Southern blot analysis. The number

Southern blot analysis. The number of insertions of the pNKGFP
fragment in the 33.1::pNKGFP genome was confirmed using Southern
blotting. For this technique, probes were generated by PCR, using primers
(PPNKF [5=-CCT TCA TTA CAG AAA CGG C-3=] and PPNKRII [5=-
GGT GAT GCG TGA TCT GAT CC-3=]) designed by the OligoPerfect
Designer program (Invitrogen) on the basis of the pNKBOR sequence.
These primers amplify a 362-bp sequence located between the insertion
sites (ISs) that correspond to a portion of the Kanr gene and a conserved
plasmid fragment. The probe specificity was evaluated using DNA
from the strains, plasmids (Table 1), and plants. The PCR mixture contained
1 l of the samples (10 ng), 0.2 M primers PPNKF and PPNKRII,
3.75 mM MgCl2, 0.2 mM a deoxynucleoside triphosphate mixture, and
2.5 U of Taq DNA polymerase (Fermentas) combined with 1 buffer for
a final volume of 25 l. The PCR program consisted of an initial denaturation
step at 94°C for 4 min, followed by 35 cycles of denaturation at 94°C
for 30 s, annealing at 58°C for 45 s, and extension at 72°C for 30 s. The final
step was a 10-min extension at 72°C. The amplified products were separated
by electrophoresis with a 1.2% agarose gel and stained with
ethidium bromide.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์คืนในใต้ตา จำนวนแทรกของ pNKGFPส่วนในกลุ่ม 33.1::pNKGFP ได้รับการยืนยันโดยใช้ภาคใต้blotting วิธีการ สำหรับเทคนิคนี้ คลิปปากตะเข้สร้างขึ้น โดย PCR ใช้ไพรเมอร์(PPNKF [5 = CCT TCA TTA CAG AAA CGG C-3 =] และ PPNKRII [5 =-GGT แกทพ้อยท์ GCG TGA TCT แกทพ้อยท์ CC-3 =]) ออกแบบ โดย OligoPerfectโปรแกรมออกแบบ (Invitrogen) ตามลำดับที่ pNKBORไพรเมอร์เหล่านี้ขยายลำดับ 362-bp อยู่ระหว่างการแทรกอเมริกา (ISs) ที่สอดคล้องกับส่วนของยีน Kanr และการนำส่วนของ plasmid Specificity โพรบถูกประเมินโดยใช้ดีเอ็นเอจากสายพันธุ์ plasmids (ตารางที่ 1), และพืช ผสม PCR อยู่ตัวอย่าง 1 ลิตร (10 ng), ไพรเมอร์ 0.2 M PPNKF และ PPNKRIIมม. 3.75 MgCl2, 0.2 mM ส่วนผสมโนซีนไตรฟอสเฟต deoxynucleoside และ2.5 U ของ Taq DNA พอลิเมอเรส (Fermentas) ผสมกับบัฟเฟอร์ 1 สำหรับปริมาตรสุดท้ายของ 25 l ประกอบด้วยโปรแกรม PCR denaturation เป็นต้นขั้นตอนที่ 94° C สำหรับ 4 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของ denaturation ที่ 94° Cสำหรับ 30 s การอบเหนียวที่ 58° C 45 s และส่วนขยายที่ 72° C สำหรับ 30 s สุดท้ายขั้นตอนที่มีส่วนขยายเป็น 10 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียส มีแบ่งผลิตภัณฑ์เอาต์โดย electrophoresis กับ 1.2% agarose เจ และสีด้วยโบรไมด์ ethidium

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ภาคใต้วิเคราะห์ blot จำนวนของการแทรกของ pNKGFP
ส่วนใน 33.1 :: pNKGFP จีโนมได้รับการยืนยันโดยใช้ภาคใต้
ซับ สำหรับเทคนิคนี้ probes ถูกสร้างขึ้นโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์
(PPNKF [5 = -CCT TCA TTA CAG AAA CGG C-3 =] และ PPNKRII [5 = -
GGT GAT GCG TGA TCT GAT CC-3 =]) การออกแบบโดย OligoPerfect
โปรแกรมออกแบบ (Invitrogen) บนพื้นฐานของลำดับ pNKBOR.
ไพรเหล่านี้ขยายลำดับ 362-bp อยู่ระหว่างการแทรก
เว็บไซต์ (ISS) ที่สอดคล้องกับส่วนของยีน Kanr และอนุรักษ์
ส่วนพลาสมิด ความจำเพาะสอบสวนได้รับการประเมินโดยใช้ดีเอ็นเอ
จากสายพันธุ์, พลาสมิด (ตารางที่ 1) และพืช ส่วนผสม PCR มี
1? L ของกลุ่มตัวอย่าง (10 อำเภอ), 0.2 M ไพร PPNKF และ PPNKRII,
3.75 มิลลิ MgCl2, 0.2 มิลลิ deoxynucleoside ส่วนผสม triphosphate และ
2.5 U ของดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq (Fermentas) รวมกับ 1? บัฟเฟอร์สำหรับ
ปริมาณสุดท้ายของ 25? ลิตร โปรแกรม PCR ประกอบด้วย denaturation เริ่มต้น
ขั้นตอนที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาทีตามด้วย 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 ° C
เป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่ 58 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที, และการขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที สุดท้าย
ขั้นตอนที่เป็นส่วนต่อขยาย 10 นาทีที่ 72 ° C ผลิตภัณฑ์ขยายถูกแยกออก
โดย electrophoresis กับ 1.2% agarose เจลและย้อมด้วย
ethidium bromide

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การทำ Southern blot analysis . จำนวนครั้งของ pnkgfp
จำเพาะใน 33.1 : : pnkgfp จีโนมยืนยันใช้ภาคใต้
blotting . สำหรับเทคนิคนี้ จึงถูกสร้างขึ้นโดยวิธี PCR โดยใช้ primers
( ppnkf [ 5 = - CCT TCA ( CAG AAA CGG c-3 = ] และ ppnkrii [ 5 = -
ไม่รับ gcg TGA TCT GAT cc-3 = ] ) ออกแบบโดยโปรแกรม oligoperfect
ออกแบบ ( Invitrogen ) บนพื้นฐานของ pnkbor
ลำดับไพรเมอร์เหล่านี้ขยายลำดับ 362 BP อยู่ระหว่างการแทรก
เว็บไซต์ ( ISS ) ที่สอดคล้องกับส่วนของ kanr ยีนและศึกษา
พลาสมิดเบส . ตรวจประเมินการตรวจหาดีเอ็นเอ
จากสายพันธุ์ ) ( ตารางที่ 1 ) และพืช pcr ส่วนผสมที่มีอยู่
1  L ของตัวอย่าง ( 10 กรัม ) 0.2 M และไพรเมอร์ ppnkf ppnkrii
3.75 มม. , ชุด , 0 .2 mm deoxynucleoside ไตรฟอสเฟตผสมและ
2.5 U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ทัค ( fermentas ) รวมกับ 1  บัฟเฟอร์สำหรับ
ปริมาตรสุดท้ายของ 25  ล. โดยโปรแกรมประกอบด้วยขั้นเริ่มต้นที่ 94 ° C (
4 นาที ตามด้วย 35 รอบ ที่ 94 ° C (
3 s การอบอ่อนที่ 58 องศา C , 45 , และส่วนขยายที่ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที ขั้นตอนสุดท้าย
เป็น 10 นาทีที่ 72 องศา ขยายการขยายผลิตภัณฑ์แยก
โดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีส ด้วยเจลหรือ 1.2% และเปื้อนด้วย
ทิเดียมโบรไมด์ .