2.3. Sample collection and analyses

2.3. Sample collection and analyses
At the beginning of the experiment 10 fish were sampled and stored at −20 °C for analysis of initial whole-body proximate composition. At the end of the feeding trial, all the fish in each tank were bulk-weighed and counted for calculation of growth parameters and survival. Six intact fish per tank (18 fish per treatment) were selected and kept at −20 °C for whole-body and muscle composition analysis (three fish per tank for each analysis). Three fish per tank were randomly captured, anesthetized with 2-phenoxyethanol (200 mg l−1), and blood samples were collected from the caudal vein with heparinized syringes for determination of hematocrit, hemoglobin and respiratory burst activity. After the abovementioned measurements with whole blood, plasma was separated by centrifugation at 5000 ×g for 10 min and stored at −70 °C for determination of total immunoglobulin (Ig) level and blood biochemical parameters including plasma total protein, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), glucose, cholesterol and triglyceride. Another set of blood samples (3 fish per tank) were taken without heparin and allowed to clot at room temperature for 30 min. Then, the serum was separated by centrifugation for 10 min at 5000 ×g and stored at −70 °C for the analysis of total nitric oxide synthase (T-NOS), lysozyme, myeloperoxidase (MPO), superoxide dismutase (SOD) and antiprotease activities.
Analyses of moisture and ash contents of diet and whole-body samples were performed by the standard procedures (AOAC, 1995). Crude protein was measured by using automatic Kjeltec Analyzer Unit 2300 (FossTecator, Höganäs, Sweden) and crude lipid was determined using the Soxhlet method with extraction in diethyl ether (Soxhlet Extraction System C-SH6, Seoul, Korea). Amino acid composition of the experimental diets was determined using an automated amino acid analyzer (Beckman 7300, Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Hematocrit was determined by microhematocrit technique (Brown, 1980). Hemoglobin and plasma levels of total protein, glucose, cholesterol and triglyceride and activities of ALT and AST were determined by an automated blood analyzer (SLIM, SEAC Inc., Florence, Italy).
Oxidative radical production by phagocytes during respiratory burst was measured through NBT (nitro-blue-tetrazolium) assay described by Anderson and Siwicki (1995). Briefly, blood and NBT (0.2%) (Sigma, St. Louis, MO, USA) were mixed in equal proportion (1:1) and incubated for 30 min at room temperature. Then 50 μl was taken out and dispensed into glass tubes. One milliliter of dimethylformamide (Sigma) was added and centrifuged at 2000 ×g for 5 min. Finally, the optical density of supernatant was measured at 540 nm using a spectrophotometer (Genesys 10UV, Rochester, NY, USA). Dimethylformamide was used as the blank.
Plasma Ig level was determined according to the method described by Siwicki and Anderson (1993). Briefly, plasma total protein concentration was measured using a micro-protein determination method (C-690; Sigma), prior to and after precipitating down the Ig molecules using a 12% solution of polyethylene glycol (Sigma). The difference in protein concentration represents the Ig content.
A turbidimetric assay was used for determination of serum lysozyme level by the method described by Hultmark (1980) with slight modifications. Briefly, Micrococcus lysodeikticus (0.75 mg ml−1) was suspended in sodium phosphate buffer (0.1 M, pH 6.4), 200 μl of suspension was placed in each well of 96-well plates, and 20 μl serum was added subsequently. The reduction in absorbance of the samples was recorded at 570 nm after incubation at room temperature for 0 and 30 min in a microplate reader (UVM 340, Biochrom, Cambridge, UK). A reduction in absorbance of 0.001 min−1 was regarded as one unit of lysozyme activity.
MPO activity was measured according to Quade and Roth (1997). Briefly, 20 μl of serum was diluted with HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) without Ca2 or Mg2+ (Sigma, USA) in 96-well plates. Then, 35 μl of 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine hydrochloride (TMB, 20 mM) (Sigma, USA) and H2O2 (5 mM) was added. The color change reaction was stopped after 2 min by adding 35 μl of 4 M sulfuric acid. Finally, the optical density was read at 450 nm in a microplate reader.
