- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
These studies represent the first c
These studies represent the first clear scientific evidence of a link between เบต้า-
เคซีน A1 consumption and the symptoms of lactose intolerance, and additionally that เบต้า-
5 เคซีน A2 consumption (relative to เบต้า-เคซีน A1 consumption) induces a beneficial
predisposition to the prevention or reduction of the symptoms of lactose intolerance on
future exposure to lactose. Previously, inconclusive and conflicting anecdotal reports and
studies relating to BCM-7 (rather than เบต้า-เคซีน A1 itself) had lead to confusion among
those skilled in the art, with many believing there was no such link. Through the applicant's 10 finding, an alternative potential solution is provided to the problems that have been suffered
by many people who considered themselves to be lactose intolerant, i.e. the avoidance of เบต้า-เคซีน A1 in diet. This can be achieved by obtaining milk having a เบต้า-เคซีน content that is predominantly เบต้า-เคซีน A2 and producing products derived from that milk, and
making that milk and those products available for the purpose of reducing or preventing the 15 symptoms of lactose intolerance.
The milk of cows can be tested for the relative proportions of เบต้า-เคซีน A1 and เบต้า-เคซีน A2. Alternatively, cows can be genetically tested for their ability to produce milk containing เบต้า-เคซีน A1 or เบต้า-เคซีน A2 or a combination of both. These techniques are well-known.
20 The การประดิษฐ์ has distinct advantages over existing methods for avoiding the
symptoms of lactose intolerance. Most existing methods rely on dietary modifications, many of which often have limited or no real success. The present การประดิษฐ์ provides a solution that is comparatively easy to manage, i.e. avoidance of milk or milk products that
contain เบต้า-เคซีน A1 and ensuring that milk and milk products in the diet contain เบต้า-
25 เคซีน that is predominantly เบต้า-เคซีน A2, preferably 100% เบต้า-เคซีน A2. The
การประดิษฐ์ avoids any need for wholesale dietary mofications such as the avoidance of dairy
products or other common food products.
Any reference to prior art documents in this specification is not to be considered an admission that such prior art is widely known or forms part of the common general
30 knowledge in the field.
As used in this specification, the words "ประกอบรวมด้วย", "ซึ่งประกอบรวมด้วย", and similar words, are not to be interpreted in an exclusive or exhaustive sense. In other words, they are intended to mean "ที่รวมถึง, but not limited to".
The การประดิษฐ์ is further described with reference to the following examples. It will be 35 appreciated that the การประดิษฐ์ as claimed is not intended to be limited in any way by these
examples.
EXAMPLES
Example 1: Feeding Methodology
Seventy two weaned (four week old) male Wistar rats were used. Following a 7-day
acclimatisation period on a control diet, the rats were fed for either 12 or 60 hours with one 5 of three diets: 100% A1 diet, 100% A2 diet, control diet (n=6 per treatment). The protein
component of the diets were derived from skim milk (for the A1 and A2 diets) and on egg
white (for the non-milk protein control diet), and were balanced for energy and
macronutrient composition (see Table 1). Fifteen minutes before the end of the time
period, rats received either นาลอกโซน or saline (control) via intra-peritoneal injection, and
10 were then orally gavaged with a non-digestible tracer, titanium dioxide. Faecal and urine
samples were collected at 7 time points over the following 24 hours, and stored at -20 °C
(faecal)•or -80 °C (urine) until they were analysed.
Table 1: Composition of diets
Product Al milk diet A2 milk diet Control diet
Ingredient gm kcal gm kcal gm kcal
เคซีน 0 0 0 0 0 0
Al milk powder 475 1691 0 0 0 0
A2 milk powder 0 0 468 1687 0 0
DL-methionine 3 12 3 12 0 0
Egg whites (dried) 0 0 0 0 200 800
Corn starch 150 600 150 600 153 612
Sucrose 288 1152 294 1176 500 2000
Cellulose, BW200 50 0 50 0 50 0
Corn oil 45.2 406.8 43 387 50 450
Mineral mix S10001 35 0 35 0 35 0
Biotin, 1% 0 0 0 0 0.4 0
Vitamin mix V10001 10 40 10 40 10 40
Choline bitartrate 2 0 2 0 2 0
Total 1058.2 3902 1055 3902 1000.4 3902
15
Example 2: Gastrointestinal Transit Time
Gastrointestinal transit time (GITT) was measured in rats fed according to Example
1. Titanium dioxide (Ti02) was used as a tracer administered orally to animals following 12
hour of feeding the 100% A1 diet, the 100% A2 diet, or the control diet. The results are
20 shown in Table 2 and in รูป 1. Recovery data is represented as the % TiO2 recovery
versus time (hours). Rats fed the A1 diet showed delayed transit relative to rats fed the A2 diet, with both groups showing delay relative to rats fed the control diet.
12
Table 2: GI Transit Times
Time Control SD Al SD A2 SD
1 0.001 0.002 0.171 0.406 0.001 0.002
2 0.006 0.011 0.514 1.218 0.011 0.024
3 0.028 0.047 0.522 1.221 0.033 0.043
4 0.029 0.046 1.189 2.854 0.056 0.036
5 0.064 0.071 5.624 13.713 2.048 4.162
6 0.758 1.196 10.343 17.419 22.188 19.698
7 37.605 28.549 53.530 15.513 61.024 11.983
8 41.716 28.082 55.296 18.084 62.482 13.170
Example 3: แลคเตส Activity
Frozen powdered duodenum tissue samples were homogenised in ice-cold deionised 5 water (1:5 wt/vol), then centrifuged at 2,200g for 30 minutes at 4. The supernatant was
harvested and further diluted (1:25) with deionised water. The samples were incubated
with lactose and the liberated glucose determined using a glucose-oxidase kit (Sigma) and
measured with a microplate reader. Table 3 and รูป 2 show the results for duodenal
แลคเตส for both acute (12 hour) and chronic (60 hour) fed groups of rats. Duodenal แลคเตส
10 activity was elevated in acute fed A2 groups, relative to chronic fed A2 groups and to both
acute and chronic fed A1 groups.
Table 3: แลคเตส activity for acute and chronic fed groups
Duodenum แลคเตส
(fkatal/ug protein) Std Dev
Al 12 8.94 3.87
Al 60 7.35 2.19
Al 12 N 8.99 3.86
Al 60 N 8.42 2.59
A2 12 35.97 32.23
A2 60 8.45 1.92
A2 12 N 6.55 2.76
A2 60 N no data no data
15 Example 4: MPO Activity
Colon tissue from the rats fed according to Example 1 was quantified for
ไมอีโลเปอร์ออกซิเดส (MPO) activity based on an established method (Grisham, M.B., et al.,
Methods Enzymol., 1990, 186:729-742) Colon tissue (50 mg) was homogenised,
partitioned via centrifugation, ruptured by ultrasonic probe and subjected to a freeze-thaw 20 cycle. Endogenous MPO catalyses H202-dependent oxidation of 3,3',5,5'-tetramethyl-
benzidine substrate measured colourimetrically at 562 nm. Activity was normalised by a
13
bicinchoninic acid (BCA) (Smith, P.K., et al., Anal. Biochem., 1985, 150 (1):76-85) protein determination for the same homogenate. The results are shown in in รูป 3. Relative to A1 fed animals A2 animals demonstrated a significantly lower level of MPO activity following acute feeding. This was persistent and further increased with chronic feeding and
5 completely reversible by the oral administration of นาลอกโซน.
Example 5: Effect of BCM-7 on Uptake of ซิสเทอีน
Radiolabelled [35S]-ซิสเทอีน uptake assay was performed in Caco-2-GI epithelial cells
and neuronal cells, in the presence of BCM-7 released from เบต้า-เคซีน Al, and compared
10 against untreated controls as well as against morphine (a prototypical opioid receptor
agonist). Pre-treatment in cells was performed for different time points for 30 min, 4, 24
and 48 h as described previously (Trivedi M., et al.; Mol. Pharm., 2014). SH-SY5Y human
neuronal cells and Caco-2 Gut epithelial cells were plated in six-well plates and were
pretreated with drugs and incubated for various times prior to measuring uptake. Media
15 were aspirated and cells were washed with 600 pL of HBSS at 37 °C. Non-radioactive HBSS
was aspirated, replaced with 600 pL of 37 °C HBSS containing [35S]-ซิสเทอีน (1 pCi/1 mL),
10 pM unlabelled ซิสเทอีน and 100 pM DTT, and the cells were incubated for 5 min. The
[35S]-ซิสเทอีน/HBSS ของผสม was aspirated and treatment was terminated by two washes
with ice-cold HBSS. Cells were then lysed with 600 pL of dH2O, scraped, collected in 1.5 mL 20 microcentrifuge tubes, and sonicated for 10 s. 100 pL of each sample was aliquoted for
protein assay. 200 pL of each sample (in triplicate) was aliquoted into scintillation vials with
4 mL of scintillation fluid, vortexed, and counted for radioactivity (normalised against protein content). Additionally, the ซิสเทอีน uptake effects of morphine and BCM-7 were also characterised in the presence of D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr (CTAP), a
25 selective p-antagonist, and the delta antagonist naltrindole (NTI). The results are shown in
รูปs 4, 5 and 6. The symbol * used in these รูปs indicates a statistically significant
difference (p
เคซีน A1 consumption and the symptoms of lactose intolerance, and additionally that เบต้า-
5 เคซีน A2 consumption (relative to เบต้า-เคซีน A1 consumption) induces a beneficial
predisposition to the prevention or reduction of the symptoms of lactose intolerance on
future exposure to lactose. Previously, inconclusive and conflicting anecdotal reports and
studies relating to BCM-7 (rather than เบต้า-เคซีน A1 itself) had lead to confusion among
those skilled in the art, with many believing there was no such link. Through the applicant's 10 finding, an alternative potential solution is provided to the problems that have been suffered
by many people who considered themselves to be lactose intolerant, i.e. the avoidance of เบต้า-เคซีน A1 in diet. This can be achieved by obtaining milk having a เบต้า-เคซีน content that is predominantly เบต้า-เคซีน A2 and producing products derived from that milk, and
making that milk and those products available for the purpose of reducing or preventing the 15 symptoms of lactose intolerance.
