AbstractBackgroundThe complex micro

Abstract
Background
The complex microbiome of the gut has an enormous impact on human health. Analysis of the transcriptional activity of microorganisms through mRNA sequencing (metatranscriptomics) opens a completely new window into their activity in vivo, but it is highly challenging due to numerous technical and bioinformatical obstacles. Here we present an optimized pipeline for extraction of high quality mRNA from stool samples.
Results
Comparison of three commercially available RNA extraction kits with the method of Zoetendal revealed that the Powermicrobiome Kit (MoBio) performed best with respect to RNA yield and purity. Next, the influence of the stabilization reagent during sample storage for up to 15 days was studied. RIN analysis and qRT-PCR of spiked-in and indigenous genes revealed that RNA Later preserved mRNA integrity most efficiently, while samples conserved in RNA Protect showed substantial mRNA decay. Using the optimized pipeline developed here, recovery rates for spiked-in E.coli cells expressing fluorescing proteins were 8.7-9.7 % for SuperfolderGFP and 14.7-17.8 % for mCherry. The mRNA of stabilized stool samples as well as of snap-frozen controls was sequenced with Illumina Hiseq, yielding on average 74 million reads per sample. PCoA analysis, taxonomic classification using Kraken and functional classification using bwa showed that the transcriptomes of samples conserved in RNA Later were unchanged for up to 6 days even at room temperature, while RNA Protect was inefficient for storage durations exceeding 24 h. However, our data indicate that RNA Later introduces a bias which is then maintained throughout storage, while RNA Protect conserved samples are initially more similar to the snap frozen controls. RNA Later conserved samples had a reduced abundance of e.g. Prevotellaceae transcripts and were depleted for e.g. COG category “Carbohydrate transport and metabolism”.
Conclusion
Since the overall similarity between all stool transcriptional profiles studied here was >0.92, these differences are unlikely to affect global comparisons, but should be taken into account when rare but critically important members of the stool microbiome are being studied.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บทคัดย่อพื้นหลังMicrobiome ซับซ้อนของลำไส้มีผลกระทบมหาศาลกับสุขภาพของมนุษย์ วิเคราะห์กิจกรรม transcriptional จุลินทรีย์ผ่าน mRNA ลำดับเบส (metatranscriptomics) เปิดหน้าต่างใหม่ทั้งหมดเป็นกิจกรรมของพวกเขาในสัตว์ทดลอง แต่ก็ท้าทายมากเนื่องจากอุปสรรคทางด้านเทคนิคและ bioinformatical มากมาย ที่นี่เรานำเสนอขั้นตอนการเพิ่มประสิทธิภาพสำหรับสกัดคุณภาพสูง mRNA จากตัวอย่างอุจจาระผลลัพธ์ชุดสกัดอาร์เอ็นเอใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ 3 เปรียบเทียบกับวิธีการของ Zoetendal เปิดเผยว่า ชุด Powermicrobiome (MoBio) ดำเนินการส่วนกับผลผลิตอาร์เอ็นเอและความบริสุทธิ์ ได้ศึกษาอิทธิพลของรีเอเจนต์เสถียรภาพระหว่างการเก็บรักษาตัวอย่างถึง 15 วัน วิเคราะห์ริ้นและ qRT PCR ของ spiked ใน และยีนชนเปิดเผยว่า Later อาร์เอ็นเอรักษาความสมบูรณ์ของ mRNA มากที่สุดได้อย่างมีประสิทธิภาพ ขณะอยู่ในอาร์เอ็นเอป้องกันตัวอย่างแสดงให้เห็นว่าพบ mRNA ผุ ใช้ขั้นตอนเพิ่มประสิทธิภาพพัฒนานี่ กู้คืนและ spiked ระบบเซลล์แสดงโปรตีน fluorescing ได้ 8.7-9.7% สำหรับ SuperfolderGFP และ 14.7-17.8% สำหรับ mCherry ราคาพิเศษ MRNA เสถียรอุจจาระตัวอย่างเช่น ณแช่สแนปอินตัวควบคุมถูกเรียงลำดับกับ Illumina Hiseq ผลผลิตเฉลี่ย 74 ล้านอ่านต่อตัวอย่าง วิเคราะห์ PCoA ประเภทอนุกรมวิธานที่ใช้คราเคนและทำงานประเภทใช้ bwa ที่แสดงให้เห็นว่า transcriptomes อย่างที่อยู่ในอาร์เอ็นเอ Later ได้ไม่ถึง 6 วันแม้ที่อุณหภูมิห้อง ขณะที่อาร์เอ็นเอป้องกันอยู่ต่ำสำหรับระยะเวลาจัดเก็บเกิน 24 ชม อย่างไรก็ตาม ข้อมูลบ่งชี้ว่า Later อาร์เอ็นเอเกิดความโน้มเอียงที่ไว้แล้วตลอดเก็บ ในขณะที่อาร์เอ็นเอป้องกัน ตัวอย่างนำจะเริ่มมากขึ้นคล้ายกับสแนปอินตัวควบคุมแช่แข็ง อาร์เอ็นเอที่อยู่หลังตัวอย่างมีมากมายเช่น Prevotellaceae ใบแสดงผลการลดลง และได้สิ้นสุดลงสำหรับเช่น COG ประเภท "คาร์โบไฮเดรตขนส่งและการเผาผลาญ"บทสรุปเนื่องจากมีความคล้ายคลึงกันโดยรวมระหว่างเก้าอี้ transcriptional โพรไฟล์ทั้งหมดเรียนที่นี่ > 0.92 ความแตกต่างเหล่านี้ไม่น่าจะส่งผลกระทบต่อโลกเปรียบเทียบ แต่ควรนำมาพิจารณาเมื่อหายาก แต่สำคัญถึงสมาชิกของ microbiome สตูลมีการศึกษา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บทคัดย่อพื้นหลัง
microbiome ที่ซับซ้อนของลำไส้มีผลกระทบอย่างมากต่อสุขภาพของมนุษย์ การวิเคราะห์กิจกรรมการถอดรหัสของจุลินทรีย์ผ่านลำดับ mRNA (metatranscriptomics) เปิดหน้าต่างใหม่เข้าในกิจกรรมของพวกเขาในร่างกาย แต่มันเป็นสิ่งที่ท้าทายอย่างมากอันเนื่องมาจากอุปสรรคทางเทคนิคและ bioinformatical จำนวนมาก ที่นี่เรานำเสนอท่อที่ดีที่สุดในการสกัด mRNA ที่มีคุณภาพสูงจากตัวอย่างอุจจาระ.
ผลการเปรียบเทียบทั้งสามใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ชุดสกัด RNA ด้วยวิธีการของ Zoetendal เปิดเผยว่า Powermicrobiome Kit (Mobio) ดำเนินการที่ดีที่สุดเกี่ยวกับการให้ผลตอบแทนและความบริสุทธิ์อาร์เอ็นเอ
ถัดไปอิทธิพลของสารเสถียรภาพในระหว่างการเก็บตัวอย่างได้นานถึง 15 วันได้รับการศึกษา การวิเคราะห์และ RIN qRT-PCR ของแหลมอินและยีนพื้นเมืองเปิดเผยว่าความสมบูรณ์ของ mRNA อาร์เอ็นเอที่เก็บรักษาไว้ต่อมามีประสิทธิภาพมากที่สุดในขณะที่กลุ่มตัวอย่างในป่าสงวน RNA ป้องกันการสลายตัวของ mRNA แสดงให้เห็นเป็นรูปธรรม การใช้ท่อที่ดีที่สุดที่นี่พัฒนาอัตราการกู้คืนถูกแทงในเซลล์ E.coli แสดงโปรตีนเรืองแสงถูก 8.7-9.7% สำหรับ SuperfolderGFP และ 14.7-17.8% สำหรับ mCherry mRNA ของตัวอย่างอุจจาระมีความเสถียรเช่นเดียวกับการควบคุมสแนปอินแช่แข็งได้ติดใจกับ Illumina Hiseq ผลผลิตโดยเฉลี่ย 74 ล้านคนอ่านต่อตัวอย่าง PCoA วิเคราะห์การจำแนกหมวดหมู่การใช้คราเคนและการจัดงานโดยใช้ bwa แสดงให้เห็นว่าทรานของกลุ่มตัวอย่างในป่าสงวนต่อมาอาร์เอ็นเอไม่เปลี่ยนแปลงถึง 6 วันแม้ที่อุณหภูมิห้องในขณะที่อาร์เอ็นเอปกป้องก็ไม่มีประสิทธิภาพสำหรับระยะเวลาการจัดเก็บเกิน 24 ชั่วโมง อย่างไรก็ตามข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าอาร์เอ็นเอต่อมาแนะนำอคติที่ถูกเก็บรักษาไว้แล้วตลอดการจัดเก็บในขณะที่อาร์เอ็นเอปกป้องอนุรักษ์ตัวอย่างเป็นครั้งแรกขึ้นคล้ายกับการควบคุมการแช่แข็งสแน็ป อาร์เอ็นเอตัวอย่างการอนุรักษ์ต่อมามีความอุดมสมบูรณ์ลดลงเช่นจิตบำบัด Prevotellaceae และหมดสำหรับเช่น COG หมวดหมู่ "การขนส่งคาร์โบไฮเดรตและการเผาผลาญ".
สรุปเนื่องจากความคล้ายคลึงกันโดยรวมระหว่างรูปแบบการถอดรหัสอุจจาระทั้งหมดเรียนที่นี่> 0.92 แตกต่างเหล่านี้ไม่น่าจะส่งผลกระทบต่อการเปรียบเทียบระดับโลก แต่ควรจะนำมาพิจารณาเมื่อสมาชิกที่หายาก แต่สิ่งที่สำคัญอย่างยิ่งของ microbiome อุจจาระมีการศึกษา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