SOD activity was measured by the percentage reaction inhibition rate of enzyme with WST-1 (Water Soluble Tetrazolium dye) substrate and xanthine oxidase using a SOD Assay Kit (Sigma, 19160) according to the manufacturer's instructions. Each endpoint assay was monitored by absorbance at 450 nm (the absorbance wavelength for the colored product of WST-1 reaction with superoxide) after 20 min of reaction time at 37 °C. The percent inhibition was normalized by mg protein and presented as SOD activity units.
Serum antiprotease activity was measured according to the method described by Ellis et al. (1990), with slight modifications (MagnadóttirTable 3et al., 1999). Briefly, 20 μl of serum was incubated with 20 μl of standard trypsin solution (Type II-S, from porcine pancreas, 5 mg ml−1, SigmaAldrich) for 10 min at 22 °C. Then, 200 μl of phosphate buffer (0.1 M, pH 7.0) and 250 μl azocasein (2%) (Sigma) were added and incubated for 1 h at 22 °C. Five hundred microliters of trichloroacetic acid (10%) was added and further incubated for 30 min at 22 °C. The mixture was centrifuged at 6000 ×g for 5 min and 100 μl of the supernatant was transferred to the wells of a 96 well flat bottomed microplate containing 100 μl of 1 N NaOH. Optical density was read at 430 nm. For a 100% positive control, buffer replaced the serum, while for the negative control buffer replaced both serum and trypsin. The trypsin inhibition percentage was calculated using the following equation: Trypsininhibitionð Þ ¼% ðA1–A2=A1Þ 100
where A1 = control trypsin activity (without serum); A2 = trypsin activity remained after adding serum.
Serum total nitric oxide synthase (T-NOS) activity was measured using a commercial kit (Calbiochem-Novabiochem Corporation, USA). The principle of this assay is based on the measurement of NO2 produced in the sample. Nitrate reductase is utilized for the enzymatic reduction of nitrate to nitrite. Spectrophotometric quantitation of nitrite is performed using Griess Reagents, where nitrite is converted to nitrous acid (HNO2), which diazotizes sulfanilamide. This sulfanilamidediazonium salt is then reacted with N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine to produce a chromophore which is measured at 540 nm.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การเก็บและวิเคราะห์ตัวอย่างเมื่อเริ่มต้นทดลอง ปลา 10 มีตัวอย่าง และเก็บไว้ที่ −20 ° C สำหรับการวิเคราะห์องค์ประกอบเคียงร่างกายทั้งหมดเริ่มต้น เมื่อสิ้นสุดการทดลองให้อาหาร ปลาทั้งหมดในแต่ละถังมี น้ำหนักจำนวนมาก และนับสำหรับการคำนวณพารามิเตอร์การเจริญเติบโตและอยู่รอด ปลาหกเชื่อมต่อถัง (18 ปลาต่อรักษา) ได้เลือก และเก็บไว้ที่ −20 ° C สำหรับทั้งร่างกายและกล้ามเนื้อส่วนประกอบวิเคราะห์สามปลาต่อถังสำหรับแต่ละการวิเคราะห์) ปลาสามต่อถังถูกสุ่ม จับ ด้วยกับ 2 phenoxyethanol (l−1 200 mg), และตัวอย่างเลือดที่ถูกเก็บรวบรวมจากหลอดเลือดดำ caudal ด้วยเข็มฉีดยา heparinized สำหรับความมุ่งมั่นของ hematocrit ฮีโมโกลบิน และกิจกรรมระเบิดทางเดินหายใจ หลังจากการประเมินดังกล่าวข้างต้นมีทั้งเลือด พลาสมาถูกคั่น ด้วย centrifugation ที่ 5000 × g สำหรับ 10 นาที และเก็บไว้ที่ −70 ° C สำหรับกำหนดรวม immunoglobulin (Ig) ระดับเลือดชีวเคมีพารามิเตอร์และพลาสมาโปรตีนรวม อะลานีน aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), กลูโคส ไขมัน และไตรกลีเซอไรด์ ชุดอื่นอย่างเลือด 3 ปลาต่อถัง) ได้มาไม่ มีเฮพาริน และอนุญาตให้ clot ที่อุณหภูมิห้องสำหรับ 30 นาที แล้ว เซรั่มถูกคั่น ด้วย centrifugation ใน 10 นาทีที่ 5000 × g และเก็บไว้ที่ −70 ° C สำหรับการวิเคราะห์ของไนตริกออกไซด์รวม synthase (T-NOS), lysozyme, myeloperoxidase (MPO), ซูเปอร์ออกไซด์ dismutase (SOD) และกิจกรรม antiproteaseวิเคราะห์ความชื้นและเถ้าเนื้อหาของตัวอย่างอาหารและร่างกายทั้งหมดได้ดำเนินการตามขั้นตอนมาตรฐาน (AOAC, 1995) โปรตีนหยาบถูกวัด โดยใช้หน่วยการวิเคราะห์ Kjeltec อัตโนมัติ 2300 (FossTecator, Höganäs สวีเดน) และไขมันดิบถูกกำหนดด้วยวิธี Soxhlet สกัดใน diethyl อีเทอร์ (Soxhlet สกัดระบบ C-SH6 โซล เกาหลี) กรดอะมิโนส่วนประกอบของอาหารทดลองที่ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติกรดอะมิโน (Beckman 7300 เครื่องมือ Beckman ดัลลัส CA) Hematocrit ที่ถูกกำหนด โดยเทคนิค microhematocrit (สีน้ำตาล 1980) ระดับฮีโมโกลบินและพลาสมาโปรตีนรวม กลูโคส ไขมัน และไตรกลีเซอไรด์และกิจกรรมของ ALT และ AST ถูกกำหนด โดยการวิเคราะห์เลือดอัตโนมัติ (SLIM, SEAC Inc. ฟลอเรนซ์ อิตาลี)Oxidative รุนแรงผลิต โดย phagocytes ระหว่างหายใจระเบิดถูกวัดผ่านเอ็นบีที (nitro บลู tetrazolium) ทดสอบโดยแอนเดอร์สันและ Siwicki (1995) สั้น ๆ เลือดและเอ็นบีที (0.2%) (ซิก St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ถูกผสมกันในสัดส่วนเท่ากัน (1:1) และ incubated สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง แล้ว 50 μl ถูกนำออกมา และคำลงในหลอดแก้ว หนึ่ง milliliter ของ dimethylformamide (ซิกมา) ถูกเพิ่ม และ centrifuged ที่ 2000 × g ใน 5 นาที สุดท้าย มีวัดความหนาแน่นออปติคัลของ supernatant ที่ 540 nm โดยใช้เครื่องทดสอบกรดด่าง (Genesys 10UV โรเชสเตอร์ NY สหรัฐอเมริกา) Dimethylformamide ถูกใช้เป็นว่างเปล่าระดับพลาสมา Ig ได้กำหนดตามวิธีการอธิบายไว้ โดย Siwicki และแอนเดอร์สัน (1993) สั้น ๆ พลาสมาโปรตีนรวมความเข้มข้นที่วัดได้โดยใช้วิธีกำหนดโปรตีนไมโคร (C-690 ซิก), ก่อน และ หลังปัจจัยลงโมเลกุล Ig ที่ใช้แก้ไขปัญหา 12% ของ polyethylene glycol (ซิกมา) ความแตกต่างของความเข้มข้นของโปรตีนแสดงเนื้อหา Igทดสอบ turbidimetric ถูกใช้สำหรับการกำหนดระดับ lysozyme ซีรั่ม โดยวิธีการอธิบายไว้ โดย Hultmark (1980) มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ รำ lysodeikticus (0.75 มิลลิกรัม ml−1) ถูกระงับในโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 6.4), μl 200 ของระบบกันสะเทือนถูกวางในแต่ละดีดี 96 แผ่น และซีรั่ม μl 20 ถูกเพิ่มในภายหลัง การลดใน absorbance ของตัวอย่างบันทึกที่ 570 nm หลังจากบ่มที่อุณหภูมิห้อง 30 นาทีในอ่าน microplate (UVM 340, Biochrom เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) และ 0 ลด absorbance ของ 0.001 min−1 ถูกถือว่าเป็นหน่วยหนึ่งของ lysozyme กิจกรรมกิจกรรม MPO ถูกวัดตาม Quade รอด (1997) สั้น ๆ μl 20 ของเซรั่มที่ผสมกับ HBSS (แฮงส์สมดุลเกลือโซลูชั่น) โดย Ca2 หรือ Mg2 + (ซิก สหรัฐอเมริกา) ในแผ่น 96-ดี นั้น μl 35 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine ไฮโดรคลอไรด์ (ทหารไทย 20 มม.) (ซิก สหรัฐอเมริกา) และ H2O2 เพิ่ม (5 mM) ปฏิกิริยาเปลี่ยนสีถูกหยุดลงหลังจาก 2 นาที โดยการเพิ่ม μl 35 ของกรดซัลฟิวริก 4 เมตร ในที่สุด ถูกอ่านความหนาแน่นออปติคัลที่ 450 nm ใน microplate อ่านกิจกรรมสดถูกวัด โดยอัตราการยับยั้งปฏิกิริยาเปอร์เซ็นต์ของเอนไซม์กับ WST-1 (น้ำละลาย Tetrazolium ย้อม) พื้นผิวและ xanthine oxidase โดยใช้ชุดทดสอบสด (ซิก 19160) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต วิเคราะห์แต่ละปลายทางถูกตรวจสอบ โดย absorbance ที่ 450 nm (absorbance ความยาวคลื่นสำหรับผลิตภัณฑ์สีของ WST 1 ปฏิกิริยากับซูเปอร์ออกไซด์) หลังจาก 20 นาทีของเวลาปฏิกิริยาที่ 37 องศาเซลเซียส เปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเปลี่ยนตามปกติ โดยมิลลิกรัมโปรตีน และแสดงเป็นสดกิจกรรมหน่วยเซรั่ม antiprotease กิจกรรมถูกวัดตามวิธีการอธิบายไว้โดยเอลลิสและ al. (1990), มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (MagnadóttirTable 3et al., 1999) สั้น ๆ μl 20 ของซีรั่มเป็น incubated กับ μl 20 ของทริปซินมาตรฐาน (ชนิด II-S จากช่วงตับอ่อน ml−1 5 มิลลิกรัม SigmaAldrich) ใน 10 นาทีที่ 22 องศาเซลเซียส แล้ว 200 μl ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M ค่า pH 7.0) และ 250 μl azocasein (2%) (ซิกมา) เพิ่ม และ incubated สำหรับ h 1 ที่ 22 องศาเซลเซียส Microliters ห้าร้อยของกรด trichloroacetic (10%) เพิ่ม และ incubated เพิ่มเติม ใน 30 นาทีที่ 22 องศาเซลเซียส ส่วนผสมถูก centrifuged ที่ 6000 × g สำหรับ 5 นาที และ μl 100 ของ supernatant จะถูกโอนย้ายไปบ่อของ microplate ดี bottomed 96 ประกอบด้วย μl 100 ของ 1 N NaOH ความหนาแน่นออปติคัลได้อ่านที่ 430 nm ควบคุมบวก 100% บัฟเฟอร์แทนซีรั่ม ในขณะที่ตัวลบ บัฟเฟอร์แทนซีรั่มและทริปซิน เปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเปลี่ยนทริปซินถูกคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้: Trypsininhibitionð Þ¼% ðA1 – A2 = A1Þ 100ที่ A1 =ควบคุมกิจกรรมทริปซิน (ไม่ มีซีรั่ม); A2 =ทริปซินกิจกรรมยังคงอยู่หลังจากเพิ่มเซรั่มซีรั่มรวมไนตริกออกไซด์ synthase (T-NOS) กิจกรรมถูกวัดโดยใช้ชุดการพาณิชย์ (Calbiochem Novabiochem Corporation, USA) หลักการของการวิเคราะห์นี้จะขึ้นอยู่กับวัด NO2 ที่ผลิตจากตัวอย่าง ไนเตรต reductase เป็นใช้สำหรับลดไนเตรตไนไตรต์ให้เอนไซม์ในระบบ วิเคราะห์หาปริมาณไนไตรต์ spectrophotometric จะดำเนินการใช้ Griess Reagents ซึ่งไนไตรต์จะถูกเปลี่ยนเป็นกรดไนตรัส (HNO2), ซัลฟานิลาไมด์ที่ diazotizes เกลือนี้ sulfanilamidediazonium เป็นแล้วปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นกับ-(1-Naphthyl) N-ethylenediamine ผลิต chromophore ซึ่งวัดที่ 540 nm

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การเก็บตัวอย่างและวิเคราะห์