The milk of cows can be tested for the relative proportions of เบต้า-เคซีน A1 and เบต้า-เคซีน A2. Alternatively, cows can be genetically tested for their ability to produce milk containing เบต้า-เคซีน A1 or เบต้า-เคซีน A2 or a combination of both. These techniques are well-known.
20 The การประดิษฐ์ has distinct advantages over existing methods for avoiding the
symptoms of lactose intolerance. Most existing methods rely on dietary modifications, many of which often have limited or no real success. The present การประดิษฐ์ provides a solution that is comparatively easy to manage, i.e. avoidance of milk or milk products that
contain เบต้า-เคซีน A1 and ensuring that milk and milk products in the diet contain เบต้า-
25 เคซีน that is predominantly เบต้า-เคซีน A2, preferably 100% เบต้า-เคซีน A2. The
การประดิษฐ์ avoids any need for wholesale dietary mofications such as the avoidance of dairy
products or other common food products.
Any reference to prior art documents in this specification is not to be considered an admission that such prior art is widely known or forms part of the common general
30 knowledge in the field.
As used in this specification, the words "ประกอบรวมด้วย", "ซึ่งประกอบรวมด้วย", and similar words, are not to be interpreted in an exclusive or exhaustive sense. In other words, they are intended to mean "ที่รวมถึง, but not limited to".
The การประดิษฐ์ is further described with reference to the following examples. It will be 35 appreciated that the การประดิษฐ์ as claimed is not intended to be limited in any way by these
examples.
EXAMPLES
Example 1: Feeding Methodology
Seventy two weaned (four week old) male Wistar rats were used. Following a 7-day
acclimatisation period on a control diet, the rats were fed for either 12 or 60 hours with one 5 of three diets: 100% A1 diet, 100% A2 diet, control diet (n=6 per treatment). The protein
component of the diets were derived from skim milk (for the A1 and A2 diets) and on egg
white (for the non-milk protein control diet), and were balanced for energy and
macronutrient composition (see Table 1). Fifteen minutes before the end of the time
period, rats received either นาลอกโซน or saline (control) via intra-peritoneal injection, and
10 were then orally gavaged with a non-digestible tracer, titanium dioxide. Faecal and urine
samples were collected at 7 time points over the following 24 hours, and stored at -20 °C
(faecal)•or -80 °C (urine) until they were analysed.
Table 1: Composition of diets
Product Al milk diet A2 milk diet Control diet
Ingredient gm kcal gm kcal gm kcal
เคซีน 0 0 0 0 0 0
Al milk powder 475 1691 0 0 0 0
A2 milk powder 0 0 468 1687 0 0
DL-methionine 3 12 3 12 0 0
Egg whites (dried) 0 0 0 0 200 800
Corn starch 150 600 150 600 153 612
Sucrose 288 1152 294 1176 500 2000
Cellulose, BW200 50 0 50 0 50 0
Corn oil 45.2 406.8 43 387 50 450
Mineral mix S10001 35 0 35 0 35 0
Biotin, 1% 0 0 0 0 0.4 0
Vitamin mix V10001 10 40 10 40 10 40
Choline bitartrate 2 0 2 0 2 0
Total 1058.2 3902 1055 3902 1000.4 3902
15
Example 2: Gastrointestinal Transit Time
Gastrointestinal transit time (GITT) was measured in rats fed according to Example
1. Titanium dioxide (Ti02) was used as a tracer administered orally to animals following 12
hour of feeding the 100% A1 diet, the 100% A2 diet, or the control diet. The results are
20 shown in Table 2 and in รูป 1. Recovery data is represented as the % TiO2 recovery
versus time (hours). Rats fed the A1 diet showed delayed transit relative to rats fed the A2 diet, with both groups showing delay relative to rats fed the control diet.
12
Table 2: GI Transit Times
Time Control SD Al SD A2 SD
1 0.001 0.002 0.171 0.406 0.001 0.002
2 0.006 0.011 0.514 1.218 0.011 0.024
3 0.028 0.047 0.522 1.221 0.033 0.043
4 0.029 0.046 1.189 2.854 0.056 0.036
5 0.064 0.071 5.624 13.713 2.048 4.162
6 0.758 1.196 10.343 17.419 22.188 19.698
7 37.605 28.549 53.530 15.513 61.024 11.983
8 41.716 28.082 55.296 18.084 62.482 13.170
Example 3: แลคเตส Activity
Frozen powdered duodenum tissue samples were homogenised in ice-cold deionised 5 water (1:5 wt/vol), then centrifuged at 2,200g for 30 minutes at 4. The supernatant was
harvested and further diluted (1:25) with deionised water. The samples were incubated
with lactose and the liberated glucose determined using a glucose-oxidase kit (Sigma) and
measured with a microplate reader. Table 3 and รูป 2 show the results for duodenal
แลคเตส for both acute (12 hour) and chronic (60 hour) fed groups of rats. Duodenal แลคเตส
10 activity was elevated in acute fed A2 groups, relative to chronic fed A2 groups and to both
acute and chronic fed A1 groups.
Table 3: แลคเตส activity for acute and chronic fed groups
Duodenum แลคเตส
(fkatal/ug protein) Std Dev
Al 12 8.94 3.87
Al 60 7.35 2.19
Al 12 N 8.99 3.86
Al 60 N 8.42 2.59
A2 12 35.97 32.23
A2 60 8.45 1.92
A2 12 N 6.55 2.76
A2 60 N no data no data
15 Example 4: MPO Activity
Colon tissue from the rats fed according to Example 1 was quantified for
ไมอีโลเปอร์ออกซิเดส (MPO) activity based on an established method (Grisham, M.B., et al.,
Methods Enzymol., 1990, 186:729-742) Colon tissue (50 mg) was homogenised,
partitioned via centrifugation, ruptured by ultrasonic probe and subjected to a freeze-thaw 20 cycle. Endogenous MPO catalyses H202-dependent oxidation of 3,3',5,5'-tetramethyl-
benzidine substrate measured colourimetrically at 562 nm. Activity was normalised by a
13
bicinchoninic acid (BCA) (Smith, P.K., et al., Anal. Biochem., 1985, 150 (1):76-85) protein determination for the same homogenate. The results are shown in in รูป 3. Relative to A1 fed animals A2 animals demonstrated a significantly lower level of MPO activity following acute feeding. This was persistent and further increased with chronic feeding and
5 completely reversible by the oral administration of นาลอกโซน.
