3. Results and discussion3.1. Magne

3. Results and discussion
3.1. Magnetic microparticle labeling of protoplasts
The non-adhering nature of suspension cells sets a major limitation in monitoring and tracking the responses of single isolatedcells. Hence immobilization strategies are required to effectivelylimit the spatial motility of such cells in three dimensions. Wechoose magnetic labeling as a strategy to anchor cells on a fixedposition. Due to the unavailability of adequate antibodies whichcould conjugate with epitopes located on the exterior of theA. thaliana plasma membrane, we looked for a versatile linkermolecule with applicability over a wide range of suspension celltypes Concanavalin A is a protein molecule, that selectively recognizes -linked mannose present as part of a core oligosaccharidein many serum and membrane glycoproteins. It has been demonstrated in the literature for isolating DNA, proteins and various celltypes [25,26,30,31]. Here, for coupling streptavidin coated MMPto protoplasts, biotinylated ConA was chosen as a linker moleculeProtoplast were isolated from A. thaliana plants (Fig. 2(a)) and functionalized with biotinylated ConA. During the functionalization areduction in the number of cells was observed after incubation withConA concentrations higher than 10 ng L−1, suggesting a negativeeffect of ConA on cell integrity, which caused protoplasts to burst(Fig. 2(b)).
Toxic effects of ConA have been previously described in literature and are due to the activation of intracellular pathwaysthat leads to apoptosis, possibly after ConA internalization [32,33].However in the presented experiments, this toxic effect of ConAwas negligible at concentrations lower than 10 ng L−1which wasthus defined as the highest dosage to be used in further experiments. ConA treatment of protoplasts also had an effect on theclustering of cells, defined as two or more cells physically interacting (Fig. 2(c)). Clustering became more prominent at higher ConAconcentrations with about 70% of the cells clustered at the high-est concentration tested (Fig. 2(d)). Such effect is not surprising asit is known that ConA is a multivalent molecule and can bind tomore than one -linked mannose group at the time hence form-ing bridges between cells [33–35]. For the purposes of this work,overcrowding of cells needed to be avoided as it would hinderaccurate monitoring of protoplasts morphology during the waterpermeability measurements, thereby compromising the quality ofmeasurements on the DMF chip. Based on these considerations andthe preliminary experiments, 1–10 ng L−1ConA was selected asthe working range for the next experiments. The second step ofthe procedure required incubation of biotinylated ConA protoplastswith streptavidin coated MMP (Fig. 2(e)).To determine the optimal concentration of MMP to be usedfor efficient