Enucleation, Microinjection and Fus

Enucleation, Microinjection and Fusion was
performed as previously described (Parnpai et al.,
1999). Briefly, cumulus cells were removed from
oocytes at 19-20 h post maturation (hpm) by gentle
pipetting in 0.1% hyaluronidase in DPBS and washed
4 times with Hepes-buffered TCM 199 supplemented
with 20% FCS (H 199-20). Matured oocytes
were enucleated in H 199-10 containing 7.5 μg/ml
cytochalasin B by micromanipulation under inverted
microscope. Enucleation was confirmed by staining
the removed portion with 5 μg/ml Hoechst 33342
and examined under an epifluorescence microscope.
After enucle-ation, the cytoplasts were washed 4
times with H 199-20 and kept in this medium until
injection of the donor cells.Individual donor cells
(diameter 14-16 μm) were inserted into perivitelline
space of recipient cytoplasts in H 199-10 by micromanipulation
under an inverted microscope.
The couplets were fused at 24-26 hpm by placing
individual couplet between a pair of electrodes to
electrostimulate (BTX 200, Sandiego, CA) with two
DC pulses of 30 V/couplet for 15 μsec each time in
Zimmermann fusion medium supplemented with
0.01% BSA. After electrical stimulus, the reconstructed
embryos were washed 4 times with H
199-20 and kept in this medium for 30 minutes then
checked the success of fusion.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Enucleation, Microinjection และฟิวชั่นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้เป็น ดำเนินการ (Parnpai et al.,1999) กันสั้น ๆ เซลล์ลัสถูกเอาออกจากแช่สารละลายที่ 19-20 h ลงพ่อแม่ (hpm) เบาpipetting ใน hyaluronidase 0.1% ใน DPBS และหินครั้งที่ 4 กับ Hepes buffered TCM 199 เสริมมี 20% FCS (H 199-20) แช่สารละลาย maturedมี enucleated ใน H 199-10 ประกอบด้วย μg 7.5 mlกลับ cytochalasin B โดย micromanipulation ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ Enucleation ได้รับการยืนยัน โดยการย้อมสีส่วนที่เอากับ μg 5 ml อย่างไร Hoechst 33342และกล่าวถึงภายใต้กล้องจุลทรรศน์การ epifluorescenceหลังจาก enucle-ation, cytoplasts ถูกล้าง 4เท่ากับ H 199-20 และเก็บไว้ในสื่อประเภทนี้จนถึงการฉีดเซลล์ผู้บริจาค ผู้บริจาคแต่ละเซลล์(เส้นผ่าศูนย์กลาง 14-16 μm) ถูกแทรก perivitellineพื้นที่ของผู้รับ cytoplasts ใน H 199-10 โดย micromanipulationภายใต้กล้องจุลทรรศน์การกลับCouplets ถูก fused ที่ 24-26 hpm ด้วยcouplet ละระหว่างคู่หุงตเพื่อelectrostimulate (BTX 200, Sandiego, CA) กับสองDC พัลส์ของ V 30 couplet สำหรับ 15 μsec ทุกครั้งZimmermann ฟิวชั่นกลางเสริมด้วย0.01% บีเอสเอ หลังจากกระตุ้นไฟฟ้า ที่สร้างขึ้นใหม่โคลนถูกล้าง 4 ครั้ง ด้วย H199-20 และเก็บไว้ในนี้แล้ว 30 นาทีตรวจสอบความสำเร็จของการหลอมเหลว