Example 5: Effect of BCM-7 on Uptake of ซิสเทอีน
Radiolabelled [35S]-ซิสเทอีน uptake assay was performed in Caco-2-GI epithelial cells
and neuronal cells, in the presence of BCM-7 released from เบต้า-เคซีน Al, and compared
10 against untreated controls as well as against morphine (a prototypical opioid receptor
agonist). Pre-treatment in cells was performed for different time points for 30 min, 4, 24
and 48 h as described previously (Trivedi M., et al.; Mol. Pharm., 2014). SH-SY5Y human
neuronal cells and Caco-2 Gut epithelial cells were plated in six-well plates and were
pretreated with drugs and incubated for various times prior to measuring uptake. Media
15 were aspirated and cells were washed with 600 pL of HBSS at 37 °C. Non-radioactive HBSS
was aspirated, replaced with 600 pL of 37 °C HBSS containing [35S]-ซิสเทอีน (1 pCi/1 mL),
10 pM unlabelled ซิสเทอีน and 100 pM DTT, and the cells were incubated for 5 min. The
[35S]-ซิสเทอีน/HBSS ของผสม was aspirated and treatment was terminated by two washes
with ice-cold HBSS. Cells were then lysed with 600 pL of dH2O, scraped, collected in 1.5 mL 20 microcentrifuge tubes, and sonicated for 10 s. 100 pL of each sample was aliquoted for
protein assay. 200 pL of each sample (in triplicate) was aliquoted into scintillation vials with
4 mL of scintillation fluid, vortexed, and counted for radioactivity (normalised against protein content). Additionally, the ซิสเทอีน uptake effects of morphine and BCM-7 were also characterised in the presence of D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr (CTAP), a
25 selective p-antagonist, and the delta antagonist naltrindole (NTI). The results are shown in
รูปs 4, 5 and 6. The symbol * used in these รูปs indicates a statistically significant
difference (p
0/5000
การศึกษานี้แสดงหลักฐานทางวิทยาศาสตร์ชัดเจนครั้งแรกของการเชื่อมโยงระหว่างเบต้า- ปริมาณ A1 เคซีนและอาการของแล็กโทส และนอกจากนี้ที่เบต้า-ปริมาณ A2 เคซีน 5 (เทียบกับการใช้เบต้าเคซีน A1) ก่อให้เกิดประโยชน์ต่อการ predisposition เพื่อป้องกันหรือลดอาการทนต่อแล็กโทสใน สัมผัสในอนาคตกับแล็กโทส ก่อนหน้านี้ inconclusive และความขัดแย้งเล็ก ๆ รายงาน และ ศึกษาที่เกี่ยวข้องกับ BCM-7 (แทน A1 เบต้าเคซีนเอง) ได้นำไปสับสนระหว่าง ผู้เชี่ยวชาญในศิลปะ มีหลายเชื่อมีเชื่อมโยงดังกล่าวไม่ได้ ถึงหา 10 ของผู้สมัคร ในโซลูชันอาจสำรองไว้เพื่อให้ปัญหาที่มีได้รับความเดือดร้อนหลายคน ที่ถือตัวเองเป็น intolerant แล็กโทสเช่นหลีกเลี่ยงของ A1 เบต้าเคซีนในอาหาร นี้สามารถทำได้ โดยได้รับน้ำนมที่มีเนื้อหาเบต้าเคซีนที่เป็นเบต้า-เคซีน A2 และผลิตผลิตภัณฑ์มาจากนมที่ และทำที่นมและผลิตภัณฑ์ที่ใช้เพื่อลด หรือป้องกันอาการ 15 ของแล็กโทสThe milk of cows can be tested for the relative proportions of เบต้า-เคซีน A1 and เบต้า-เคซีน A2. Alternatively, cows can be genetically tested for their ability to produce milk containing เบต้า-เคซีน A1 or เบต้า-เคซีน A2 or a combination of both. These techniques are well-known.20 The การประดิษฐ์ has distinct advantages over existing methods for avoiding thesymptoms of lactose intolerance. Most existing methods rely on dietary modifications, many of which often have limited or no real success. The present การประดิษฐ์ provides a solution that is comparatively easy to manage, i.e. avoidance of milk or milk products thatcontain เบต้า-เคซีน A1 and ensuring that milk and milk products in the diet contain เบต้า-25 เคซีน that is predominantly เบต้า-เคซีน A2, preferably 100% เบต้า-เคซีน A2. The การประดิษฐ์ avoids any need for wholesale dietary mofications such as the avoidance of dairy products or other common food products.Any reference to prior art documents in this specification is not to be considered an admission that such prior art is widely known or forms part of the common general30 knowledge in the field.As used in this specification, the words "ประกอบรวมด้วย", "ซึ่งประกอบรวมด้วย", and similar words, are not to be interpreted in an exclusive or exhaustive sense. In other words, they are intended to mean "ที่รวมถึง, but not limited to".The การประดิษฐ์ is further described with reference to the following examples. It will be 35 appreciated that the การประดิษฐ์ as claimed is not intended to be limited in any way by these examples.EXAMPLESExample 1: Feeding MethodologySeventy two weaned (four week old) male Wistar rats were used. Following a 7-day acclimatisation period on a control diet, the rats were fed for either 12 or 60 hours with one 5 of three diets: 100% A1 diet, 100% A2 diet, control diet (n=6 per treatment). The protein component of the diets were derived from skim milk (for the A1 and A2 diets) and on egg white (for the non-milk protein control diet), and were balanced for energy and macronutrient composition (see Table 1). Fifteen minutes before the end of the time period, rats received either นาลอกโซน or saline (control) via intra-peritoneal injection, and10 were then orally gavaged with a non-digestible tracer, titanium dioxide. Faecal and urinesamples were collected at 7 time points over the following 24 hours, and stored at -20 °C(faecal)•or -80 °C (urine) until they were analysed.
Table 1: Composition of diets
Product Al milk diet A2 milk diet Control diet
Ingredient gm kcal gm kcal gm kcal
เคซีน 0 0 0 0 0 0
Al milk powder 475 1691 0 0 0 0
A2 milk powder 0 0 468 1687 0 0
DL-methionine 3 12 3 12 0 0
Egg whites (dried) 0 0 0 0 200 800
Corn starch 150 600 150 600 153 612
Sucrose 288 1152 294 1176 500 2000
Cellulose, BW200 50 0 50 0 50 0
Corn oil 45.2 406.8 43 387 50 450
Mineral mix S10001 35 0 35 0 35 0
Biotin, 1% 0 0 0 0 0.4 0
Vitamin mix V10001 10 40 10 40 10 40
Choline bitartrate 2 0 2 0 2 0
Total 1058.2 3902 1055 3902 1000.4 3902
15
Example 2: Gastrointestinal Transit Time
Gastrointestinal transit time (GITT) was measured in rats fed according to Example
1. Titanium dioxide (Ti02) was used as a tracer administered orally to animals following 12
hour of feeding the 100% A1 diet, the 100% A2 diet, or the control diet. The results are
20 shown in Table 2 and in รูป 1. Recovery data is represented as the % TiO2 recovery
versus time (hours). Rats fed the A1 diet showed delayed transit relative to rats fed the A2 diet, with both groups showing delay relative to rats fed the control diet.
12
Table 2: GI Transit Times
Time Control SD Al SD A2 SD
1 0.001 0.002 0.171 0.406 0.001 0.002
2 0.006 0.011 0.514 1.218 0.011 0.024
3 0.028 0.047 0.522 1.221 0.033 0.043
4 0.029 0.046 1.189 2.854 0.056 0.036
5 0.064 0.071 5.624 13.713 2.048 4.162
6 0.758 1.196 10.343 17.419 22.188 19.698
7 37.605 28.549 53.530 15.513 61.024 11.983
8 41.716 28.082 55.296 18.084 62.482 13.170
Example 3: แลคเตส Activity
Frozen powdered duodenum tissue samples were homogenised in ice-cold deionised 5 water (1:5 wt/vol), then centrifuged at 2,200g for 30 minutes at 4. The supernatant was
harvested and further diluted (1:25) with deionised water. The samples were incubated
with lactose and the liberated glucose determined using a glucose-oxidase kit (Sigma) and
measured with a microplate reader. Table 3 and รูป 2 show the results for duodenal
แลคเตส for both acute (12 hour) and chronic (60 hour) fed groups of rats. Duodenal แลคเตส
10 activity was elevated in acute fed A2 groups, relative to chronic fed A2 groups and to both
acute and chronic fed A1 groups.
Table 3: แลคเตส activity for acute and chronic fed groups
Duodenum แลคเตส
(fkatal/ug protein) Std Dev
Al 12 8.94 3.87
Al 60 7.35 2.19
Al 12 N 8.99 3.86
Al 60 N 8.42 2.59
A2 12 35.97 32.23
A2 60 8.45 1.92
A2 12 N 6.55 2.76
A2 60 N no data no data
15 Example 4: MPO Activity
Colon tissue from the rats fed according to Example 1 was quantified for
ไมอีโลเปอร์ออกซิเดส (MPO) activity based on an established method (Grisham, M.B., et al.,
Methods Enzymol., 1990, 186:729-742) Colon tissue (50 mg) was homogenised,
partitioned via centrifugation, ruptured by ultrasonic probe and subjected to a freeze-thaw 20 cycle. Endogenous MPO catalyses H202-dependent oxidation of 3,3',5,5'-tetramethyl-
benzidine substrate measured colourimetrically at 562 nm. Activity was normalised by a
13
bicinchoninic acid (BCA) (Smith, P.K., et al., Anal. Biochem., 1985, 150 (1):76-85) protein determination for the same homogenate. The results are shown in in รูป 3. Relative to A1 fed animals A2 animals demonstrated a significantly lower level of MPO activity following acute feeding. This was persistent and further increased with chronic feeding and
5 completely reversible by the oral administration of นาลอกโซน.
Example 5: Effect of BCM-7 on Uptake of ซิสเทอีน
Radiolabelled [35S]-ซิสเทอีน uptake assay was performed in Caco-2-GI epithelial cells
and neuronal cells, in the presence of BCM-7 released from เบต้า-เคซีน Al, and compared
10 against untreated controls as well as against morphine (a prototypical opioid receptor
agonist). Pre-treatment in cells was performed for different time points for 30 min, 4, 24
and 48 h as described previously (Trivedi M., et al.; Mol. Pharm., 2014). SH-SY5Y human
neuronal cells and Caco-2 Gut epithelial cells were plated in six-well plates and were
pretreated with drugs and incubated for various times prior to measuring uptake. Media
15 were aspirated and cells were washed with 600 pL of HBSS at 37 °C. Non-radioactive HBSS
was aspirated, replaced with 600 pL of 37 °C HBSS containing [35S]-ซิสเทอีน (1 pCi/1 mL),
10 pM unlabelled ซิสเทอีน and 100 pM DTT, and the cells were incubated for 5 min. The
[35S]-ซิสเทอีน/HBSS ของผสม was aspirated and treatment was terminated by two washes
with ice-cold HBSS. Cells were then lysed with 600 pL of dH2O, scraped, collected in 1.5 mL 20 microcentrifuge tubes, and sonicated for 10 s. 100 pL of each sample was aliquoted for
protein assay. 200 pL of each sample (in triplicate) was aliquoted into scintillation vials with
4 mL of scintillation fluid, vortexed, and counted for radioactivity (normalised against protein content). Additionally, the ซิสเทอีน uptake effects of morphine and BCM-7 were also characterised in the presence of D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr (CTAP), a
25 selective p-antagonist, and the delta antagonist naltrindole (NTI). The results are shown in
รูปs 4, 5 and 6. The symbol * used in these รูปs indicates a statistically significant
difference (p<0.05) compared against the untreated control, and the symbol # indicates a
statistically significant difference (p<0.005) compared against the untreated control.
