30 s, 55°C for 30 s, and 72°C for 3

30 s, 55°C for 30 s, and 72°C for 30 s, followed by a final extension at 72°C for 7 min. For 2-step PCR, the above conditions were used except that in the second round of amplification, 0.5 µl of the reaction mixture from the first round was used as the template, and the primers used were designed to anneal within the amplicons from the first round. The amplified products were ana- lyzed by 1% agarose gel electrophoresis. Nucleotide sequence determination. The PCR prod- ucts were purified by agarose gel electrophoresis using a Prep-A-Gene DNA Purification System (Bio- Rad Laboratories) and cloned into TOPO-TA (Invitro- gen) according to the manufacturer’s instructions. Each clone was sequenced using a Big Dye Terminator Cycle DNA Sequencing Kit (ABI PRISM, PE Applied Biosystems) and an automatic sequencer. All nucleo- tide sequences and their deduced primary sequences were compared by alignment using the MACAW pro- gram (Version 2.0.5, National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health). Viral stability. The infected spleen homogenates were used to assess the stability of the viruses in sea- water and freshwater. The filtered spleen homo- genates were added to 10 ml of filtered seawater or freshwater (corresponding to infected spleen 1 mg ml–1) and incubated for 4 d at 25°C. To determine filtra- tion effects, 10 mg homogenates in 1 ml of PBS (0.1 M [pH 7.2]) were prepared before and immediately after filtration (before filtration and Day 0, respectively). Viral stability was evaluated by real-time PCR and by viral challenge. Real-time PCR: Total genomic DNA was extracted from tissue homogenates prepared before filtration, on Day 0, and on Day 4 from fish incubated at 25°C in sea- water or freshwater using an AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer) and quantitated using the
Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Reagent and Kit (Invitrogen) according to the manufacturer’s instruc- tions. To quantify the iridoviral DNA present in the homogenate, real-time PCR was performed using a Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) according to the manufacturer’s instructions. The reaction mixture con- tained 1× Eva Green dye, 1× PCR buffer (10 mM Tris- HCl [pH 8.3] and 50 mM KCl), 2.5 mM MgCl2, 0.3 mM dNTPs, 0.5 pM each primer, 2.5 U of Taq DNA Poly- merase, and 1 µg of template DNA in a total volume of 20 µl. The amplification conditions were as follows: 94°C for 10 min followed by 40 cycles at 94°C for 10 s, 52°C for 15 s, and 72°C for 20 s. No