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Enucleation, Microinjection และฟิวชั่นได้รับการ
ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (Parnpai et al.,
1999) สั้น ๆ , เซลล์คิวมูลัสออกจาก
เซลล์ไข่ที่ 19-20 ชั่วโมงการเจริญเติบโตที่โพสต์ (HPM) โดยอ่อนโยน
ปิเปตใน 0.1% hyaluronidase ใน DPBS และล้าง
4 ครั้งด้วย HEPES บัฟเฟอร์ TCM 199 เสริม
20% FCS (H 199-20) ไข่สุก
ถูก enucleated ใน H 199-10 ที่มี 7.5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร
cytochalasin B โดย micromanipulation ภายใต้คว่ำ
กล้องจุลทรรศน์ Enucleation รับการยืนยันจากการย้อมสี
ส่วนออก 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร Hoechst 33342
และตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence.
หลังจาก enucle-ation, cytoplasts ถูกล้าง 4
ครั้งด้วย H 199-20 และเก็บไว้ในสื่อนี้จนกว่า
การฉีดเซลล์ของผู้บริจาค ผู้บริจาคเซลล์ส่วนบุคคล
(เส้นผ่าศูนย์กลาง 14-16 ไมครอน) ถูกใส่เข้าไปใน perivitelline
พื้นที่ cytoplasts ผู้รับ H 199-10 โดย micromanipulation
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์คว่ำ.
กลอนหลอมรวมที่ 24-26 HPM โดยการวาง
แต่ละคู่ระหว่างคู่ของขั้วไฟฟ้าเพื่อ
electrostimulate (BTX 200 Sandiego, CA) ที่มีสอง
พัลส์ DC 30 V / คู่ 15 μsecเวลาในแต่ละ
กลางฟิวชั่นซิมเมอเสริมด้วย
0.01% บีเอสเอ หลังจากการกระตุ้นไฟฟ้าใหม่
ตัวอ่อนถูกล้าง 4 ครั้งด้วย H
199-20 และเก็บไว้ในสื่อนี้เป็นเวลา 30 นาทีจากนั้น
การตรวจสอบความสำเร็จของฟิวชั่น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ควักลูกตาไปแล้ว และมีการผสมไมโครอินเจคชันตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (

parnpai et al . , 1999 ) สั้น , Cumulus เซลล์ถูกถอดออกจาก
ไข่ 19-20 H โพสต์การเจริญเติบโต ( hpm ) โดยอ่อนโยน
pipetting ใน 0.1% ไฮอะลูโรนิเดสใน dpbs และล้าง
4 ครั้งกับฮีเปสใน TCM 199 เสริม
20 % FCS ( H 199-20 ) ผู้ใหญ่ oocytes
ถูก enucleated ใน H 199-10 ที่มี 7.5 μ g / ml
cytochalasin B โดย micromanipulation คว่ำ
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พิสมัยที่ได้รับการยืนยันโดยการเอาส่วนμ
5 g / ml Hoechst 33342
และตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence .
หลังจาก enucle ation , โอโอไซต์ได้ซัก 4
ครั้งกับ H 199-20 และเก็บไว้ในสื่อนี้จนกว่า
ฉีดเซลล์แต่ละเซลล์
ผู้บริจาค( เส้นผ่าศูนย์กลาง 14-16 μ M ) ถูกแทรกลงในพื้นที่ perivitelline
ของผู้รับโดยใช้โอโอไซต์ใน H 199-10 โดย micromanipulation

กลับใต้กล้องจุลทรรศน์ couplets เป็นฟิวส์ที่ 24-26 hpm โดยวาง
โคลงบุคคลระหว่างคู่ของขั้วไฟฟ้า

electrostimulate ( บีทีเ กซ์ 200 , Sandiego , CA ) 2
DC พัลส์ของ 30 V / โคลง 15 μวินาทีในแต่ละครั้ง
ซิมเมอร์มันน์ ฟิวชั่น อาหารสูตร MS ที่เสริมด้วย
001 % BSA . หลังจากกระตุ้นไฟฟ้า , ข้อมูล
ตัวอ่อนถูกล้าง 4 ครั้งกับ H
199-20 และเก็บไว้ในสื่อนี้เป็นเวลา 30 นาทีจากนั้น
ตรวจสอบความสำเร็จของฟิวชั่น