30 Example 6: Effect of BCM-7 on GSH and SAM Levels
This example investigated whether decreases in ซิสเทอีน uptake as observed in
Example 5 could translate into GSH changes and affect antioxidant levels. The intracellular
levels of GSH were measured with BCM-7 as well as with morphine for different times (30
min, 4h, 24h) using HPLC and an electrochemical gradient detection method (Hodgson et
35 al., J. Alzh, Dis. 2013, Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014). SH-SY5
Table 1: Composition of diets
Product Al milk diet A2 milk diet Control diet
Ingredient gm kcal gm kcal gm kcal
เคซีน 0 0 0 0 0 0
Al milk powder 475 1691 0 0 0 0
A2 milk powder 0 0 468 1687 0 0
DL-methionine 3 12 3 12 0 0
Egg whites (dried) 0 0 0 0 200 800
Corn starch 150 600 150 600 153 612
Sucrose 288 1152 294 1176 500 2000
Cellulose, BW200 50 0 50 0 50 0
Corn oil 45.2 406.8 43 387 50 450
Mineral mix S10001 35 0 35 0 35 0
Biotin, 1% 0 0 0 0 0.4 0
Vitamin mix V10001 10 40 10 40 10 40
Choline bitartrate 2 0 2 0 2 0
Total 1058.2 3902 1055 3902 1000.4 3902
15
Example 2: Gastrointestinal Transit Time
Gastrointestinal transit time (GITT) was measured in rats fed according to Example
1. Titanium dioxide (Ti02) was used as a tracer administered orally to animals following 12
hour of feeding the 100% A1 diet, the 100% A2 diet, or the control diet. The results are
20 shown in Table 2 and in รูป 1. Recovery data is represented as the % TiO2 recovery
versus time (hours). Rats fed the A1 diet showed delayed transit relative to rats fed the A2 diet, with both groups showing delay relative to rats fed the control diet.
12
Table 2: GI Transit Times
Time Control SD Al SD A2 SD
1 0.001 0.002 0.171 0.406 0.001 0.002
2 0.006 0.011 0.514 1.218 0.011 0.024
3 0.028 0.047 0.522 1.221 0.033 0.043
4 0.029 0.046 1.189 2.854 0.056 0.036
5 0.064 0.071 5.624 13.713 2.048 4.162
6 0.758 1.196 10.343 17.419 22.188 19.698
7 37.605 28.549 53.530 15.513 61.024 11.983
8 41.716 28.082 55.296 18.084 62.482 13.170
Example 3: แลคเตส Activity
Frozen powdered duodenum tissue samples were homogenised in ice-cold deionised 5 water (1:5 wt/vol), then centrifuged at 2,200g for 30 minutes at 4. The supernatant was
harvested and further diluted (1:25) with deionised water. The samples were incubated
with lactose and the liberated glucose determined using a glucose-oxidase kit (Sigma) and
measured with a microplate reader. Table 3 and รูป 2 show the results for duodenal
แลคเตส for both acute (12 hour) and chronic (60 hour) fed groups of rats. Duodenal แลคเตส
10 activity was elevated in acute fed A2 groups, relative to chronic fed A2 groups and to both
acute and chronic fed A1 groups.
Table 3: แลคเตส activity for acute and chronic fed groups
Duodenum แลคเตส
(fkatal/ug protein) Std Dev
Al 12 8.94 3.87
Al 60 7.35 2.19
Al 12 N 8.99 3.86
Al 60 N 8.42 2.59
A2 12 35.97 32.23
A2 60 8.45 1.92
A2 12 N 6.55 2.76
A2 60 N no data no data
15 Example 4: MPO Activity
Colon tissue from the rats fed according to Example 1 was quantified for
ไมอีโลเปอร์ออกซิเดส (MPO) activity based on an established method (Grisham, M.B., et al.,
Methods Enzymol., 1990, 186:729-742) Colon tissue (50 mg) was homogenised,
partitioned via centrifugation, ruptured by ultrasonic probe and subjected to a freeze-thaw 20 cycle. Endogenous MPO catalyses H202-dependent oxidation of 3,3',5,5'-tetramethyl-
benzidine substrate measured colourimetrically at 562 nm. Activity was normalised by a
13
bicinchoninic acid (BCA) (Smith, P.K., et al., Anal. Biochem., 1985, 150 (1):76-85) protein determination for the same homogenate. The results are shown in in รูป 3. Relative to A1 fed animals A2 animals demonstrated a significantly lower level of MPO activity following acute feeding. This was persistent and further increased with chronic feeding and
5 completely reversible by the oral administration of นาลอกโซน.
Example 5: Effect of BCM-7 on Uptake of ซิสเทอีน
Radiolabelled [35S]-ซิสเทอีน uptake assay was performed in Caco-2-GI epithelial cells
and neuronal cells, in the presence of BCM-7 released from เบต้า-เคซีน Al, and compared
10 against untreated controls as well as against morphine (a prototypical opioid receptor
agonist). Pre-treatment in cells was performed for different time points for 30 min, 4, 24
and 48 h as described previously (Trivedi M., et al.; Mol. Pharm., 2014). SH-SY5Y human
neuronal cells and Caco-2 Gut epithelial cells were plated in six-well plates and were
pretreated with drugs and incubated for various times prior to measuring uptake. Media
15 were aspirated and cells were washed with 600 pL of HBSS at 37 °C. Non-radioactive HBSS
was aspirated, replaced with 600 pL of 37 °C HBSS containing [35S]-ซิสเทอีน (1 pCi/1 mL),
10 pM unlabelled ซิสเทอีน and 100 pM DTT, and the cells were incubated for 5 min. The
[35S]-ซิสเทอีน/HBSS ของผสม was aspirated and treatment was terminated by two washes
with ice-cold HBSS. Cells were then lysed with 600 pL of dH2O, scraped, collected in 1.5 mL 20 microcentrifuge tubes, and sonicated for 10 s. 100 pL of each sample was aliquoted for
protein assay. 200 pL of each sample (in triplicate) was aliquoted into scintillation vials with
4 mL of scintillation fluid, vortexed, and counted for radioactivity (normalised against protein content). Additionally, the ซิสเทอีน uptake effects of morphine and BCM-7 were also characterised in the presence of D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr (CTAP), a
25 selective p-antagonist, and the delta antagonist naltrindole (NTI). The results are shown in
รูปs 4, 5 and 6. The symbol * used in these รูปs indicates a statistically significant
difference (p<0.05) compared against the untreated control, and the symbol # indicates a
statistically significant difference (p<0.005) compared against the untreated control.
30 Example 6: Effect of BCM-7 on GSH and SAM Levels
This example investigated whether decreases in ซิสเทอีน uptake as observed in
Example 5 could translate into GSH changes and affect antioxidant levels. The intracellular
levels of GSH were measured with BCM-7 as well as with morphine for different times (30
min, 4h, 24h) using HPLC and an electrochemical gradient detection method (Hodgson et
35 al., J. Alzh, Dis. 2013, Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014). SH-SY5
การแปล กรุณารอสักครู่..
การศึกษาเหล่านี้เป็นตัวแทนของหลักฐานทางวิทยาศาสตร์ครั้งแรกที่ชัดเจนของการเชื่อมโยงระหว่างเบต้า -
การเคซีนบริโภคA1 และอาการของการแพ้แลคโตสและนอกจากนี้ที่เบต้า -
5 เคซีนบริโภค A2 (เทียบกับเบต้า - เคซีนบริโภค A1)
ก่อให้เกิดประโยชน์จูงใจที่จะ
การป้องกันหรือลดอาการของการแพ้แลคโตสในการเปิดรับในอนาคตที่จะแลคโตส ก่อนหน้านี้รายงานประวัติค้างคาและความขัดแย้งและการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับ BCM-7 (มากกว่าเบต้า - เคซีน A1 เอง) ได้นำไปสู่ความสับสนในหมู่ผู้ที่มีฝีมือในงานศิลปะที่มีจำนวนมากเชื่อว่าไม่มีการเชื่อมโยงดังกล่าว ผ่านการสมัคร 10 การค้นพบ, วิธีการแก้ปัญหาที่อาจเกิดขึ้นอีกทางเลือกหนึ่งให้กับปัญหาที่ได้รับความเดือดร้อนโดยคนจำนวนมากที่คิดว่าตัวเองจะแพ้แลคโตเช่นหลีกเลี่ยงการเบต้า- การเคซีน A1 ในอาหาร นี้สามารถทำได้โดยได้รับนมที่มีเบต้า - เคซีนเนื้อหาที่เด่นเบต้า - เคซีน A2 และการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ได้จากนมนั้นและการที่นมและผลิตภัณฑ์ที่มีอยู่เพื่อวัตถุประสงค์ในการลดหรือป้องกันไม่ให้15 อาการของแลคโตส . การแพ้นมของวัวที่สามารถผ่านการทดสอบสำหรับสัดส่วนญาติของเบต้า- เคซีน A1 และเบต้า - เคซีน A2 อีกวิธีหนึ่งคือวัวสามารถผ่านการทดสอบทางพันธุกรรมสำหรับความสามารถในการผลิตนมที่มีเบต้า - เคซีน A1 หรือเบต้า - เคซีน A2 หรือการรวมกันของทั้งสอง เทคนิคเหล่านี้เป็นที่รู้จักกัน. 20 การประดิษฐ์มีข้อดีที่แตกต่างกว่าวิธีการที่มีอยู่สำหรับการหลีกเลี่ยงอาการแพ้แลคโต วิธีการที่มีอยู่ส่วนใหญ่พึ่งพาการปรับเปลี่ยนการบริโภคอาหารจำนวนมากที่มักจะมีการ จำกัด หรือไม่มีความสำเร็จที่แท้จริง ปัจจุบันการประดิษฐ์ให้บริการโซลูชั่นที่มีความได้เปรียบโดยเปรียบเทียบในการจัดการที่ง่ายคือการหลีกเลี่ยงผลิตภัณฑ์นมหรือนมที่มีเบต้า - เคซีน A1 และมั่นใจว่านมและผลิตภัณฑ์นมในอาหารที่มีเบต้า - 25 เคซีนที่เป็นส่วนใหญ่เบต้า - เค A2 ซีนเด่นกว่า 100% เบต้า - เคซีน A2 การประดิษฐ์หลีกเลี่ยงความจำเป็นในการ mofications อาหารขายส่งใด ๆ เช่นการหลีกเลี่ยงนมสินค้าหรือผลิตภัณฑ์อื่นๆ ของอาหารที่พบบ่อย. การอ้างอิงใด ๆ ในเอกสารศิลปะก่อนในข้อกำหนดนี้ไม่ได้ที่จะได้รับการพิจารณาเข้ารับการรักษาที่ศิลปะก่อนดังกล่าวเป็นที่รู้จักกันอย่างกว้างขวางหรือเป็นส่วนหนึ่งของ ทั่วไปที่พบบ่อย30 ความรู้ในสาขา. ในฐานะที่ใช้ในข้อกำหนดนี้คำว่า "ประกอบรวมด้วย", "ซึ่งประกอบรวมด้วย" และคำที่คล้ายกันจะไม่ได้ที่จะถูกตีความในความรู้สึกที่พิเศษหรือหมดจด ในคำอื่น ๆ ที่พวกเขามีความตั้งใจที่จะหมายความว่า "ที่รวมถึง แต่ไม่ จำกัด เฉพาะ". การประดิษฐ์จะอธิบายต่อไปมีการอ้างอิงถึงตัวอย่างต่อไปนี้ มันจะเป็น 35 ชื่นชมว่าการประดิษฐ์อ้างว่าไม่ได้มีวัตถุประสงค์ที่จะถูก จำกัด ในทางใด ๆ เหล่านี้ตัวอย่าง. ตัวอย่างตัวอย่างที่ 1: วิธีการให้อาหารเจ็ดสิบสองหย่านม(สี่สัปดาห์เก่า) หนูวิสตาร์ชายถูกนำมาใช้ หลังจาก 7 วันระยะเวลาที่เคยชินกับสภาพในอาหารควบคุมหนูได้รับการเลี้ยงดูทั้ง12 หรือ 60 ชั่วโมงกับ 5 ในสามของอาหาร: อาหาร 100% A1, A2 อาหาร 100% อาหารควบคุม (n = 6 ต่อการรักษา) โปรตีนเป็นส่วนประกอบของอาหารที่ได้มาจากหางนม (สำหรับ A1 A2 และอาหาร) และไข่สีขาว(สำหรับไม่ใช่นมอาหารควบคุมโปรตีน) และมีความสมดุลพลังงานและองค์ประกอบธาตุอาหารหลัก(ดูตารางที่ 1) สิบห้านาทีก่อนที่จะสิ้นสุดของเวลาระยะเวลาที่หนูได้รับทั้งนาลอกโซนหรือน้ำเกลือ (ควบคุม) ผ่านการฉีดภายในช่องท้องและ 10 จากนั้นก็ gavaged ปากเปล่ากับรอยที่ไม่ย่อยไทเทเนียมไดออกไซด์ อุจจาระและปัสสาวะตัวอย่างที่ถูกเก็บ 7 คะแนนในช่วงเวลาดังต่อไปนี้ 24 ชั่วโมงและเก็บไว้ที่ -20 ° C (อุจจาระ) •หรือ -80 ° C (ปัสสาวะ) จนกว่าพวกเขาจะถูกนำมาวิเคราะห์. ตารางที่ 1: องค์ประกอบของอาหารอาหารนมอัลสินค้าอาหารนม A2 อาหารควบคุมส่วนผสมกรัมกิโลแคลอรีกรัมกิโลแคลอรีกรัมกิโลแคลอรีเคซีน0 0 0 0 0 0 อัลนมผง 475 1691 0 0 0 0 A2 นมผง 0 0 468 1687 0 0 DL-methionine 3 12 3 12 0 0 ไข่ขาว ( แห้ง) 0 0 0 0 200 800 แป้งข้าวโพด 150 600 150 600 153 612 ซูโครส 288 1,152 294 1,176 500 2,000 เซลลูโลส BW200 50 0 50 0 50 0 น้ำมันข้าวโพด 45.2 406.8 43 387 50 450 ผสมแร่ S10001 35 0 35 0 35 0 ไบโอติน , 1% 0 0 0 0 0.4 0 วิตามินผสม V10001 10 40 10 40 10 40 โคลีน bitartrate 2 0 2 0 2 0 รวม 1,058.2 3902 1055 3902 1000.4 3902 15 ตัวอย่างที่ 2: ระบบทางเดินอาหารเวลาการขนส่งระบบทางเดินอาหารเวลาการขนส่ง(GITT) วัดในหนู เลี้ยงตามตัวอย่าง1 ไทเทเนียมไดออกไซด์ (Ti02) ถูกใช้เป็นติดตามผู้รับประทานสัตว์ต่อไปนี้ 12 ชั่วโมงของการให้อาหารอาหาร A1 100% อาหาร A2 100% หรือควบคุมอาหาร ผลที่จะได้20 แสดงในตารางที่ 2 และรูป 1. การกู้คืนข้อมูลที่จะแสดงเป็นการฟื้นตัวของ TiO2% เมื่อเทียบกับเวลา (ชั่วโมง) หนูที่เลี้ยงด้วยอาหาร A1 พบความล่าช้าญาติขนส่งหนูที่เลี้ยงด้วยอาหาร A2 มีทั้งกลุ่มที่แสดงให้เห็นญาติล่าช้าในหนูที่เลี้ยงด้วยอาหารที่ควบคุม. 12 ตารางที่ 2: GI ขนส่งไทม์ควบคุมเวลาSD อั SD A2 SD 1 0.001 0.002 0.171 0.406 0.001 0.002 2 0.006 0.011 0.514 1.218 0.011 0.024 3 0.028 0.047 0.522 1.221 0.033 0.043 4 0.029 0.046 1.189 2.854 0.056 0.036 5 0.064 0.071 5.624 13.713 2.048 4.162 6 0.758 1.196 10.343 17.419 22.188 19.698 7 37.605 28.549 53.530 15.513 61.024 11.983 8 41.716 28.082 55.296 18.084 62.482 13.170 ตัวอย่าง 3: แลคเตสกิจกรรมแช่แข็งผงตัวอย่างเนื้อเยื่อต้นถูกhomogenised ในเย็น deionised 5 น้ำ (1: 5 น้ำหนัก / ปริมาตร) ปั่นแล้ว 2,200g 30 นาทีที่ 4. ใสได้รับการเก็บเกี่ยวและการปรับลดต่อไป(1 : 25) ด้วยน้ำ deionised กลุ่มตัวอย่างที่ถูกบ่มที่มีแลคโตสและกลูโคสปลดปล่อยกำหนดโดยใช้ชุดกลูโคส oxidase (ซิกม่า) และวัดที่มีผู้อ่านmicroplate ตารางที่ 3 และรูปที่ 2 แสดงผลสำหรับลำไส้แลคเตสสำหรับทั้งแบบเฉียบพลัน(12 ชั่วโมง) และเรื้อรัง (60 ชั่วโมง) กลุ่มที่เลี้ยงของหนู ลำไส้แลคเตส10 กิจกรรมสูงขึ้นในกลุ่มเฉียบพลันอาหาร A2 เมื่อเทียบกับกลุ่มเรื้อรังเลี้ยง A2 และทั้งเฉียบพลันและกลุ่มเรื้อรังเลี้ยงA1. ตารางที่ 3: แลคเตสกิจกรรมสำหรับกลุ่มอาหารเฉียบพลันและเรื้อรังduodenum แลคเตส(fkatal / ไมโครกรัมโปรตีน) Std Dev อัล 12 8.94 3.87 อัล 60 7.35 2.19 อัล 12 ยังไม่มี 8.99 3.86 อัล 60 ยังไม่มี 8.42 2.59 A2 12 35.97 32.23 A2 60 8.45 1.92 A2 12 ไม่มี 6.55 2.76 A2 60 ไม่มีไม่มีข้อมูลไม่มีข้อมูล15 ตัวอย่างที่ 4: MPO กิจกรรมเนื้อเยื่อลำไส้ใหญ่จากหนูที่เลี้ยงตามตัวอย่างที่1 ได้รับการวัดสำหรับไมอีโลเปอร์ออกซิเดส(เอ็มพี) กิจกรรมขึ้นอยู่กับวิธีการที่จัดตั้งขึ้น (Grisham, MB, et al. วิธี Enzymol 1990, 186. 729 -742) เนื้อเยื่อลำไส้ใหญ่ (50 มก.) เป็น homogenised, แบ่งพาร์ติชันผ่านการหมุนเหวี่ยงการฉีกขาดจากการสอบสวนอัลตราโซนิกและภายใต้การแช่แข็งละลาย 20 รอบ ภายนอก MPO catalyses ออกซิเดชั่ H202 ขึ้นอยู่กับ 3,3 '5,5'-tetramethyl- พื้นผิว benzidine วัด colourimetrically ที่ 562 นาโนเมตร กิจกรรมได้ปกติโดย13 กรด bicinchoninic (BCA) (สมิ ธ PK, et al, Anal Biochem 1985, 150 (1):... 76-85) ความมุ่งมั่นโปรตีนสำหรับ homogenate เดียวกัน ผลที่จะได้แสดงในรูปใน 3 เมื่อเทียบกับสัตว์เลี้ยง A1 A2 สัตว์แสดงให้เห็นถึงการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับของกิจกรรมดังต่อไปนี้การให้อาหารเอ็มพีเฉียบพลัน นี่เป็นถาวรและเพิ่มขึ้นต่อไปด้วยการให้อาหารเรื้อรังและ5 ย้อนกลับได้อย่างสมบูรณ์โดยการบริหารช่องปากของนาลอกโซน. ตัวอย่างที่ 5: ผลของ BCM-7 ในการดูดซึมของซิสเทอีนRadiolabelled [35S] - ซิสเทอีนการทดสอบการดูดซึม ได้รับการดำเนินการใน Caco-2-GI เซลล์เยื่อบุผิวและเซลล์ประสาทในการปรากฏตัวของBCM-7 ปล่อยตัวออกมาจากเบต้า - เคซีนอัลและเมื่อเทียบกับ10 กับการควบคุมการได้รับการรักษาเช่นเดียวกับมอร์ฟีน (ตัวรับ opioid แม่บทตัวเอก) รักษาก่อนในเซลล์ได้รับการดำเนินการสำหรับจุดเวลาที่แตกต่างกันเป็นเวลา 30 นาที, 4, 24 และ 48 ชั่วโมงตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Trivedi เมตร, et al .; Mol. Pharm. 2014) SH-SY5Y มนุษย์เซลล์ประสาทและCaco-2 ไส้เซลล์เยื่อบุผิวถูกชุบในแผ่นหกอย่างดีและได้รับการปรับสภาพกับยาเสพติดและบ่มเป็นเวลาหลายๆ ครั้งก่อนที่จะมีการวัดการดูดซึม สื่อ15 ถูกสำลักและเซลล์ถูกล้างด้วย 600 PL ของ HBSS ที่ 37 ° C HBSS ไม่มีกัมมันตภาพรังสีถูกสำลักแทนที่600 PL 37 ° C HBSS มี [35S] - ซิสเทอีน (1 pCi / 1 มิลลิลิตร), 10:00 ป้ายกำกับซิสเทอีนและ 100 น DTT และเซลล์ ถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาที [35S] - ซิสเทอีน / HBSS ของผสมได้รับการสำลักและการรักษาที่ถูกยกเลิกสองล้างด้วยน้ำแข็งเย็นHBSS เซลล์ที่ถูก lysed แล้วกับ 600 PL ของ dH2O, คัดลอกมาเก็บใน 1.5 ml 20 หลอดไมโครและ sonicated เวลา 10 วินาที 100 PL ของกลุ่มตัวอย่างแต่ละคนถูก aliquoted สำหรับการทดสอบโปรตีน 200 PL ของแต่ละตัวอย่าง (ในเพิ่มขึ้นสามเท่า) ถูก aliquoted ลงในขวดประกายกับ4 มิลลิลิตรของของเหลวประกาย, การ vortex และนับกัมมันตภาพรังสี (ปกติกับโปรตีน) นอกจากนี้ซิสเทอีนผลกระทบการดูดซึมของมอร์ฟีนและ BCM-7 ก็ยังโดดเด่นในการปรากฏตัวของ D-เพ-Cys-เทอร์-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr (CTAP) ซึ่งเป็น25 พีเลือก -antagonist และศัตรูเดลต้า naltrindole (NTI) ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปของ 4, 5 และ 6 สัญลักษณ์ * ใช้ในรูปของเหล่านี้บ่งชี้ว่ามีนัยสำคัญทางสถิติที่แตกต่างกัน(p <0.05) เมื่อเทียบกับการควบคุมได้รับการรักษาและสัญลักษณ์ # บ่งชี้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p <0.005 ) เมื่อเทียบกับการควบคุมการรับการรักษา. 30 ตัวอย่างที่ 6: ผลของ BCM-7 ใน GSH และ SAM ระดับตัวอย่างนี้ตรวจสอบว่าการลดลงของซิสเทอีนดูดซึมเป็นข้อสังเกตในตัวอย่างที่5 อาจจะแปลเป็น GSH การเปลี่ยนแปลงและมีผลต่อระดับสารต้านอนุมูลอิสระ ภายในเซลล์ระดับของ GSH ถูกวัดกับ BCM-7 เช่นเดียวกับมอร์ฟีนสำหรับเวลาที่แตกต่างกัน (30 นาที, 4h, 24 ชั่วโมง) โดยใช้วิธี HPLC และวิธีการตรวจสอบการไล่ระดับสีไฟฟ้าเคมี (ฮอดจ์สันและ35 al., เจ Alzh, Dis. 2013 Trivedi M. , et al., Mol. Pharm. 2014) SH-SY5
การเคซีนบริโภคA1 และอาการของการแพ้แลคโตสและนอกจากนี้ที่เบต้า -
5 เคซีนบริโภค A2 (เทียบกับเบต้า - เคซีนบริโภค A1)
ก่อให้เกิดประโยชน์จูงใจที่จะ
การป้องกันหรือลดอาการของการแพ้แลคโตสในการเปิดรับในอนาคตที่จะแลคโตส ก่อนหน้านี้รายงานประวัติค้างคาและความขัดแย้งและการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับ BCM-7 (มากกว่าเบต้า - เคซีน A1 เอง) ได้นำไปสู่ความสับสนในหมู่ผู้ที่มีฝีมือในงานศิลปะที่มีจำนวนมากเชื่อว่าไม่มีการเชื่อมโยงดังกล่าว ผ่านการสมัคร 10 การค้นพบ, วิธีการแก้ปัญหาที่อาจเกิดขึ้นอีกทางเลือกหนึ่งให้กับปัญหาที่ได้รับความเดือดร้อนโดยคนจำนวนมากที่คิดว่าตัวเองจะแพ้แลคโตเช่นหลีกเลี่ยงการเบต้า- การเคซีน A1 ในอาหาร นี้สามารถทำได้โดยได้รับนมที่มีเบต้า - เคซีนเนื้อหาที่เด่นเบต้า - เคซีน A2 และการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ได้จากนมนั้นและการที่นมและผลิตภัณฑ์ที่มีอยู่เพื่อวัตถุประสงค์ในการลดหรือป้องกันไม่ให้15 อาการของแลคโตส . การแพ้นมของวัวที่สามารถผ่านการทดสอบสำหรับสัดส่วนญาติของเบต้า- เคซีน A1 และเบต้า - เคซีน A2 อีกวิธีหนึ่งคือวัวสามารถผ่านการทดสอบทางพันธุกรรมสำหรับความสามารถในการผลิตนมที่มีเบต้า - เคซีน A1 หรือเบต้า - เคซีน A2 หรือการรวมกันของทั้งสอง เทคนิคเหล่านี้เป็นที่รู้จักกัน. 20 การประดิษฐ์มีข้อดีที่แตกต่างกว่าวิธีการที่มีอยู่สำหรับการหลีกเลี่ยงอาการแพ้แลคโต วิธีการที่มีอยู่ส่วนใหญ่พึ่งพาการปรับเปลี่ยนการบริโภคอาหารจำนวนมากที่มักจะมีการ จำกัด หรือไม่มีความสำเร็จที่แท้จริง ปัจจุบันการประดิษฐ์ให้บริการโซลูชั่นที่มีความได้เปรียบโดยเปรียบเทียบในการจัดการที่ง่ายคือการหลีกเลี่ยงผลิตภัณฑ์นมหรือนมที่มีเบต้า - เคซีน A1 และมั่นใจว่านมและผลิตภัณฑ์นมในอาหารที่มีเบต้า - 25 เคซีนที่เป็นส่วนใหญ่เบต้า - เค A2 ซีนเด่นกว่า 100% เบต้า - เคซีน A2 การประดิษฐ์หลีกเลี่ยงความจำเป็นในการ mofications อาหารขายส่งใด ๆ เช่นการหลีกเลี่ยงนมสินค้าหรือผลิตภัณฑ์อื่นๆ ของอาหารที่พบบ่อย. การอ้างอิงใด ๆ ในเอกสารศิลปะก่อนในข้อกำหนดนี้ไม่ได้ที่จะได้รับการพิจารณาเข้ารับการรักษาที่ศิลปะก่อนดังกล่าวเป็นที่รู้จักกันอย่างกว้างขวางหรือเป็นส่วนหนึ่งของ ทั่วไปที่พบบ่อย30 ความรู้ในสาขา. ในฐานะที่ใช้ในข้อกำหนดนี้คำว่า "ประกอบรวมด้วย", "ซึ่งประกอบรวมด้วย" และคำที่คล้ายกันจะไม่ได้ที่จะถูกตีความในความรู้สึกที่พิเศษหรือหมดจด ในคำอื่น ๆ ที่พวกเขามีความตั้งใจที่จะหมายความว่า "ที่รวมถึง แต่ไม่ จำกัด เฉพาะ". การประดิษฐ์จะอธิบายต่อไปมีการอ้างอิงถึงตัวอย่างต่อไปนี้ มันจะเป็น 35 ชื่นชมว่าการประดิษฐ์อ้างว่าไม่ได้มีวัตถุประสงค์ที่จะถูก จำกัด ในทางใด ๆ เหล่านี้ตัวอย่าง. ตัวอย่างตัวอย่างที่ 1: วิธีการให้อาหารเจ็ดสิบสองหย่านม(สี่สัปดาห์เก่า) หนูวิสตาร์ชายถูกนำมาใช้ หลังจาก 7 วันระยะเวลาที่เคยชินกับสภาพในอาหารควบคุมหนูได้รับการเลี้ยงดูทั้ง12 หรือ 60 ชั่วโมงกับ 5 ในสามของอาหาร: อาหาร 100% A1, A2 อาหาร 100% อาหารควบคุม (n = 6 ต่อการรักษา) โปรตีนเป็นส่วนประกอบของอาหารที่ได้มาจากหางนม (สำหรับ A1 A2 และอาหาร) และไข่สีขาว(สำหรับไม่ใช่นมอาหารควบคุมโปรตีน) และมีความสมดุลพลังงานและองค์ประกอบธาตุอาหารหลัก(ดูตารางที่ 1) สิบห้านาทีก่อนที่จะสิ้นสุดของเวลาระยะเวลาที่หนูได้รับทั้งนาลอกโซนหรือน้ำเกลือ (ควบคุม) ผ่านการฉีดภายในช่องท้องและ 10 จากนั้นก็ gavaged ปากเปล่ากับรอยที่ไม่ย่อยไทเทเนียมไดออกไซด์ อุจจาระและปัสสาวะตัวอย่างที่ถูกเก็บ 7 คะแนนในช่วงเวลาดังต่อไปนี้ 24 ชั่วโมงและเก็บไว้ที่ -20 ° C (อุจจาระ) •หรือ -80 ° C (ปัสสาวะ) จนกว่าพวกเขาจะถูกนำมาวิเคราะห์. ตารางที่ 1: องค์ประกอบของอาหารอาหารนมอัลสินค้าอาหารนม A2 อาหารควบคุมส่วนผสมกรัมกิโลแคลอรีกรัมกิโลแคลอรีกรัมกิโลแคลอรีเคซีน0 0 0 0 0 0 อัลนมผง 475 1691 0 0 0 0 A2 นมผง 0 0 468 1687 0 0 DL-methionine 3 12 3 12 0 0 ไข่ขาว ( แห้ง) 0 0 0 0 200 800 แป้งข้าวโพด 150 600 150 600 153 612 ซูโครส 288 1,152 294 1,176 500 2,000 เซลลูโลส BW200 50 0 50 0 50 0 น้ำมันข้าวโพด 45.2 406.8 43 387 50 450 ผสมแร่ S10001 35 0 35 0 35 0 ไบโอติน , 1% 0 0 0 0 0.4 0 วิตามินผสม V10001 10 40 10 40 10 40 โคลีน bitartrate 2 0 2 0 2 0 รวม 1,058.2 3902 1055 3902 1000.4 3902 15 ตัวอย่างที่ 2: ระบบทางเดินอาหารเวลาการขนส่งระบบทางเดินอาหารเวลาการขนส่ง(GITT) วัดในหนู เลี้ยงตามตัวอย่าง1 ไทเทเนียมไดออกไซด์ (Ti02) ถูกใช้เป็นติดตามผู้รับประทานสัตว์ต่อไปนี้ 12 ชั่วโมงของการให้อาหารอาหาร A1 100% อาหาร A2 100% หรือควบคุมอาหาร ผลที่จะได้20 แสดงในตารางที่ 2 และรูป 1. การกู้คืนข้อมูลที่จะแสดงเป็นการฟื้นตัวของ TiO2% เมื่อเทียบกับเวลา (ชั่วโมง) หนูที่เลี้ยงด้วยอาหาร A1 พบความล่าช้าญาติขนส่งหนูที่เลี้ยงด้วยอาหาร A2 มีทั้งกลุ่มที่แสดงให้เห็นญาติล่าช้าในหนูที่เลี้ยงด้วยอาหารที่ควบคุม. 12 ตารางที่ 2: GI ขนส่งไทม์ควบคุมเวลาSD อั SD A2 SD 1 0.001 0.002 0.171 0.406 0.001 0.002 2 0.006 0.011 0.514 1.218 0.011 0.024 3 0.028 0.047 0.522 1.221 0.033 0.043 4 0.029 0.046 1.189 2.854 0.056 0.036 5 0.064 0.071 5.624 13.713 2.048 4.162 6 0.758 1.196 10.343 17.419 22.188 19.698 7 37.605 28.549 53.530 15.513 61.024 11.983 8 41.716 28.082 55.296 18.084 62.482 13.170 ตัวอย่าง 3: แลคเตสกิจกรรมแช่แข็งผงตัวอย่างเนื้อเยื่อต้นถูกhomogenised ในเย็น deionised 5 น้ำ (1: 5 น้ำหนัก / ปริมาตร) ปั่นแล้ว 2,200g 30 นาทีที่ 4. ใสได้รับการเก็บเกี่ยวและการปรับลดต่อไป(1 : 25) ด้วยน้ำ deionised กลุ่มตัวอย่างที่ถูกบ่มที่มีแลคโตสและกลูโคสปลดปล่อยกำหนดโดยใช้ชุดกลูโคส oxidase (ซิกม่า) และวัดที่มีผู้อ่านmicroplate ตารางที่ 3 และรูปที่ 2 แสดงผลสำหรับลำไส้แลคเตสสำหรับทั้งแบบเฉียบพลัน(12 ชั่วโมง) และเรื้อรัง (60 ชั่วโมง) กลุ่มที่เลี้ยงของหนู ลำไส้แลคเตส10 กิจกรรมสูงขึ้นในกลุ่มเฉียบพลันอาหาร A2 เมื่อเทียบกับกลุ่มเรื้อรังเลี้ยง A2 และทั้งเฉียบพลันและกลุ่มเรื้อรังเลี้ยงA1. ตารางที่ 3: แลคเตสกิจกรรมสำหรับกลุ่มอาหารเฉียบพลันและเรื้อรังduodenum แลคเตส(fkatal / ไมโครกรัมโปรตีน) Std Dev อัล 12 8.94 3.87 อัล 60 7.35 2.19 อัล 12 ยังไม่มี 8.99 3.86 อัล 60 ยังไม่มี 8.42 2.59 A2 12 35.97 32.23 A2 60 8.45 1.92 A2 12 ไม่มี 6.55 2.76 A2 60 ไม่มีไม่มีข้อมูลไม่มีข้อมูล15 ตัวอย่างที่ 4: MPO กิจกรรมเนื้อเยื่อลำไส้ใหญ่จากหนูที่เลี้ยงตามตัวอย่างที่1 ได้รับการวัดสำหรับไมอีโลเปอร์ออกซิเดส(เอ็มพี) กิจกรรมขึ้นอยู่กับวิธีการที่จัดตั้งขึ้น (Grisham, MB, et al. วิธี Enzymol 1990, 186. 729 -742) เนื้อเยื่อลำไส้ใหญ่ (50 มก.) เป็น homogenised, แบ่งพาร์ติชันผ่านการหมุนเหวี่ยงการฉีกขาดจากการสอบสวนอัลตราโซนิกและภายใต้การแช่แข็งละลาย 20 รอบ ภายนอก MPO catalyses ออกซิเดชั่ H202 ขึ้นอยู่กับ 3,3 '5,5'-tetramethyl- พื้นผิว benzidine วัด colourimetrically ที่ 562 นาโนเมตร กิจกรรมได้ปกติโดย13 กรด bicinchoninic (BCA) (สมิ ธ PK, et al, Anal Biochem 1985, 150 (1):... 