evidence of non- specific amplification was found. As a positive control, recombinant TOPO-TA containing 166 bp from the MCP gene amplified using the primers MR1F (5’- AGATGATTGGCATGCGCAGC-3’) and MR1R (5’- AGCTTGAAGTGGATGCGCAC-3’) was purified from transformed Escherichia coli DH5α. A serial 10-fold dilution of the control plasmid (5.0 × 109 to 5.0 × 101 copies µl–1) was used to establish a standard curve. The standard curve, which was generated using the mean data from experiments performed in triplicate, indi- cated a good linear relationship between the threshold cycle (CT) value and the logarithmic plasmid concen- tration (data not shown). Viral challenge: Fifteen rock bream were chal- lenged by IP injection with 0.1 ml of the PGIV-SP or IVS-1-infected tissue homogenates (corresponding to 100 µg infected spleen per fish) which were incubated at 25°C for 0, 1, 2, 3, and 4 d in seawater or freshwater before injection. Sterile PBS (0.1 ml [pH 7.2]) was also injected intraperitoneally into 15 other rock bream and pearl gourami as negative controls. After the chal- lenge, 22 groups of fish were each maintained at 25°C in a 40 l tank for 3 wk. The water was changed daily

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

s, 55° C สำหรับ 30 30 s และ 72° C สำหรับ 30 s ตาม ด้วยส่วนขยายที่ 72° C สำหรับ 7 นาทีสุดท้าย สำหรับ PCR ขั้นตอนที่ 2 เงื่อนไขข้างต้นได้ใช้ยกเว้นว่าในรอบสองของขยาย 0.5 µl ของผสมปฏิกิริยาจากรอบแรกถูกใช้เป็นแม่แบบ และไพรเมอร์ที่ใช้ถูกออกแบบมาเพื่อหลอมแบบภายใน amplicons จากรอบแรก ผลิตภัณฑ์เอาต์มีอานา lyzed โดย electrophoresis เจล 1% agarose การกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ PCR ผลิต-ucts บริสุทธิ์ โดย agarose เจ electrophoresis ใช้ระบบฟอก DNA เตรียม-A-ยีน (ไบ - Rad ห้องปฏิบัติการ) และโคลนลงในตาเดิน (Invitro gen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต แต่ละโคลนถูกเรียงลำดับการใช้ sequencer การอัตโนมัติขนาดใหญ่ย้อมเทอร์มิเนเตอร์วงจร DNA ลำดับเบสชุด (ปริซึม ABI, Biosystems ใช้ PE) ลำดับ nucleo น้ำทั้งหมดและลำดับของหลัก deduced ได้เปรียบเทียบตามตำแหน่งที่ใช้โปรขนาดกรัมจากมาร์คอว์ (เวอร์ชัน 2.0.5 ศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ สถาบันสุขภาพแห่งชาติ) เสถียรภาพที่ไวรัส Homogenates ม้ามที่ติดไวรัสถูกใช้เพื่อประเมินความมั่นคงของไวรัส ใน น้ำทะเล และน้ำจืด กรองม้ามตุ๊ด-genates เพิ่ม 10 ml กรองน้ำทะเล หรือน้ำจืด (ที่สอดคล้องกับม้ามติดไวรัสมิลลิกรัม 1 มล. – 1) และ incubated สำหรับ 4 วันที่ 25 องศาเซลเซียส เพื่อกำหนดลักษณะพิเศษของสเตรชัน filtra, homogenates 10 mg ใน 1 ml ของ PBS (0.1 M [pH 7.2]) ได้เตรียมพร้อมก่อน และ หลังการกรองทันที (ก่อนวัน 0 และเครื่องกรองตามลำดับ) มีประเมินเสถียรภาพไวรัส