2.4. Real-time RT-PCR analysiscDNA

2.4. Real-time RT-PCR analysis
cDNA was synthesized from total RNA using a PrimeScript RT
Reagent Kit with gDNA Eraser (Takara), and then real-time RT-PCR
was performed using an SYBR Premix Ex Taq II (Takara). The con-
ditions for real-time RT-PCR were as follows: 37
? C for 15 min and
85
? C for 5 s for cDNA synthesis, and then 40 cycles at 95 ? C for 5 s
and at 60
? C for 30 s for PCR amplification. Nucleotide sequences of
the primers used in this study were as follows: AtPR1 primers (5 0 -
CCTGGGGTAGCGGTGACTT-3 0 and 5 0 -CGTGTTCGCAGCGTAGTTGT-3 0 ,
A. thaliana pathogenesis-related protein 1 mRNA, GenBank acces-
sion no. NM_127025), AtPDF1.2 primers (5 0 -TCACCCT-
TATCTTCGCTGCTC-3 0 and 5 0 -ACCATGTCCCACTTGGCTTC-3 0 ,
A. thaliana putative antifungal protein PDF1.2 mRNA, GenBank
accession no. AY063779), and AtACT primers (5 0 -GCCGACA-
GAATGAGCAAAGAG-3 0 and 5 0 -AGGTACTGAGGGAGGCCAAGA-3 0 ,
A. thaliana actin 1 mRNA, GenBank accession no. NM_179953).
Actin was used for normalization. Dissociation curves were
analyzed to verify the specificity of the amplification reaction using
the Thermal Cycler Dice Real Time System Single Software ver. 3.00
(Takara). The expression level of each gene was determined as the
number of amplification cycles needed to reach a fixed threshold
using the standard curve method, and then expressed as a relative
value.
2.5. Antagonistic activity of iturin A derivative peptides
Mycelial discs of Colletotrichum gloeosporioides, which causes
strawberry anthracnose and grape ripe rot diseases, were placed
on potato dextrose agar plates. At the same time, sterilized paper
discs were placed on the plates and then inoculated with 50 m L of
0.1 mg/ml iturin A or iturin A derivative peptides. The plates were
incubated at 25
? C for 5 days. The antagonistic effects of the de-
rivative peptides toward C. gloeosporioides mycelial growth were
evaluated by measuring the growth inhibition zones formed on the
plates.
2.6. Statistics
Data are presented as means ± standard deviations. Statistical
analysis was performed by Tukey's test using Excel statistics soft-
ware 2012 (Social Survey Research Information, Tokyo, Japan).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 Real-time วิเคราะห์ RT-PCR
ยีนสังเคราะห์จาก RNA รวมใช้ PrimeScript RT
รีเอเจนชุดกับ gDNA ยางลบ (Takara) แล้วแบบ real-time RT-PCR
ได้ดำเนินการใช้พรีมิกซ์ SYBR Ex Taq ii (Takara) อย่างต่อสภาวะแวดล้อมสำหรับแบบ real-time RT-PCR มีดังนี้ 37? C เป็นเวลา 15 นาทีและ85? C เป็นเวลา 5 วินาทีสำหรับการสังเคราะห์ยีนแล้ว 40 รอบที่ 95? C เป็นเวลา 5 วินาทีและ60? C เป็นเวลา 30 วินาทีสำหรับขยาย PCR ลำดับเบสของไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีดังนี้ AtPR1 ไพรเมอร์ (5 0 - CCTGGGGTAGCGGTGACTT-3 0 5 0 -CGTGTTCGCAGCGTAGTTGT-3 0, เอ thaliana โปรตีนทำให้เกิดโรคที่เกี่ยวข้อง 1 mRNA, GenBank acces-. ไซออนไม่มี NM_127025) ไพรเมอร์ AtPDF1.2 (5 0 -TCACCCT- TATCTTCGCTGCTC-3 0 5 0 -ACCATGTCCCACTTGGCTTC-3 0, เอ thaliana โปรตีนต้านเชื้อราสมมุติ PDF1.2 mRNA, GenBank เข้า no. AY063779) และไพรเมอร์ AtACT (5 0 -GCCGACA - GAATGAGCAAAGAG-3 0 5 0 -AGGTACTGAGGGAGGCCAAGA-3 0,. ก. thaliana โปรตีน 1 mRNA ภาคยานุวัติ GenBank ไม่มี NM_179953) โปรตีนถูกนำมาใช้สำหรับการฟื้นฟู เส้นโค้งที่แยกออกจากกันได้รับการวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของการเกิดปฏิกิริยาการขยายโดยใช้ระบายความร้อนCycler ลูกเต๋าระบบแบบ Real Time เดี่ยวซอฟแวร์เวอร์ชั่น 3.00 (Takara) ระดับการแสดงออกของยีนแต่ละคนถูกกำหนดเป็นจำนวนรอบของการขยายความจำเป็นที่จะไปถึงเกณฑ์คงใช้วิธีโค้งมาตรฐานและการแสดงแล้วเป็นญาติค่า. 2.5 กิจกรรมปฏิปักษ์ของเปปไทด์ iturin อนุพันธ์แผ่นเส้นใยของเชื้อราColletotrichum gloeosporioides ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคแอนสตรอเบอร์รี่และองุ่นโรคเน่าสุกถูกวางไว้บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อเดกซ์โทรสมันฝรั่ง ในขณะเดียวกันกระดาษฆ่าเชื้อแผ่นถูกวางไว้บนจานและเชื้อแล้วกับ 50 เมตรลิตร 0.1 mg / ml iturin หรือเปปไทด์ iturin อนุพันธ์ แผ่นถูกบ่มที่25? C เป็นเวลา 5 วัน ผลกระทบที่เป็นศัตรูของ de- เปปไทด์ที่มีต่อ rivative C. gloeosporioides เจริญของเส้นใยที่ได้รับการประเมินโดยการวัดโซนยับยั้งการเจริญที่เกิดขึ้นบนแผ่น. 2.6 สถิติข้อมูลจะถูกนำเสนอเป็นหมายถึง±ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน สถิติการวิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยการทดสอบของ Tukey โดยใช้สถิติ Excel นุ่มเครื่อง2012 (การสำรวจข้อมูลการวิจัยสังคม, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . เวลา RT-PCR cDNA การวิเคราะห์
จริงสังเคราะห์จากอาร์เอ็นเอทั้งหมดใช้ primescript RT
3 ชุดกับยางลบ gdna ( ทาการะ ) แล้วทำการใช้วิธีเรียลไทม์
SYBR รวมอดีตได้ดี II ( ทาการะ ) ต่อต้าน -
ditions สำหรับเรียลไทม์ RT-PCR ดังนี้ 37
? C เป็นเวลา 15 นาทีที่ 85 และ