ที่จุดเริ่มต้นของการทดลอง 10 ตัวอย่างปลาและเก็บไว้ที่ -20 ° C สำหรับการวิเคราะห์ทั้งร่างกายองค์ประกอบใกล้เคียงเริ่มต้น ในตอนท้ายของการทดลองให้อาหารทั้งหมดปลาในแต่ละถังถูกกลุ่มชั่งน้ำหนักและนับการคำนวณการเจริญเติบโตและความอยู่รอด หกปลาเหมือนเดิมต่อถัง (18 ปลาต่อการรักษา) ได้รับการคัดเลือกและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสทั้งร่างกายและการวิเคราะห์องค์ประกอบของกล้ามเนื้อ (สามปลาต่อถังสำหรับแต่ละวิเคราะห์) สามปลาต่อถังถูกจับสุ่มอสัญญีมี 2-Phenoxyethanol (200 มก. L-1) และเก็บตัวอย่างเลือดจากหลอดเลือดดำหางกับเข็มฉีดยา heparinized ในการตรวจวัดความเข้มข้นของเลือด, เลือดและกิจกรรมระเบิดทางเดินหายใจ หลังจากที่วัดดังกล่าวข้างต้นด้วยเลือดทั้งพลาสม่าถูกแยกออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียสเป็นความมุ่งมั่นของอิมมูโนทั้งหมด (Ig) ระดับและพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในเลือดรวมทั้งพลาสม่าโปรตีนรวม aminotransferase อะลานีน (ALT) , aspartate aminotransferase (AST), กลูโคสคอเลสเตอรอลและไตรกลีเซอไรด์ ชุดของตัวอย่างเลือดอีก (3 ปลาต่อถัง) ถูกนำมาโดยไม่ต้องเฮและได้รับอนุญาตให้ก้อนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นในซีรั่มที่ถูกแยกจากกันโดยการหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่กรัม× 5000 และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียสสำหรับการวิเคราะห์ของเทสไนตริกออกไซด์รวม (T-NOS), lysozyme, myeloperoxidase (MPO) superoxide dismutase (SOD) และ antiprotease กิจกรรม.
การวิเคราะห์ปริมาณความชื้นและเถ้าของอาหารและตัวอย่างทั้งร่างกายถูกดำเนินการโดยวิธีการมาตรฐาน (AOAC, 1995) โปรตีนวัดโดยใช้อัตโนมัติ Kjeltec วิเคราะห์หน่วย 2300 (FossTecator, Höganäs, สวีเดน) และไขมันดิบถูกกำหนดโดยวิธีการสกัดแบบวิธีกับการสกัดในอีเทอร์ (วิธีหมักสกัดระบบ C-SH6, Seoul, Korea) องค์ประกอบของกรดอะมิโนของอาหารทดลองถูกกำหนดโดยใช้การวิเคราะห์กรดอะมิโนอัตโนมัติ (Beckman 7300 เบคค์, เครื่องดนตรี, พาโลอัลโต, แคลิฟอร์เนีย) Hematocrit ถูกกำหนดโดยเทคนิค microhematocrit (สีน้ำตาล, 1980) เลือดและระดับพลาสมาของโปรตีนทั้งหมดกลูโคสคอเลสเตอรอลและไตรกลีเซอไรด์และกิจกรรมของ ALT และ AST ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์เลือดอัตโนมัติ (SLIM, SEAC Inc. , ฟลอเรนซ์, อิตาลี).
ผลิตอนุมูล Oxidative โดย phagocytes ในระหว่างการระเบิดทางเดินหายใจวัดผ่าน NBT (ไนโตรฟ้า tetrazolium) ในการตรวจการอธิบายโดยเดอร์สันและ Siwicki (1995) สั้น ๆ เลือดและ NBT (0.2%) (Sigma, St. Louis, MO, USA) ได้รับการผสมในสัดส่วนที่เท่ากัน (1: 1) และบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น 50 ไมโครลิตรถูกนำออกมาและจ่ายเข้าไปในหลอดแก้ว หนึ่งมิลลิลิตรของ Dimethylformamide (Sigma) ถูกเพิ่มเข้ามาและหมุนเหวี่ยงที่ 2000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาที สุดท้ายความหนาแน่นของแสงของสารละลายวัดที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้สเปก (Genesys 10UV โรเชสเตอร์, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) Dimethylformamide ถูกใช้เป็นที่ว่างเปล่า.
