Most hepatoma cell lines lack prope

Most hepatoma cell lines lack proper expression and induction of CYP3A4 enzyme, which limits their use for predicting drug metabolism and toxicity. Nuclear receptor pregnane X receptor (PXR) has been well recognized for its critical role in regulating expression of CYP3A4 gene. However, its physiological activity of binding to the particular site of promoter is significantly weakened in hepatic cell lines. To address this problem, we created "chimeric PXR" constructs by appending a strong activation domain (AD) from p53 subunit to either N- or C- termini of the human PXR (hPXR), that is, hPXR-p53 and p53-hPXR. C3A, a hepatoma cell line, was used as the cell model to test the regulation effect of chimeric hPXR over wild type (WT) hPXR on CYP3A4 expression at gene, protein, and metabolism levels, respectively. Compared with C3A cells transiently transfected with WT hPXR, the activity of CYP3A4.XREM.luc reporter gene in C3A cells transfected with hPXR-p53 or p53-hPXR increased 5- and 9-fold respectively, and the levels of CYP3A4 mRNA expression increased 3.5- and 2.6-fold, respectively. C3A cells stably transfected with hPXR-p53-AD exhibited an improved expression of CYP3A4 at both gene (2-fold) and protein (1.5-fold) levels compared to WT C3A cells. Testosterone, a CYP3A4-specific substrate, was used for detecting the metabolism activity of CYP3A4. No testosterone metabolite could be detected in microsomes from WT C3A cells and WT C3A cells-based array, while the formation of 6β-hydroxytestosterone metabolite in the transfected cells was 714 and 55 pmol/mg protein/min, respectively. In addition, all the above expression levels in the transfected cell models could be further induced with additional treatment of Rifampicin, a specific inducer for CYP3A4. In conclusion, our study established a proof-of-principle example that genetic modification with chimeric hPXR-p53-AD could improve CYP3A4 metabolism ability in hepatic cell line.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ส่วนใหญ่รายการเซลล์ hepatoma ขาดนิพจน์ที่เหมาะสมและการเหนี่ยวนำเอนไซม์ CYP3A4 ซึ่งจำกัดการใช้สำหรับการคาดการณ์ความเป็นพิษและเมแทบอลิซึมของยา รู้จักตัวรับ pregnane X ตัวรับนิวเคลียร์ (PXR) สำหรับบทบาทความสำคัญในการควบคุมของยีน CYP3A4 ดี อย่างไรก็ตาม กิจกรรมของสรีรวิทยาของผูกไปเฉพาะของโปรโมเตอร์จะมากลดลงในบรรทัดในเซลล์ตับ เพื่อแก้ไขปัญหานี้ เราสร้างโครงสร้าง "chimeric PXR" โดยผนวกแรงเปิดโดเมน (AD) จากย่อย p53 จะเป็น N - หรือ C-เทอร์มินิของ PXR มนุษย์ (hPXR), คือ hPXR p53 และ p53-hPXR C3A บรรทัดเซลล์ hepatoma ถูกใช้เป็นแบบเซลล์เพื่อทดสอบผลบังคับของ chimeric hPXR ผ่าน hPXR ไวลด์ไทป์ (WT) ในนิพจน์ CYP3A4 ที่ยีน โปรตีน และ ระดับการเผาผลาญ ตามลำดับ เมื่อเทียบกับเซลล์ transiently transfected กับ hPXR WT กิจกรรมของ CYP3A4 C3A XREM.luc โปรแกรมรายงานยีนในเซลล์ C3A transfected กับ hPXR p53 หรือ p53 hPXR เพิ่ม fold 5 และ 9 ตามลำดับ และระดับของ CYP3A4 mRNA นิพจน์เพิ่ม 3.5 - และ 2.6-fold ตามลำดับ Stably transfected กับ hPXR-p53-AD เซลล์ C3A จัดแสดงนิพจน์การปรับปรุงของ CYP3A4 ในยีนทั้งสอง (2-fold) และโปรตีน (1.5-fold) ระดับเซลล์ WT C3A กับพื้นผิวเฉพาะ CYP3A4 ฮอร์โมนเพศชายถูกใช้สำหรับการตรวจสอบกิจกรรมการเผาผลาญของ CYP3A4 Metabolite ฮอร์โมนเพศชายไม่สามารถตรวจพบใน microsomes จากเซลล์ WT C3A และ WT C3A ตามเซลล์อาร์เรย์ ขณะที่การก่อตัวของ metabolite 6β hydroxytestosterone ในเซลล์ transfected อยู่ใน 714 และโปรตีน pmol 55 mg/min ตามลำดับ แห่ง ระดับทั้งหมดข้างต้นนิพจน์ในเซลล์ transfected รุ่นอาจจะเพิ่มเติมเกิดกับ Rifampicin, inducer เฉพาะสำหรับ CYP3A4 รักษาเพิ่มเติม เบียดเบียน การศึกษาของเราก่อตั้งขึ้นเป็นตัวอย่างหลักฐานหลักที่ปรับเปลี่ยนพันธุกรรมกับ chimeric hPXR-p53-AD สามารถปรับปรุงความสามารถเผาผลาญ CYP3A4 ในบรรทัดของเซลล์ตับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เซลล์ตับส่วนใหญ่ขาดการแสดงออกที่เหมาะสมและการสร้างเอนไซม์ ซึ่งจำกัดการใช้ทำนายและเมแทบอลิซึมของยาพิษ นิวเคลียร์ pregnane x รีเซพเตอร์ ( receptor pxr ) ได้รับการยอมรับสำหรับบทบาทที่สำคัญในการควบคุมการแสดงออกของยีน ( . อย่างไรก็ตามของกิจกรรมทางสรีรวิทยาของผูกกับเว็บไซต์เฉพาะของการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ตับ . เพื่อแก้ไขปัญหานี้ เราได้สร้าง " ที่ pxr " สร้างโดยผนวกโดเมนการกระตุ้นที่แข็งแกร่ง ( AD ) จากกิจกรรมย่อยเพื่อให้ - หรือ C - แทร์มินี่ของ pxr มนุษย์ ( hpxr ) , ที่เป็น , และ hpxr hpxr-p53 ประ . c3a , ตับเซลล์ไลน์ใช้เซลล์แบบทดสอบการควบคุมผลกระทบของ hpxr ที่มากกว่าป่าชนิด ( WT ) hpxr ในการแสดงออกของยีนที่สร้างโปรตีนและระดับการเผาผลาญ ตามลำดับ เมื่อเทียบกับ c3a เซลล์บุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราว transfected กับ WT hpxr กิจกรรมของยีนในเซลล์ cyp3a4.xrem.luc นักข่าว c3a transfected กับ hpxr-p53 หรือมะเร็ง hpxr เพิ่มขึ้น 5 - 9-fold ตามลำดับและระดับการแสดงออกของ mRNA ( เพิ่มขึ้น 3.5 - 2.6-fold ตามลำดับ c3a เซลล์เสถียร transfected กับ hpxr-p53-ad มีการแสดงออกของยีนที่สร้างขึ้นทั้งสอง ( ถึง ) และโปรตีน ( 1.5-fold ) ระดับเทียบกับ WT c3a เซลล์ ฮอร์โมนเพศชาย , ( เฉพาะพื้นผิวที่ใช้สำหรับตรวจหาการเผาผลาญกิจกรรมสร้าง .ไม่อาจจะตรวจพบระดับฮอร์โมนเพศชายในไมโครโซมจาก WT c3a เซลล์และเซลล์ WT c3a อาร์เรย์ที่ใช้ในขณะที่การ 6 บีตา - hydroxytestosterone ไลท์ในเซลล์เป็น transfected แล้ว 55 pmol / mg protein / นาที ตามลำดับ นอกจากนี้ , ทั้งหมดข้างต้นระดับการแสดงออกใน transfected มือถือรุ่นสามารถเพิ่มเติมการรักษาเพิ่มเติมของ rifampicin ,เป็นเอนไซม์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการสร้าง . โดยสรุป การศึกษาของเราสร้างหลักฐานตัวอย่างหลักการว่า การดัดแปรพันธุกรรม ด้วยที่สามารถปรับปรุงความสามารถใน hpxr-p53-ad การเผาผลาญในเซลล์ตับ (
.