โดย PCR แบบเรียลไทม์ และท้าทายไวรัส PCR แบบเรียลไทม์: รวม genomic DNA ถูกสกัดจากเนื้อเยื่อ homogenates เตรียมก่อนกรอง ในวันที่ 0 และ 4 วันจากปลา incubated ที่ 25° C ในน้ำทะเล หรือน้ำจืดโดยใช้การ AccuPrep Genomic DNA แยกชุด (Bioneer) และ quantitated โดยใช้การQuant iTTM PicoGreen ® dsDNA รีเอเจนต์และชุด (Invitrogen) ตามของผู้ผลิต instruc-tions วัดปริมาณ iridoviral ใน homogenate ดีเอ็นเอ PCR แบบเรียลไทม์ที่ทำใช้เป็น 6000 ใบพัดยีน (คอร์เบตต์วิจัย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สีย้อมปฏิกิริยาผสมคอน - tained 1 ×อีวากรีน บัฟเฟอร์ PCR × 1 (10 มม.ตรี-HCl [pH 8.3] และ 50 mM KCl), 2.5 มม. MgCl2, 0.3 มม. dNTPs, 0 17.00 น.แต่ละพื้น 2.5 ของ Taq ดีเอ็นเอโพลียู merase และ 1 ไมโครกรัมเป็นเครื่องแม่แบบดีเอ็นเอในปริมาณผลรวมของ 20 µl ขยายเงื่อนไขได้ดังนี้: 94° C สำหรับ 10 นาทีตาม ด้วยรอบ 40 ที่ 94° C 10 s, 52° C 15 s และ 72° C สำหรับ 20 s พบความไม่เฉพาะเจาะจงขยาย เป็นตัวควบคุมบวก recombinant เดินตาประกอบด้วย 166 bp จากยีน MCP ขยายโดยใช้ไพรเมอร์ MR1F (5'-AGATGATTGGCATGCGCAGC-3') และ MR1R (5'-AGCTTGAAGTGGATGCGCAC-3') ที่บริสุทธิ์จากแปร Escherichia coli DH5α การเจือจาง 10-fold ประจำของ plasmid ควบคุม (สำเนา 5.0 × 109 การ 5.0 × 101 µl – 1) ถูกใช้เพื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน โค้งมาตรฐาน ซึ่งถูกสร้างขึ้นโดยใช้ข้อมูลเฉลี่ยจากการทดลองทำใน cated indi triplicate ความสัมพันธ์เชิงเส้นดีระหว่างค่าขีดจำกัดรอบ (CT) plasmid ลอการิทึม concen-tration (ข้อมูลไม่แสดง) ไวรัสความท้าทาย: หินทรายแดงที่ห้าถูก chal-lenged โดยฉีด IP ด้วย 0.1 ml ของ PGIV SP หรือ IVS-1-ติดเชื้อเนื้อเยื่อ homogenates (ตรงกับ 100 ไมโครกรัมเป็นเครื่องที่ติดไวรัสม้ามต่อปลา) ซึ่ง incubated ที่ 25° C 0, 1, 2, 3 และ 4 วันในทะเล หรือน้ำจืดก่อนฉีด กอซ PBS (0.1 มล [pH 7.2]) ยังฉีด intraperitoneally เป็นหินทรายแดงและปลากระดี่มุก 15 อื่น ๆ เป็นตัวควบคุมค่าลบ หลัง chal-lenge, 22 กลุ่มปลามีแต่ละการบำรุงรักษาที่ 25° C ในถัง 40 l 3 wk เปลี่ยนน้ำทุกวัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

30 , 55 ° C เป็นเวลา 30 วินาที กับ 72 ° C เป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาที วิธี PCR 2 ขั้นตอน เงื่อนไขข้างต้นถูกใช้เพียงในรอบที่สองของการเพิ่มปริมาณ 0.5 ลิตรµปฏิกิริยาผสมจากรอบแรกที่ถูกใช้เป็นแม่แบบ และไพรเมอร์ที่ใช้ถูกออกแบบมาเพื่อหลอมภายใน amplicons จากรอบแรกการขยายผลิตภัณฑ์สู่ lyzed 1% , เจล การหาลำดับเบส . แยง ucts pcr - ได้ทำให้บริสุทธิ์โดยวิธีเจล ( ใช้ prep-a-gene ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ระบบ ( ห้องปฏิบัติการ Bio - Rad ) และโคลนเข้า topo-ta ( invitro - Gen ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตแต่ละโคลนคือลำดับการใช้สีย้อม Terminator รอบใหญ่ดีเอ็นเอ Kit ( ABI ปริซึม , PE