ระดับพลาสม่า Ig ถูกกำหนดตามวิธีการอธิบายโดย Siwicki และเดอร์สัน (1993) สั้น ๆ , พลาสม่าเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดได้รับการวัดโดยใช้วิธีการกำหนดไมโครโปรตีน (C-690; Sigma) ก่อนและหลังเกิดความวุ่นวายลงโมเลกุล Ig โดยใช้วิธีการแก้ปัญหา 12% ของเอทิลีนไกลคอล (Sigma) ความแตกต่างในความเข้มข้นของโปรตีนหมายถึงเนื้อหา Ig.
ทดสอบ turbidimetric ถูกนำมาใช้ในการตรวจวัดระดับไลโซไซม์ในซีรั่มโดยวิธีการอธิบายโดย Hultmark (1980) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ , Micrococcus lysodeikticus (0.75 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร-1) ถูกระงับในบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต (0.1 M, ค่า pH 6.4) 200 ไมโครลิตรของระบบกันสะเทือนถูกวางไว้ในจานเดียว 96 หลุมแต่ละและซีรั่ม 20 ไมโครลิตรถูกเพิ่มเข้ามาในภายหลัง ในการลดการดูดกลืนแสงของกลุ่มตัวอย่างได้รับการบันทึกไว้ที่ 570 นาโนเมตรหลังจากบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็น 0 และ 30 นาทีในการอ่าน microplate (UVM 340, Biochrom เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร) ในการลดการดูดกลืนแสง 0.001 นาที-1 ได้รับการยกย่องว่าเป็นหนึ่งในหน่วยของกิจกรรม lysozyme.
กิจกรรม MPO วัดตาม Quade และโรท (1997) สั้น ๆ , 20 ไมโครลิตรของซีรั่มถูกเจือจางด้วย HBSS (แฮงค์สโซลูชั่นสมดุลเกลือ) โดยไม่ Ca2 หรือ Mg2 + (Sigma, สหรัฐอเมริกา) ในแผ่น 96 หลุม จากนั้น 35 ไมโครลิตรของ 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine ไฮโดรคลอไร (TMB, 20 มิลลิเมตร) (Sigma, ประเทศสหรัฐอเมริกา) และ H2O2 (5 มิลลิ) ถูกเพิ่มเข้ามา ปฏิกิริยาเปลี่ยนสีก็หยุดหลังจาก 2 นาทีโดยการเพิ่ม 35 ไมโครลิตรของ 4 M กรดซัลฟูริก สุดท้ายความหนาแน่นของออปติคอลได้อ่านที่ 450 นาโนเมตรอ่าน microplate.
กิจกรรม SOD โดยวัดจากปฏิกิริยาเปอร์เซ็นต์อัตราการยับยั้งเอนไซม์ที่มี WST-1 (สีย้อมละลายน้ำ tetrazolium) oxidase พื้นผิวและ xanthine ใช้ Assay SOD Kit (Sigma, 19160 ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทดสอบปลายทางแต่ละคนได้รับการตรวจสอบโดยการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นการดูดกลืนแสงสำหรับผลิตภัณฑ์สี WST-1 ทำปฏิกิริยากับ superoxide) หลังจาก 20 นาทีของเวลาการเกิดปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 37 ° C ยับยั้งเปอร์เซ็นต์ถูกปกติโดยโปรตีนมิลลิกรัมและนำเสนอเป็นหน่วยกิจกรรม SOD.
กิจกรรม antiprotease เซรั่มวัดตามวิธีการอธิบายโดยเอลลิสและคณะ (1990) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (MagnadóttirTable 3et al., 1999) สั้น ๆ , 20 ไมโครลิตรของซีรั่มถูกบ่ม 20 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา trypsin มาตรฐาน (Type II-S จากตับอ่อนหมู, 5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร-1, SigmaAldrich) เป็นเวลา 10 นาทีที่ 22 ° C จากนั้น 200 ไมโครลิตรของฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, ค่า pH 7.0) และ 250 ไมโครลิตร azocasein (2%) (Sigma) มีการเพิ่มและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงวันที่ 22 ° C ห้าร้อย microliters ของกรดไตรคลอโร (10%) ถูกบันทึกและบ่มต่อไปเป็นเวลา 30 นาทีที่ 22 ° C ส่วนผสมที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 6000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและ 100 ไมโครลิตรของสารละลายถูกย้ายไปที่หลุม microplate ต่ำสุด 96 แบนอย่างดีที่มี 100 ไมโครลิตรของ 1 N NaOH ความหนาแน่นของออปติคอลได้อ่านที่ 430 นาโนเมตร สำหรับควบคุมบวก 100% บัฟเฟอร์แทนที่ซีรั่มในขณะที่สำหรับบัฟเฟอร์ควบคุมเชิงลบแทนที่ทั้งสองในซีรั่มและ trypsin เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง trypsin ที่คำนวณได้จากสมการต่อไปนี้: TrypsininhibitionðÞ¼% DA1-A2 = A1Þ 100
ที่ A1 = กิจกรรม trypsin ควบคุม (ไม่รวมในซีรั่ม); A2 = กิจกรรม trypsin ยังคงอยู่หลังจากที่เพิ่มเซรั่ม.
