเมนIgGlikappa (เช่นการแลกเปลี่ยนโดเมนคงเมาส์สำหรับการคงที่ฮิวเมน IgG / คัปปาโดเมน) แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 20E5 12H3 20 จากความมุ่งมั่นที่หมา V-ภูมิภาค (ดูตัวอย่างที่ 4 ( ข) ข้างต้น) เมาส์แอนติ-CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 12H3 และการออกแบบที่ถูกสร้างขึ้นมาเพื่อสร้างไคเมริกฮิวเมนรุ่นแอนติบอดี ด้วยเหตุนี้การเพิ่มประสิทธิภาพเซลล์ CHO cDNA ลำดับ (ดูรหัส SEQ NO. 20 (การเข้ารหัสสำหรับไคเมริกฮิวเมนโซ่โคลน IgG4 หนัก20E5) SEQ ID NO. 21 (การเข้ารหัสสำหรับไคเมริกฮิวเมนแสงเค ห่วงโซ่โคลน 20E5) SEQ 25 ID NO. 22 (การเข้ารหัสสำหรับไคเมริกฮิวเมนโซ่ IgG1 หนักโคลน 20E5) ID SEQ NO. 23 (การเข้ารหัสสำหรับไคเมริกฮิวเมนโซ่โคลน IgG4 หนัก 12H3) และ SEQ ID NO. 24 (การเข้ารหัสสำหรับไคเมริกฮิวเมน LC แสงห่วงโซ่โคลน 12H3)) ได้รับคำสั่งที่ GENEART (Regensburg, เยอรมนี) ซึ่งการเข้ารหัสเพื่อให้เปปไทด์สัญญาณหมาตามมาด้วยทั้งตัวแปรสายเบาเชื่อมโยงกับฮิวเมนคัปปาบิบิคงที่, หรือตามที่ 30 โดยตัวแปรสายหนักที่เชื่อมโยงกับฮิวเมน IgG บิบิคงที่ การออกแบบนี้ได้รับการทำเพื่อแอนติบอดีทั้งสอง สำหรับ 20E5 โคลนตัวแปรสายหนักที่เชื่อมโยงกับฮิวเมนIgG4 หรือการฮิวเมน IgG1 บิบิคงที่; สำหรับโคลน 12H3 หนักตัวแปรภูมิภาคห่วงโซ่ที่เชื่อมโยงกับฮิวเมนIgG4 บิบิคงที่ ข้อ จำกัด การใช้ที่เหมาะสม97 เอนไซม์ cDNAs ถูกสร้าง subcloned ในการแสดงออกของ pcDNA3.1 ที่ได้มาจากพลาสมิด ไคเมริกแอนติบอดีที่ได้สามารถแสดงออกโดยใช้ FreeStyleTM MAX CHO (CHO- เซลล์ S) ระบบการแสดงออก (Invitrogen) แอนติบอดีแสดงความบริสุทธิ์โดยใช้โปรตีนโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดคอลัมน์ A (GE Healthcare) สำหรับไคเมริกอะมิโน 5 ลำดับกรดให้ดู SEQ ID NO 25, 26, 27, 28, และ 29 ตัวอย่าง 6. ลักษณะการผูกของไคเมริกฮิวเมน IgG4 / คัปปาและ / หรือ IgGl / คัปปาแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ฟังก์ชันนี้ปราบปรามของฮิวเมนทีเร็กส์ได้ขยายเวลาในการแสดงตนของแอนติ - เมาส์ฮิวเมน
cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ค็อคในการแสดงตนของฮิวเมน ox4ol .
เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5 พบว่าไม่มีผลต่อฮิวเมนทีเร็กส์ปราบฟังก์ชัน .
ตัวอย่าง 4 .พันธุศาสตร์โมเลกุลคุณสมบัติของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 5 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนและ 20e5 12h3


( A ) และ isotyping งูหัวกระโหลก
เมาส์อิมมูโนโกลบูลิน ชั้น ไอโซไทป์และสายเบาประเภทของโปรตีน G -
เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5 12h3 10 และบริสุทธิ์ถูกใช้ isostriptm เมาส์โมโนโคลนอลแอนติบอดีไอโซไทป์ Kit
( โรช ) และพบว่าทั้งเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี
โคลนและมี 20e5 12h3 ( สายหนักและกัปปะ ( LC ) สายเบา
Sหลังจาก electrophoresis เอนไซม์มาตรฐาน ใช้เจลก่อนโยน nupage ®
novex ®ระบบ ( Invitrogen ) ภายใต้การลด ( 20 และ 70 องศา C ความร้อน ) เงื่อนไข
เมาส์ 15 แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนเปื้อนไปยังโรง 20e5 คือ : ีนฟลูออไรด์ ( pdvf / immobilon-p ) เมมเบรนถ่ายโอน ( มิลลิ ) และ
เปรอะเปื้อน กับเหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้าสดใส ( biorad ) จากนั้นหนักและสายเบา S
วง ( แยก 50 และ 25 kDa ตามลำดับ ) ถูกตัดจากเมมเบรน PVDF ,
และใช้สำหรับการวิเคราะห์การสลายตัว edman ( แสดงโดย eurosequence
20 , Groningen , เนเธอร์แลนด์ ) หากรดอะมิโนกรดอะมิโน .
ผลจะแสดงใน seq id seq id 3 และ no.61 สำหรับแอนติ - เมาส์ฮิวเมน
cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5 .สิบเอ็ดกรดอะมิโนของยีน
จากสายหนักและ 11 กรดอะมิโนของยีนจากสายเบา 2

