2.3. Preparation of P. pastoris com

2.3. Preparation of P. pastoris competent cells and transformation
YPD 100mL (1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) dextrose) medium was inoculated with a single P. pastoris colony and grown over night at 30 ◦C, 200rpm to an OD600 of 0.8–1.0. Cells were collected by centrifugation (10min, 1500× g, and 20 ◦C), washed with 50ml of sterile water and suspended in 2ml of 100mM LiCl2. The cells were washed twice with 100mM LiCl2 and distributed in 100l aliquots. To each cell aliquot was added 240L of PEG 3350 (50%), 36L of LiCl2 (1M), 25L of single stranded DNA and 50L of linearized plasmid DNA. The cells were mixed and were incubated at 30 ◦C for 30min without shaking and heat shock was given at 42 ◦C for 25min. The transformation mix was centrifuged and supernatant was discarded. The transformants were suspended in 100L of sterile water spread on SD (Synthetic Dropout) plates (1.34% Yeast Nitrogen Base with ammonium sulphate without amino acids), 4×10−5% (w/v) biotin, 2% (w/v) dextrose) and incubated at 30 ◦C for 2–4 days. The transformants were selected by their ability to synthesize and utilize histidine

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. เตรียม P. pastoris อำนาจและการเปลี่ยนแปลง
inoculated กับอาณานิคม P. pastoris เดียว และปลูกข้ามคืนที่ 30 ◦C, 200 รอบต่อนาทีให้การ OD600 0.8 – 1.0 YPD กลาง 100mL (1% (w/v) ยีสต์สกัด peptone 2% (w/v) ขึ้น 2% (w/v)) เซลล์ถูกรวบรวม โดย centrifugation (10 นาที 1500 × g และ 20 ◦C), ล้าง ด้วย 50ml ของน้ำผ่านการฆ่าเชื้อ และระงับใน 2ml 100 มม. LiCl2 เซลล์ถูกล้างสองครั้ง ด้วย 100 มม. LiCl2 และกระจายใน aliquots 100l เซลล์แต่ละส่วนลงตัวถูกเพิ่มเข้ามาตรึง 3350 (50%), 36 L ของ LiCl2 240L (1M), 25L เดียวควั่น DNA และ L 50 ของ plasmid เป็นเส้นตรงดีเอ็นเอ เซลล์ถูกผสม และ incubated ที่ 30 ◦C ใน 30 นาที โดยเขย่า และไล่ความร้อนณ 42 ◦C สำหรับ 25 นาที ผสมการแปลงถูก centrifuged และ supernatant ถูกละทิ้ง Transformants ถูกหยุดชั่วคราวใน 100 L ของน้ำผ่านการฆ่าเชื้อที่แพร่กระจายบนแผ่น SD (สังเคราะห์ถอน) (1.34% ฐานแอมโมเนียมซัลเฟตไม่มีกรดอะมิโนไนโตรเจนยีสต์), 4 × 10−5% (w/v) ไบโอติน ขึ้น 2% (w/v)) และ incubated ที่ 30 ◦C 2 – 4 วัน Transformants ถูกเลือก ด้วยความสามารถในการสังเคราะห์ และใช้ histidine