? C เป็นเวลา 5 วินาที การสังเคราะห์ cDNA แล้ว 40 รอบ 95 ? C เป็นเวลา 5 วินาทีและ 60

?C เป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อขยาย . ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ
ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ได้แก่ atpr1 PCR ( 5 0 -
cctggggtagcggtgactt-3 0 5 0 - cgtgttcgcagcgtagttgt-3 0
a thaliana พลาสมาโปรตีนเกี่ยวข้องกับ mRNA ขนาด 1 , acces -
ไซออนไม่ nm_127025 ) atpdf1.2 PCR ( 5 - 0 - tcaccct
tatcttcgctgctc-3 0 5 0 - accatgtcccacttggcttc-3 0
athaliana การแสดงออกของโปรตีนใน pdf1.2 , การไม่พบ
ay063779 ) และ atact PCR ( 5 - 0 - gccgaca
gaatgagcaaagag-3 0 5 0 - aggtactgagggaggccaaga-3 0
a thaliana actin mRNA ขนาด 1 , การไม่ nm_179953 ) .
actin ใช้บรรทัดฐาน . การใช้เส้นโค้งเป็น
ตรวจสอบความจำเพาะของปฏิกิริยาแบบใช้
ระบายความร้อนวงจรลูกเต๋าจริงระบบเวลาเดียวซอฟต์แวร์ ver . -
( ทาการะ ) การแสดงออกของยีนที่ระดับแต่ละถูกกำหนดเป็นจำนวนรอบ
( ต้องไปถึงการแก้ไขเกณฑ์
โดยใช้เส้นโค้งมาตรฐาน แล้วแสดงเป็นค่าสัมพัทธ์
.
2.5 กิจกรรมปฏิปักษ์ของ iturin อนุพันธ์เปป
เจริญแผ่น Colletotrichum gloeosporioides ซึ่งสาเหตุ
โรคแอนแทรคโนสสตรอเบอร์รี่และองุ่นสุกเน่า , โรค
วางไว้บนอาหาร potato dextrose agar plates ในเวลาเดียวกัน , ฆ่าเชื้อกระดาษ
แผ่นถูกวางไว้บนจาน แล้วใส่ 50 m l
0.1 mg / ml iturin หรือ iturin อนุพันธ์เปปไทด์ จานมีอุณหภูมิ 25

? C เป็นเวลา 5 วัน การต่อต้านผลของ de -
rivative C . gloeosporioides ของเปปไทด์ที่มีการเจริญเติบโต
ประเมินโดยการวัดยับยั้งการเจริญเติบโตที่เกิดขึ้นในแผ่นโซน
.
2.6 ข้อมูลสถิติ
จะ แสดง เป็น หมายความว่า ±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้สถิติ
ทดสอบทดสอบการใช้ Excel สถิตินุ่ม -
แวร์ 2012 ( ข้อมูลสำรวจสังคมโตเกียว , ญี่ปุ่น )