Applied Biosystems ) และซีเควนอัตโนมัติ . - ลำดับนิวคลีโอทั้งหมด ไทด์ และอนุมานเปรียบเทียบหลักลำดับโดยการใช้โปรแกรมมาคอว์ ( รุ่น 2.0.5 แห่งชาติ , ศูนย์สารสนเทศเทคโนโลยีชีวภาพ สถาบันสุขภาพแห่งชาติ ) เสถียรภาพของไวรัสการ homogenates ม้ามที่ติดเชื้อถูกใช้เพื่อประเมินความมั่นคงของไวรัสในทะเล - น้ำและปลา กรองม้ามโฮโม - genates เพิ่ม 10 มล. กรองน้ำเค็มหรือน้ำจืด ( 1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรที่ติดเชื้อม้าม– 1 ) บ่ม 4 D ที่ 25 องศา เพื่อตรวจสอบ filtra , ผล , 10 มิลลิกรัมต่อ 1 มิลลิลิตร homogenates พีบีเอส ( 0.1 M [ pH 72 ) เตรียมก่อนกรองก่อนกรองและ 0 ตามลำดับ ) การประเมินโดยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ของไวรัสโดยไวรัสและความท้าทาย เวลาจริงโดย : รวมจีโนมดีเอ็นเอจากเนื้อเยื่อ homogenates เตรียมก่อนการกรอง ในวันที่ 0 ,และในวันที่ 4 จากปลาที่อุณหภูมิ 25 ° C ในทะเล - น้ำจืดน้ำหรือใช้ accuprep genomic DNA ที่สกัด Kit ( bioneer ) และผ่านการใช้สารเคมี®
QUANT ittm picogreen dsdna และชุด ( Invitrogen ) ตามของผู้ผลิต instruc - ยินดีด้วย . ที่มีปริมาณ iridoviral ดีเอ็นเออยู่ใน ,PCR แบบเรียลไทม์ได้วิเคราะห์โดยใช้ใบพัดยีน 6000 ( Corbett Research ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ปฏิกิริยาผสมคอน - tained 1 × Eva สีเขียวย้อม บัฟเฟอร์ PCR 1 × ( 10 มม. นอกจากนี้ กรดไฮโดรคลอริก pH 8.3 - [ ] และ 50 mm . ) , MgCl2 2.5 มม. , 0.3 มม. dntps 0.5 น. แต่ละคู่ 2.5 U ของโพลิดีเอ็นเอ - ทัค merase และ 1 กรัมของµแม่แบบดีเอ็นเอในหมวดทั้งหมด 20 µ Lเงื่อนไขการขยายมีดังนี้ : 94 ° C เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วย 40 รอบที่ 94 ° C 10 s 52 ° C เป็นเวลา 15 วินาที กับ 72 ° C เป็นเวลา 20 วินาที ไม่มีหลักฐานที่ไม่ใช่แบบเฉพาะเจาะจง พบ เป็นตัวควบคุมบวกรีคอมบิแนนท์ topo-ta ที่มี 166 BP จาก MCP ของยีนโดยใช้ไพรเมอร์ mr1f ( 5 ' - agatgattggcatgcgcagc-3 ' ) และ mr1r ( 5 ' - agcttgaagtggatgcgcac-3 ' ) บริสุทธิ์จากแปลง Escherichia coli DH5 α . หมายเลข 10 เท่า ( ของพลาสมิด ควบคุม ( 5.0 × 109 5.0 × 101 เล่มµแอล– 1 ) ถูกใช้ในการสร้างกราฟมาตรฐาน เส้นโค้งมาตรฐานซึ่งถูกสร้างขึ้น โดยใช้ข้อมูลเฉลี่ยจากการทดลองทั้งสามใบ indi - ตั้งอยู่ที่ดี , ความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างวงจรธรณีประตู ( CT ) ค่า และ concen - พลาสลอการิทึมมลภาวะ ( ข้อมูลไม่แสดง ) ไวรัสท้าทาย 15 แดงร็อคค่ะ - lenged โดยฉีด IP กับ 01 มิลลิลิตรของ pgiv-sp หรือ ivs-1-infected homogenates เนื้อเยื่อ ( สอดคล้องกับ 100 กรัมต่อปลาติดเชื้อµม้าม ) ที่อุณหภูมิ 25 ° C เป็นเวลา 0 , 1 , 2 , 3 , และ 4 D ในน้ำทะเลหรือน้ำจืดก่อนฉีด พีบีเอสเป็นหมัน ( 0.1 ml [ pH 7.2 ) ก็ฉีดต่อการเข้า 15 แดงหินอื่น ๆและสายรัดข้อมือเป็นตัวควบคุมลบ หลังจาก lenge ฉล - ,22 กลุ่มของปลาแต่ละคนไว้ที่ 25 ° C ในถัง 40 ลิตร สำหรับ 3 สัปดาห์ . น้ำเปลี่ยนทุกวัน