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 เตรียม P. pastoris เซลล์ที่มีความสามารถและการเปลี่ยนแปลง
YPD 100mL (1% (w / v) สารสกัดจากยีสต์, 2% (w / v) เปปโตน, 2% (w / v) เดกซ์โทรส) กลางได้รับเชื้อด้วยเดียว pastoris พีอาณานิคม และเติบโตกว่าคืนวันที่ 30 ◦C, 200RPM เพื่อ OD600 ของ 0.8-1.0 เซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยง (10 นาที, 1500 ×กรัมและ 20 ◦C) ล้างด้วย 50ml ของน้ำผ่านการฆ่าเชื้อและแขวนลอยใน 2ml ของ 100mM LiCl2 เซลล์ที่ถูกล้างสองครั้งด้วย 100mM LiCl2 และจัดจำหน่ายใน aliquots 100l แต่ละ aliquot เซลล์ถูกบันทึก 240L ของ PEG 3350 (50%), 36L ของ LiCl2 (1M) 25L เดียวที่ควั่นดีเอ็นเอและ 50L ของพลาสมิดดีเอ็นเอเส้นตรง เซลล์ถูกผสมและได้รับการบ่มที่ 30 ◦Cสำหรับ 30 นาทีโดยไม่ต้องสั่นและช็อตที่ได้รับความร้อนที่ 42 ◦Cสำหรับ 25 นาที การผสมผสานการเปลี่ยนแปลงที่ได้รับการหมุนเหวี่ยงและใสถูกทิ้ง transformants ถูกระงับใน 100L ของการแพร่กระจายน้ำผ่านการฆ่าเชื้อใน SD (ควบคุมการตกคร่อมสังเคราะห์) จาน (1.34% ฐานไนโตรเจนยีสต์ที่มีแอมโมเนียมซัลเฟตที่ไม่มีกรดอะมิโน), 4 × 10-5% (w / v) ไบโอติน, 2% (w / v ) เดกซ์โทรส) และบ่มที่อุณหภูมิ 30 ◦C 2-4 วัน transformants รับการคัดเลือกจากความสามารถในการสังเคราะห์และใช้ประโยชน์จากฮิสติดีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การเตรียมหน้า pastoris เชี่ยวชาญเซลล์และการเปลี่ยนแปลง
ypd 100ml ( 1 % ( w / v ) สารสกัดจากยีสต์ , 2% ( w / v ) extract , 2% ( w / v ) dextrose ) ซึ่งเป็นเชื้อเดียวกับหน้า pastoris อาณานิคมและเติบโตผ่านคืนที่ 30 ◦ C 200rpm เป็น od600 0.8 - 1.0 เซลล์มีจำนวนดังนี้ ( วัน 1500 ×กรัม และ 20 ◦ C ) , การล้างด้วยน้ำเพื่อฆ่าเชื้อและแขวนลอยอยู่ใน licl2 2ml ของ 100mm .2.3 การเตรียมหน้า pastoris เชี่ยวชาญเซลล์และการเปลี่ยนแปลง
ypd 100ml ( 1 % ( w / v ) สารสกัดจากยีสต์ , 2% ( w / v ) extract , 2% ( w / v ) dextrose ) ซึ่งเป็นเชื้อเดียวกับหน้า pastoris อาณานิคมและเติบโตผ่านคืนที่ 30 ◦ C 200rpm เป็น od600 0.8 - 1.0 เซลล์มีจำนวนดังนี้ ( วัน 1500 ×กรัม และ 20 ◦ C ) , การล้างด้วยน้ำเพื่อฆ่าเชื้อและแขวนลอยอยู่ใน licl2 2ml ของ 100mm .เซลล์ก็ล้างสองครั้งกับ 100mm licl2 และแจกจ่ายใน 100L เฉยๆ . แต่ละเซลล์ได้เพิ่ม 240l ส่วนลงตัวของ PEG 0 ( 50% ) , 36l ของ licl2 ( 1M ) 25l เดียวควั่นดีเอ็นเอและ 50L ของช่วงพลาสมิดดีเอ็นเอ เซลล์แบบผสมและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที◦ไม่สั่นและความร้อนช็อกได้ 42 ◦ C 25min .พลาสมิดถูกเลือกโดยพวกเขาสามารถสังเคราะห์และใช้ฮิสติดีน
การเปลี่ยนแปลงระดับสูงผสมและถูกทิ้ง พลาสมิดหยุดชั่วคราวใน 100L การแพร่กระจายน้ำหมันใน SD ( มหิดลสังเคราะห์ ) จาน ( 1.34% ยีสต์ที่มีซัลเฟตแอมโมเนียมไนโตรเจนเบสไม่มีกรดอะมิโน ) , 4 × 10 − 5 % ( w / v ) ไบโอติน , 2% ( w / v ) dextrose ) และบ่มที่อุณหภูมิ 30 ◦ C 2 – 4 วัน .