Gene-specific primers were designed

Gene-specific primers were designed with Primer PREMIER Software
5.0, based on the cDNA sequences in GenBank (Igf I: EU051323,
Igf II: EF062860, Try: FJ641976, Amy: FJ641975, Lpl: FJ436077, Bsal:
FJ641972, Npy: FJ641971, Act: M25013.1) (Table 1). The primers for
Egf, Npy Y8a, Npy Y8b, Ob-r and Ob-rgrp genes were designed with the
cDNA sequences in ESTs library of grass carp (The Key Lab of Tropical
& Subtropical Fish Breeding & Cultivation of Chinese Academy of Fishery
Sciences, Pearl River Fisheriers Research Institute of Chinese Academy
of Fishery Sciences, Guangzhou, China; 510380) (Table 1). The genespecific
primers were synthesized by Sangon (Shanghai, China). The
SYBR@ Premix Ex TaqTM Kit (Takara, Japan) was used for real-time
PCR on a Chromo 4 Real-Time Detection System (MJ Research, USA) according
to the manufacturer's instructions. Each PCR reaction consisted
of 10 μl 2× SYBR Mix, 0.4 μm forward primer, 0.4 μm reverse primer
and 1 μl cDNA as template. Double distilled water was used to adjust
the total volume of each reaction to 20 μl. Melting curve analysis of
PCR products was performed at the end of each PCR reaction to confirm
the specificity. For each sample, quantitative PCR was performed in
triplicate. Reactions were based on a three-step method, 95 °C for
3 min initially, followed by 45 cycles, and each cycle was performed
with the temperatures of 95 °C for 20 s, 57 °C for 20 s and 72 °C for
35 s, respectively. Pooled cDNA samples of liver tissues were used to
generate the calibration curves. The amplification efficiencies of control
and target genes were approximately equal and ranged from 93.6% to
101.9%. Gene expression levels were quantified relative to the expression
of beta-actin using the optimized comparative Ct (2−ΔΔCt)
value method (Livak and Schmittgen, 2001). All amplifications were

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไพรเมอร์ของยีนเฉพาะถูกออกแบบ ด้วยซอฟต์แวร์พื้นพรีเมียร์5.0 ตามลำดับ cDNA ใน GenBank (Igf i: EU051323Igf II: EF062860 ลอง: FJ641976 มี: เอส FJ641975: FJ436077, Bsal:FJ641972, Npy: FJ641971 พระราชบัญญัติ: M25013.1) (ตารางที่ 1) ไพรเมอร์สำหรับY8b Npy, Ob-r และยีน Ob rgrp, Npy Y8a, Egf ถูกออกแบบด้วยการลำดับ cDNA ในไลบรารีของ ESTs ของเฉา (เดอะคีย์ห้องปฏิบัติการของเขตร้อน& แบบปลาผสมพันธุ์และเพาะปลูกของจีนวิทยาลัยประมงศาสตร์ แม่น้ำเพิร์ล Fisheriers สถาบันวิจัยจีน Academyวิทยาการประมง กวางเจา จีน 510380) (ตาราง 1) Genespecificไพรเมอร์ถูกสังเคราะห์ โดย Sangon (เซี่ยงไฮ้ จีน) ที่ใช้ SYBR @ Premix Ex TaqTM ชุดอุปกรณ์ (Takara ญี่ปุ่น) สำหรับแบบเรียลไทม์PCR ในแสง 4 Real-Time ตรวจสอบระบบ (MJ วิจัย สหรัฐอเมริกา) ตามให้คำแนะนำของผู้ผลิต แต่ละปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วยของ μl 2 10 × SYBR ผสม รองพื้นไปข้างหน้า μm 0.4, 0.4 μm กลับพื้นและ 1 μl cDNA เป็นแม่ ใช้น้ำกลั่นคู่ปรับปริมาตรรวมของแต่ละปฏิกิริยาจะ 20 μl ละลายวิเคราะห์เส้นโค้งทำผลิตภัณฑ์ PCR ในตอนท้ายของแต่ละปฏิกิริยา PCR เพื่อยืนยันspecificity สำหรับแต่ละตัวอย่าง ทำ PCR เชิงปริมาณในtriplicate ปฏิกิริยาได้ตามวิธีการขั้นตอนที่สาม 95 ° C สำหรับ3 นาทีแรก ตาม ด้วยรอบ 45 และมีดำเนินการแต่ละรอบมีอุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียสสำหรับ 20 s, 57 ° C สำหรับ 20 s และ 72 ° C สำหรับ35 s, respectively. Pooled cDNA samples of liver tissues were used togenerate the calibration curves. The amplification efficiencies of controland target genes were approximately equal and ranged from 93.6% to101.9%. Gene expression levels were quantified relative to the expressionof beta-actin using the optimized comparative Ct (2−ΔΔCt)value method (Livak and Schmittgen, 2001). All amplifications were