protoplasts isolation but at the same to avoid exces-sive residual MMP presence in the final preparation, protoplastsfunctionalized either with 1 ng L−1or 10 ng L−1of ConA wereincubated with different concentrations of MMPs and the numberof isolated protoplasts was valuated after several washing steps(Fig. 2(f)). Among the different conditions tested, the combinationof 10 ng L−1ConA and 60–100 ng L−1MMP delivered the highestnumber of isolated protoplast. For the condition 10 ng L−1ConA(Fig. 2(f), black curve), it was observed that the number of retrievedprotoplasts initially increased with increasing MMP concentrationsand reached plateau at 60 ng L−1MMP, suggesting a saturationof the exposed biotinylated tags on the cell surface. Moreover,to minimize the effect of MMPs on the protoplast integrity, theaverage number of MMPs bound on the protoplast membrane wascounted. At 60 ng L−1MMP, most protoplasts had less than fourMMPs attached to their surface. In conclusion, 10 ng L−1ConA and60 ng L−1MMP were selected as working concentrations and usedin all other experiments. The isolated protoplasts were then usedfor conducting water permeability measurements on the DMF chip.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผล และการอภิปราย3.1. microparticle แม่เหล็กติดฉลากของพลาสต์ธรรมชาติไม่ยึดมั่นของระงับเซลล์ชุดข้อจำกัดที่สำคัญในการตรวจสอบ และติดตามการตอบสนองของ isolatedcells เดียว ดังนั้น กลยุทธ์ตรึงจะต้อง effectivelylimit เนื่องจากพื้นที่ของเซลล์ดังกล่าวในสามมิติ Wechoose แม่เหล็กติดฉลากเป็นกลยุทธ์การยึดเซลล์บน fixedposition การ เนื่องจากไม่พร้อมใช้งานของแอนตี้พอ whichcould conjugate กับ epitopes ที่อยู่ภายนอกของเธีย thaliana พลาสมาเมมเบรน ที่เรามอง linkermolecule หลากหลาย มีความเกี่ยวข้องมากกว่าความหลากหลายของระบบกันสะเทือน celltypes Concanavalin A เป็น โมเลกุลโปรตีน ที่รู้จักเลือก - mannose เชื่อมโยงปัจจุบันเป็นส่วนหนึ่งของ oligosaccharidein หลักไกลโคโปรตีนเซรั่มและเมมเบรนมากมาย มันมีการสาธิตในวรรณคดีสำหรับแยกดีเอ็นเอ โปรตีนและ celltypes ต่าง ๆ [25,26,30,31] ที่นี่ สำหรับคัปปลิ้ง streptavidin เคลือบพลาสต์ MMPto, biotinylated ConA เลือกเป็น moleculeProtoplast เชื่อมโยงข้อมูลแยกจาก A. thaliana (รูป 2(a)) และปรับหมู่ฟังก์ชั่นกับ biotinylated ConA ในระหว่างที่ functionalization areduction ในจำนวนเซลล์ที่ถูกสังเกตหลังจาก withConA บ่มความเข้มข้นสูงกว่า 10 ฉบับ L−1 แนะนำ negativeeffect ของ ConA บนเซลล์สมบูรณ์ ซึ่งเกิดจากพลาสต์ไปถ่าย (รูป 2(b))ผลพิษของ ConA ก่อนหน้านี้ไว้ในวรรณคดี และมีเนื่องจากใช้งานของลูกค้าเป้าหมายการสกัด intracellular pathwaysthat กัน อาจจะหลัง ConA internalization [32,33] อย่างไรก็ตาม ในการทดลองนำเสนอ ผลนี้พิษของเล็กน้อยที่ความเข้มข้นต่ำกว่า 10 ฉบับ L−1which wasthus ConAwas กำหนดเป็นปริมาณสูงสุดที่จะใช้ในการทดลอง รักษา ConA พลาสต์ยังมีผลต่อ theclustering ของเซลล์ เป็น สองเซลล์การโต้ตอบทางกายภาพ (รูป 2(c)) คลัสเตอร์กลายเป็นโดดเด่นมากที่ ConAconcentrations สูงประมาณ 70% ของเซลล์กลุ่มที่สูงเอสความเข้มข้นที่ทดสอบ (รูป 2(d)) ไม่น่าแปลกใจเช่นผล asit เป็นที่รู้จักกันว่า ConA โมเลกุล multivalent และสามารถผูก tomore กว่ากลุ่มเชื่อมโยง mannose หนึ่ง - ในเวลาจึงฟอร์ม-ing สะพานระหว่างเซลล์ [33 – 35] สำหรับวัตถุประสงค์ของงานนี้ สัญญาของเซลล์ที่จำเป็นในการหลีกเลี่ยง ตามที่คุณต้อง hinderaccurate ตรวจสอบสัณฐานวิทยาพลาสต์ระหว่างวัด waterpermeability จึงสูญเสีย ofmeasurements คุณภาพบนชิ DMF ตามข้อพิจารณาเหล่านี้และการทดลองเบื้องต้น ฉบับ 1-10 เลือก L−1ConA เป็นช่วงทำงานสำหรับการทดลองต่อไป ขั้นตอนสองของการกกไข่กระบวนการจำเป็นของ biotinylated ConA protoplastswith streptavidin เคลือบ MMP (รูป 2(e)) การตรวจสอบความเข้มข้นที่เหมาะสม ของ MMP จะ แยกโปรโตพลาสต์มีประสิทธิภาพ usedfor แต่ ที่เหมือนกันเพื่อหลีกเลี่ยง exces จะเหลือ MMP มีเตรียมพร้อมขั้นสุดท้าย protoplastsfunctionalized อย่างใดอย่างหนึ่ง 1 ฉบับ L−1or 10 ฉบับ L−1of ConA wereincubated กับความเข้มข้นแตกต่างกันของ MMPs และพลาสต์แยก numberof valuated หลังจากล้างหลายขั้นตอน (รูป 2(f)) ในเงื่อนไขต่าง ๆ ทดสอบ ฉบับ combinationof 10 L−1ConA และ 60-100 ฉบับ L−1MMP ส่ง highestnumber ของ protoplast แยก สำหรับเงื่อนไข 10 ฉบับ L−1ConA (รูปเส้นโค้ง 2(f) สีดำ), พบว่า จำนวน retrievedprotoplasts เริ่มเพิ่มขึ้นเพิ่มขึ้น concentrationsand MMP ถึงที่ราบสูงที่ 60 ฉบับที่ L−1MMP, saturationof biotinylated สัมผัสแนะนำแท็กบนผิวเซลล์ นอกจากนี้ เพื่อลดผลของ MMPs สมบูรณ์ protoplast, MMPs จำนวนค่าเฉลี่ยถูกผูกไว้บน wascounted เมมเบรน protoplast ที่ 60 ฉบับที่ L−1MMP พลาสต์ส่วนใหญ่มีน้อยกว่า fourMMPs แนบกับพื้นผิวของพวกเขา ในการสรุป 10 ฉบับ L−1ConA and60 ฉบับ L−1MMP ถูกเลือกเป็นความเข้มข้นทำงานและ usedin การทดลองอื่น ๆ พลาสต์ที่แยกได้แล้ว usedfor ทำน้ำซึมผ่านวัดบนชิ DMF

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการทดลองและการอภิปราย
3.1 การติดฉลาก microparticle แม่เหล็กของโปรโตพลา
ธรรมชาติที่ไม่ยึดมั่นของเซลล์ระงับการกำหนดข้อ จำกัด ที่สำคัญในการตรวจสอบและติดตามการตอบสนองของ isolatedcells เดียว ดังนั้นกลยุทธ์การตรึงจะต้อง effectivelylimit เคลื่อนที่เชิงพื้นที่ของเซลล์ดังกล่าวในสามมิติ การติดฉลากแม่เหล็ก Wechoose เป็นกลยุทธ์ยึดเซลล์บน fixedposition ที่ เนื่องจากความไม่พร้อมของแอนติบอดีเพียงพอ whichcould ผันกับ epitopes ตั้งอยู่บนด้านนอกของ Thea ที่ เยื่อหุ้ม thaliana เรามองหา linkermolecule อเนกประสงค์ที่มีการบังคับใช้ในช่วงที่กว้างของการระงับ celltypes Concanavalin เป็นโมเลกุลโปรตีนที่คัดเลือกตระหนัก? -linked ปัจจุบันสรุปได้เป็นส่วนหนึ่งของหลักหลาย oligosaccharidein ซีรั่มและเมมเบรนไกลโคโปรตีน มันได้รับการพิสูจน์ในวรรณคดีสำหรับการแยกดีเอ็นเอโปรตีนและ celltypes ต่างๆ [25,26,30,31] ที่นี่สำหรับการมีเพศสัมพันธ์เคลือบ streptavidin โปรโตพลา MMPto, ไบโอติน cona รับเลือกให้เป็นตัวเชื่อมโยง moleculeProtoplast ที่แยกได้จากพืช A. thaliana (รูป. 2 (ก)) และฟังก์ชันกับ biotinylated cona ในช่วง areduction functionalization จำนวนของเซลล์ที่ถูกตั้งข้อสังเกตหลังจากที่ความเข้มข้น withConA บ่มสูงกว่า 10 นาโนกรัม? L-1 บอก negativeeffect ของ cona กับความสมบูรณ์ของเซลล์ซึ่งเกิดจากโปรโตพลาออกมา (รูปที่ 2. (ข)).