พื้นหลังนามธรรม

ที่ซับซ้อนของลำไส้ไมโครไบโมีผลกระทบอย่างมากต่อสุขภาพของมนุษย์ การวิเคราะห์กิจกรรมของจุลินทรีย์ที่ผ่านการลอง ( metatranscriptomics ) เปิดหน้าต่างใหม่อย่างสมบูรณ์ในกิจกรรมของพวกเขาในร่างกาย แต่มันก็ท้าทายมาก เนื่องจากอุปสรรคทางด้านเทคนิค และ bioinformatical มากมายที่นี่เรานำเสนอที่ดีที่สุดของท่อเพื่อสกัดคุณภาพสูงจากตัวอย่างอุจจาระ การเปรียบเทียบผล

3 ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ชุดการสกัด RNA ด้วยวิธี zoetendal เปิดเผยว่า powermicrobiome Kit ( mobio ) การปฏิบัติที่ดีที่สุดเกี่ยวกับผลผลิตอาร์เอ็นเอและความบริสุทธิ์ ถัดไป , อิทธิพลของการกระทำในระหว่างการเก็บตัวอย่างถึง 15 วัน ผลการทดลองพบว่าการวิเคราะห์และข้าพเจ้า PCR ของยีน พบว่า ถูกแทง และชนพื้นเมืองของ RNA ภายหลังรักษาความสมบูรณ์ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากที่สุด ริน , ตัวอย่างเพื่อปกป้อง พบมากในประเภทของการผุ ใช้ปรับท่อพัฒนาที่นี่ , การกู้คืนอัตราจากเซลล์ E.coli ในการแสดง fluorescing โปรตีนเป็น 8.7-9.7 ) และ superfoldergfp 14.7-17.8 % mcherry .ตัวอย่างของอาการอุจจาระเป็น snap แช่แข็งการควบคุมเป็นลำดับด้วย Illumina hiseq ให้ผลผลิตเฉลี่ย 74 ล้านอ่านต่อ ตัวอย่าง การวิเคราะห์ pcoa การจำแนกและอนุกรมวิธานที่ใช้แบ่งตามหน้าที่การสร้างสรรค์เสื้อผ้า พบว่า transcriptomes ตัวอย่างการอนุรักษ์ใน RNA ต่อมาไม่เปลี่ยนแปลงถึง 6 วัน ที่อุณหภูมิห้องขณะที่อาร์เอ็นเอป้องกันไม่มีประสิทธิภาพสำหรับการจัดเก็บระยะเวลาเกิน 24 ชั่วโมง อย่างไรก็ตาม ข้อมูลบ่งชี้ว่า RNA ต่อมาแนะนำ อคติ ซึ่งจะรักษาตลอดกระเป๋า ขณะที่อาร์เอ็นเอปกป้องป่าสงวนตัวอย่างตอนแรกเหมือนขาดการควบคุมแช่แข็ง ซึ่งต่อมาได้ลดความอุดมสมบูรณ์ของน้ำตัวอย่าง เช่น prevotellaceae transcripts และพร่องสำหรับเช่นประกาศประเภท " การขนส่งและการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรต " .

สรุปตั้งแต่ ความเหมือนโดยรวมระหว่างแป้นลองโปรไฟล์เรียนที่นี่คือ > 0.92 , ความแตกต่างเหล่านี้ไม่น่าจะมีผลต่อการเปรียบเทียบโลก แต่ควรนำมาพิจารณาเมื่อหายากแต่สำคัญมากสมาชิกของอุจจาระไมโครไบโาลังศึกษา