25 กำหนด
( B ) RT PCR
hybridoma เซลล์ของ 20e5 โคลนและ 12h3 ถูกเก็บเกี่ยวจากเซลล์เพาะเลี้ยง
เซลล์ถูกล้างด้วย aliquoted พีบีเอสในหลอดแก้วที่มี 5 x 106 เซลล์ , และเก็บไว้
เป็นเม็ดที่ - 80 องศาเซลล์เม็ดถูกใช้เพื่อแยก RNA โดยใช้ rneasy มินิ 30 แยกชุด ( เพิ่ม ) อาร์เอ็นเอสมาธิตั้งใจ ( a260 nm ) และ RNA
คืออุณหภูมิ - 80 องศา รวมผลผลิตของแยก RNA : 27.3 lig และ 58.4 หมู
20e5 โคลนและโคลน 12h3 ตามลำดับ , อัตราส่วน a260 / a280 ทั้ง 1.9 ) โดย Reverse transcriptase
,ยีนสังเคราะห์จาก 1 ลีกของ RNA โดยใช้ revertaidtm H ลบเส้นดีเอ็นเอสังเคราะห์ชุดแรก ( fermentas ) และเก็บไว้ที่ - 20 องศา C .
ตามไอโซไทป์ ( เมาส์คัป / ( ) และงูหัวกระโหลกการวิเคราะห์แอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนด้วย
20e5 ดังต่อไปนี้5 ถูกออกแบบมาเพื่อขยาย v-regions ของแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล
แอนติบอดีโคลน 20e5 :


* * * รองพื้น ไม่ดับ ไม่ seq id ทิศทางยีน
* ไม่ตาม bioceros ภายในระบบการเข้ารหัส ;
* * เสื่อมโดย : N = A , C , G , ค็อค T , Y = C ค็อค T , r = ค็อค G , W = ค็อค T และ S = G C .
20
ค็อคตามไอโซไทป์ ( เมาส์คัป / ( ) แอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134
โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 และความรู้สึกชนิดอ่อนจะ cdnas การเข้ารหัสสัญญาณเมาส์เปปไทด์ ( บางส่วนจากแอนติบอดีวิศวกรรมเล่ม 1
kontermann Roland E ; diibel สเตฟาน ( แผนที่ ) , Springer คู่มือปฏิบัติการ , 2 Ed .
25 , 2010 )ต่อไปนี้โดยออกแบบเพื่อขยาย v-regions ของแอนติ - เมาส์ฮิวเมน
cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 :


* * * รองพื้น ไม่ดับ ไม่ seq id ทิศทางยีน
* ไม่ตาม bioceros ภายในระบบการเข้ารหัส ;
* * เสื่อมโดย : N = A , C , G , ค็อค T , Y = C ค็อค t , r = ค็อค G , W = ค็อค T และ S = g ค็อค CM = C ค็อคและ k = G ค็อค T .
5
ไพรเมอร์และ 266 เป็น antisense ออกแบบมาเพื่อหลอมภายในบิบิคงที่ของเมาส์ Kappa ยีนที่ตำแหน่งและ 214-232 236-255 ตามลำดับ ( ตามหนังสือเลขที่ v00807 รุ่น v00807.1
[ ] )ไพรเมอร์ 203 และ 204 เป็น antisense ออกแบบมาเพื่อหลอมภายในคงที่ 10 เขต ( เมาส์ที่ตำแหน่ง 115-134 และ 221-240 ตามลำดับ ( ตามหนังสือเลขที่ j00453 รุ่น j00453.1 [

] )259 และ 260 ชนิดได้เสื่อมลงไพรเมอร์ ( ความเสื่อมและตามลำดับ 512 256 ) annealing ที่ยีน ( 1-8 2-9 กรดอะมิโนและตามลำดับ ) ของสายหนักของแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ตาม

15 งูหัวกระโหลก .