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ไพรเมอร์ที่จำเพาะกับยีนออกแบบไพรเมอร์ชั้นนำซอฟต์แวร์
5.0 ตามลำดับ cDNA พบ ( IGF I : eu051323
, IGF II : ef062860 ลอง : fj641976 เอมี่ : fj641975 lpl fj436077 , : , fj641972 npy : bsal :
, fj641971 แสดง : m25013.1 ) ( ตารางที่ 1 ) ไพรเมอร์สำหรับ
( 1 ) npy y8a npy y8b , , , และ ob-r OB rgrp ยีนถูกออกแบบด้วย
ลำดับยีนในฐานข้อมูลห้องสมุดของหญ้าปลาคาร์พ ( กุญแจห้องทดลองของเขตร้อน
&เขตร้อนปลาพันธุ์&การเพาะปลูกของจีน Academy of วิทยาศาสตร์ประมง
, Pearl River fisheriers สถาบันวิจัยจีน Academy
ประมงวิทยาศาสตร์ , กว่างโจว , จีน 510380 ) ( ตารางที่ 1 ) ไพรเมอร์ genespecific
ถูกสังเคราะห์โดยแสงอ่อน ( เซี่ยงไฮ้ , จีน )
SYBR @ รวม taqtm Kit ( ทาการะ แฟนเก่า ,ญี่ปุ่น ) ใช้ PCR แบบเรียลไทม์
บนสี 4 เวลาจริงระบบตรวจจับ ( USA ) , MJ
) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต แต่ละเทคนิคปฏิกิริยาคือ 10 μ l
2 × SYBR ผสม , 0.4 μ M ส่งต่อรองพื้น , 0.4 μ M กลับรองพื้น
1 μ L ยีนเป็นแม่แบบ คู่น้ำกลั่นใช้ปรับ
ปริมาณรวมของแต่ละปฏิกิริยา 20 μละลายโค้งการวิเคราะห์
Lผลิตภัณฑ์ PCR คือการสิ้นสุดของปฏิกิริยา PCR แต่ละยืนยัน
specificity สำหรับแต่ละตัวอย่าง เทคนิคเชิงปริมาณในการปฏิบัติ
ทำสำเนาสามฉบับ . ปฏิกิริยาขึ้นอยู่กับขั้นตอนวิธี 95 องศา C
3 นาทีแรก ตามด้วย 45 รอบ และแต่ละรอบแสดง
ด้วยอุณหภูมิ 95 องศา C เป็นเวลา 20 วินาที , 57 องศา C เป็นเวลา 20 และ 72 ° C
35 วินาที ตามลำดับรวมตัวอย่างเนื้อเยื่อตับยีนใช้

สร้างเส้นโค้งสอบเทียบ โดยการเพิ่มประสิทธิภาพของการควบคุม
และเป้าหมายยีนประมาณเท่ากัน และอยู่ระหว่าง 93.6 %

101.9 % ระดับการแสดงออกของยีนเป็นวัดเทียบกับการแสดงออกของเบต้าแอคติน
ใช้ปรับเปรียบเทียบ CT ( 2 −ΔΔ CT )
( และวิธีมูลค่า livak schmittgen , 2001 ) amplifications ทั้งหมดคือ