76-85) ความมุ่งมั่นโปรตีนสำหรับ homogenate เดียวกัน ผลที่จะได้แสดงในรูปใน 3 เมื่อเทียบกับสัตว์เลี้ยง A1 A2 สัตว์แสดงให้เห็นถึงการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับของกิจกรรมดังต่อไปนี้การให้อาหารเอ็มพีเฉียบพลัน นี่เป็นถาวรและเพิ่มขึ้นต่อไปด้วยการให้อาหารเรื้อรังและ5 ย้อนกลับได้อย่างสมบูรณ์โดยการบริหารช่องปากของนาลอกโซน. ตัวอย่างที่ 5: ผลของ BCM-7 ในการดูดซึมของซิสเทอีนRadiolabelled [35S] - ซิสเทอีนการทดสอบการดูดซึม ได้รับการดำเนินการใน Caco-2-GI เซลล์เยื่อบุผิวและเซลล์ประสาทในการปรากฏตัวของBCM-7 ปล่อยตัวออกมาจากเบต้า - เคซีนอัลและเมื่อเทียบกับ10 กับการควบคุมการได้รับการรักษาเช่นเดียวกับมอร์ฟีน (ตัวรับ opioid แม่บทตัวเอก) รักษาก่อนในเซลล์ได้รับการดำเนินการสำหรับจุดเวลาที่แตกต่างกันเป็นเวลา 30 นาที, 4, 24 และ 48 ชั่วโมงตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Trivedi เมตร, et al .; Mol. Pharm. 2014) SH-SY5Y มนุษย์เซลล์ประสาทและCaco-2 ไส้เซลล์เยื่อบุผิวถูกชุบในแผ่นหกอย่างดีและได้รับการปรับสภาพกับยาเสพติดและบ่มเป็นเวลาหลายๆ ครั้งก่อนที่จะมีการวัดการดูดซึม สื่อ15 ถูกสำลักและเซลล์ถูกล้างด้วย 600 PL ของ HBSS ที่ 37 ° C HBSS ไม่มีกัมมันตภาพรังสีถูกสำลักแทนที่600 PL 37 ° C HBSS มี [35S] - ซิสเทอีน (1 pCi / 1 มิลลิลิตร), 10:00 ป้ายกำกับซิสเทอีนและ 100 น DTT และเซลล์ ถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาที [35S] - ซิสเทอีน / HBSS ของผสมได้รับการสำลักและการรักษาที่ถูกยกเลิกสองล้างด้วยน้ำแข็งเย็นHBSS เซลล์ที่ถูก lysed แล้วกับ 600 PL ของ dH2O, คัดลอกมาเก็บใน 1.5 ml 20 หลอดไมโครและ sonicated เวลา 10 วินาที 100 PL ของกลุ่มตัวอย่างแต่ละคนถูก aliquoted สำหรับการทดสอบโปรตีน 200 PL ของแต่ละตัวอย่าง (ในเพิ่มขึ้นสามเท่า) ถูก aliquoted ลงในขวดประกายกับ4 มิลลิลิตรของของเหลวประกาย, การ vortex และนับกัมมันตภาพรังสี (ปกติกับโปรตีน) นอกจากนี้ซิสเทอีนผลกระทบการดูดซึมของมอร์ฟีนและ BCM-7 ก็ยังโดดเด่นในการปรากฏตัวของ D-เพ-Cys-เทอร์-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr (CTAP) ซึ่งเป็น25 พีเลือก -antagonist และศัตรูเดลต้า naltrindole (NTI) ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงในรูปของ 4, 5 และ 6 สัญลักษณ์ * ใช้ในรูปของเหล่านี้บ่งชี้ว่ามีนัยสำคัญทางสถิติที่แตกต่างกัน(p <0.05) เมื่อเทียบกับการควบคุมได้รับการรักษาและสัญลักษณ์ # บ่งชี้ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p <0.005 ) เมื่อเทียบกับการควบคุมการรับการรักษา. 30 ตัวอย่างที่ 6: ผลของ BCM-7 ใน GSH และ SAM ระดับตัวอย่างนี้ตรวจสอบว่าการลดลงของซิสเทอีนดูดซึมเป็นข้อสังเกตในตัวอย่างที่5 อาจจะแปลเป็น GSH การเปลี่ยนแปลงและมีผลต่อระดับสารต้านอนุมูลอิสระ ภายในเซลล์ระดับของ GSH ถูกวัดกับ BCM-7 เช่นเดียวกับมอร์ฟีนสำหรับเวลาที่แตกต่างกัน (30 นาที, 4h, 24 ชั่วโมง) โดยใช้วิธี HPLC และวิธีการตรวจสอบการไล่ระดับสีไฟฟ้าเคมี (ฮอดจ์สันและ35 al., เจ Alzh, Dis. 2013 Trivedi M. , et al., Mol. Pharm. 2014) SH-SY5
การแปล กรุณารอสักครู่..
เหล่านี้การศึกษาแสดงแรกชัดเจน หลักฐานทางวิทยาศาสตร์ของการเชื่อมโยงระหว่างเบต้า -
เคซีน A1 การบริโภคและอาการของภาวะไม่ทนต่อแล็กโทส และยังเบต้า -
5 A2 เคซีนการบริโภค ( เทียบกับเบต้า - เคซีน A1 การบริโภค ) ก่อให้เกิด predisposition ประโยชน์
เพื่อการป้องกันหรือลดอาการของภาวะไม่ทนต่อแล็กโทสใน
สัมผัสอนาคตที่จะแลกโตส ก่อนหน้านี้ และยังขัดแย้งกันรายงาน anecdotal และ
การศึกษาที่เกี่ยวข้องกับ bcm-7 ( มากกว่าเบต้า - เคซีน A1 นั่นเอง ) ได้ทำให้เกิดความสับสนในหมู่
ผู้มีฝีมือในศิลปะ มีหลายคนเชื่อว่า มันไม่มีลิงค์ ผ่านของผู้สมัคร 10 ในการหาโซลูชั่นที่มีศักยภาพทางเลือกให้กับปัญหาที่ได้รับความเดือดร้อน
โดยมากคนที่ถือว่าตนเองเป็นแล็กโตส intolerant คือการหลีกเลี่ยงเบต้า - เคซีน A1 ในอาหาร นี้สามารถทำได้โดยได้รับนมมีเบต้า - เนื้อหาเคซีนที่เด่นเบต้า - A2 เคซีนและการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ได้จากนมและ
ทำนมและผลิตภัณฑ์ที่สามารถใช้ได้เพื่อวัตถุประสงค์ในการลดหรือป้องกัน 15 อาการของภาวะไม่ทนต่อแล็กโทส .
นมของวัวสามารถทดสอบเทียบกับสัดส่วนของเบต้า - เคซีนเบต้า - เคซีน A1 และ A2 . อีกวิธีหนึ่งคือ
เคซีน A1 การบริโภคและอาการของภาวะไม่ทนต่อแล็กโทส และยังเบต้า -
5 A2 เคซีนการบริโภค ( เทียบกับเบต้า - เคซีน A1 การบริโภค ) ก่อให้เกิด predisposition ประโยชน์
เพื่อการป้องกันหรือลดอาการของภาวะไม่ทนต่อแล็กโทสใน
สัมผัสอนาคตที่จะแลกโตส ก่อนหน้านี้ และยังขัดแย้งกันรายงาน anecdotal และ
การศึกษาที่เกี่ยวข้องกับ bcm-7 ( มากกว่าเบต้า - เคซีน A1 นั่นเอง ) ได้ทำให้เกิดความสับสนในหมู่
ผู้มีฝีมือในศิลปะ มีหลายคนเชื่อว่า มันไม่มีลิงค์ ผ่านของผู้สมัคร 10 ในการหาโซลูชั่นที่มีศักยภาพทางเลือกให้กับปัญหาที่ได้รับความเดือดร้อน
โดยมากคนที่ถือว่าตนเองเป็นแล็กโตส intolerant คือการหลีกเลี่ยงเบต้า - เคซีน A1 ในอาหาร นี้สามารถทำได้โดยได้รับนมมีเบต้า - เนื้อหาเคซีนที่เด่นเบต้า - A2 เคซีนและการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ได้จากนมและ
ทำนมและผลิตภัณฑ์ที่สามารถใช้ได้เพื่อวัตถุประสงค์ในการลดหรือป้องกัน 15 อาการของภาวะไม่ทนต่อแล็กโทส .
นมของวัวสามารถทดสอบเทียบกับสัดส่วนของเบต้า - เคซีนเบต้า - เคซีน A1 และ A2 . อีกวิธีหนึ่งคือ
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- locker baggage
- ความฝันของฉันในอนาคตฉันอยากเป็นครู ฉันรั
- วันนั้น
- คนไม่จริงใจ
- รักของคุณเป็นแบบใหน
- The Government of each Party to the Conv
- Please don't make me sed.
- That's nice!!What's wrong with the guys
- 준회원
- never know when, when we’ll run out of t
- ใช่ เพราะตอนนี้ฉันเริ่มรู้สึกเบื่อ
- ร่างกายของคุณและริมฝีปากของคุณช่างอบอุ่น
- うずまき ナルト
- คนไม่จริงใจ
- ฉันไม่ได้เคร่งศาสนา แค่อยากให้มาเรียนรู้
- ป้องกันการสูญเสียจากการดื่มแอลกอฮอลล์
- I follow you throughout
- ยังไงคุณก็ต้องอ่าน
- ความรักคือความลับหรอ
- สวยงามและดี
- That's a lovely shirt!
- carousel
- Values are means of three independent as
- うずまき ナルト