พิษของ cona ได้รับการอธิบายก่อนหน้านี้ในวรรณคดีและเนื่องจากการกระตุ้นการทำงานของเซลล์ pathwaysthat นำไปสู่การตายของเซลล์อาจจะเป็นหลังจาก cona internalization [32,33] อย่างไรก็ตามในการทดลองนำเสนอผลพิษของ ConAwas เล็กน้อยที่ระดับความเข้มข้นต่ำกว่า 10 นาโนกรัม? L wasthus -1which กำหนดเป็นปริมาณสูงสุดที่จะใช้ในการทดลองต่อไป การรักษา cona ของโปรโตพลานอกจากนี้ยังมีผลต่อการ theclustering ของเซลล์ที่กำหนดไว้สองคนหรือมากกว่าเซลล์ร่างกายมีปฏิสัมพันธ์ (รูปที่ 2. (c)) การจัดกลุ่มก็ยิ่งโดดเด่นที่ ConAconcentrations สูงขึ้นประมาณ 70% ของเซลล์คลัสเตอร์ที่มีความเข้มข้นสูง est ทดสอบ (รูป. 2 (D)) ผลกระทบดังกล่าวไม่เป็นที่น่าแปลกใจ asit ที่รู้จักกันว่า cona เป็นโมเลกุล multivalent และสามารถผูก tomore มากกว่าหนึ่ง? -linked กลุ่ม mannose ในเวลาที่สะพานเพราะฉะนั้นรูปแบบไอเอ็นจีระหว่างเซลล์ [33-35] สำหรับจุดประสงค์ของงานนี้ที่แออัดยัดเยียดของเซลล์ที่จำเป็นในการที่จะหลีกเลี่ยงมันจะ hinderaccurate การตรวจสอบของโปรโตพลาสัณฐานระหว่างวัด waterpermeability จึงไม่สูญเสียคุณภาพ ofmeasurements บนชิปกรมเชื้อเพลิงธรรมชาติ ขึ้นอยู่กับการพิจารณาเหล่านี้ andthe การทดลองเบื้องต้น 1-10 NG? L-1ConA ได้รับเลือก asthe ช่วงการทำงานสำหรับการทดลองต่อไป ขั้นตอนที่สอง ofthe ขั้นตอนการบ่มที่ต้องการของไบโอติน cona protoplastswith สเตเคลือบ MMP (รูป. 2 (จ)). ในการตรวจสอบความเข้มข้นที่เหมาะสมของ MMP จะเป็น usedfor แยกโปรโตพลาที่มีประสิทธิภาพ แต่ในเวลาเดียวกันเพื่อหลีกเลี่ยงการ Exces-บ่งบอกการปรากฏ MMP ที่เหลือใน การเตรียมการขั้นสุดท้าย protoplastsfunctionalized ทั้งที่มี 1 NG? L-1 หรือ 10 NG? L-1of cona wereincubated ที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ MMPs และจํานวนที่แยกโปรโตพลาได้รับการประเมินหลังจากขั้นตอนการซักผ้าหลาย (รูปที่ 2. (ฉ)) ท่ามกลางเงื่อนไขที่แตกต่างกันทดสอบ combinationof 10 NG? L-1ConA และ 60-100 NG? L-1MMP ส่ง highestnumber ของโปรโตพลาแยก สภาพ 10 NG? L-1ConA (รูป. 2 (F), เส้นโค้งสีดำ) มันก็สังเกตเห็นว่าจำนวนของ retrievedprotoplasts เพิ่มขึ้นครั้งแรกกับการเพิ่ม MMP concentrationsand ถึงที่ราบสูงที่ 60 NG? L-1MMP แนะนำ saturationof สัมผัส แท็ก biotinylated บนผิวเซลล์ นอกจากนี้เพื่อลดผลกระทบของ MMPs กับความสมบูรณ์ของโปรโตพลาจำนวน MMPs theaverage ผูกไว้ในเมมเบรนโปรโตพลา wascounted ที่ 60 NG? L-1MMP, โปรโตพลาส่วนใหญ่มีน้อยกว่า fourMMPs แนบกับพื้นผิวของพวกเขา ในการสรุป 10 NG? L-1ConA and60 NG? L-1MMP ได้รับเลือกเป็นความเข้มข้นของการทำงานและการ usedin การทดลองอื่น ๆ ทั้งหมด โปรโตพลาแยกถูกแล้ว usedfor การดำเนินการการวัดการซึมผ่านของน้ำบนชิปกรมเชื้อเพลิงธรรมชาติ