เซรั่มทั้งหมดเทสไนตริกออกไซด์ (T-NOS) กิจกรรมวัดโดยใช้ชุดการค้า (เกียว-Novabiochem คอร์ปอเรชั่นประเทศสหรัฐอเมริกา) หลักการของการทดสอบนี้จะขึ้นอยู่กับการวัด NO2 ผลิตในตัวอย่าง reductase ไนเตรตจะใช้สำหรับการลดลงของเอนไซม์ไนเตรทไนไตรท์ สเปกปริมาณไนไตรท์จะดำเนินการโดยใช้ Griess รีเอเจนต์ที่ไนไตรท์จะถูกแปลงเป็นกรดไนตรัส (HNO2) ซึ่ง diazotizes ซัลฟานิลาไมด์ เกลือ sulfanilamidediazonium นี้จะมีปฏิกิริยาตอบสนองแล้วด้วย N- (1 แนพ) -ethylenediamine การผลิต chromophore ซึ่งเป็นวัดที่ 540 นาโนเมตร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การเก็บตัวอย่างและวิเคราะห์
เมื่อเริ่มต้นการทดลอง จำนวน 10 ปลาที่เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 ° C −การวิเคราะห์เริ่มต้นร่างกายวิเคราะห์องค์ประกอบ ในตอนท้ายของการให้ทดลองทั้งหมดปลาในแต่ละถังมีขนาดใหญ่หนักและนับคำนวณพารามิเตอร์ของการเจริญเติบโตและการอยู่รอดหกเหมือนเดิมปลาต่อถัง ( 18 ปลาต่อรักษา ) สุ่มและเก็บไว้ที่ 20 ° C −การวิเคราะห์องค์ประกอบร่างกายและกล้ามเนื้อ ( ปลา 3 ต่อถังแต่ละการวิเคราะห์ ) ปลา 3 บาทต่อถัง สุ่มจับวางยาสลบด้วย 2-phenoxyethanol ( 200 mg L − 1 ) และการเก็บตัวอย่างเลือดจากหลอดเลือดดำระดับกลุ่มเข็มฉีดยาสำหรับการหาปริมาตรเม็ดเลือดแดงอัดแน่นฮีโมโกลบินและกิจกรรมออกมาหายใจ หลังจากวัดดังกล่าวข้างต้นกับเลือด พลาสมาถูกแยกโดยการเหวี่ยงแยกที่ 5 × G 10 นาทีและอุณหภูมิ− 70 °องศาเซลเซียสสำหรับการหาอิมมูโนโกลบูลิน ( IG ) ระดับและพารามิเตอร์ทางชีวเคมีรวมทั้งพลาสม่าเลือดรวมโปรตีน , alanine aminotransferase ( ALT ) , aspartate aminotransferase ( AST ) , กลูโคสคอเลสเตอรอลและไตรกลีเซอไรด์ . อีกชุดของตัวอย่างเลือด ( 3 ตัว ต่อถัง ) ถ่ายโดยไม่มีเฮปารินและอนุญาตให้แข็งตัวที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที จากนั้น เซรั่มแยกโดยการเหวี่ยงแยก 10 นาทีที่ 5 ×กรัม และ 70 องศา C อุณหภูมิ−การวิเคราะห์ทั้งหมด synthase ไนตริกออกไซด์ ( t-nos ) , ไลโซไซม์ ( myeloperoxidase สักนิด , ) , Superoxide Dismutase ( SOD ) และกิจกรรม antiprotease .
การวิเคราะห์ปริมาณความชื้นและเถ้าของอาหารและร่างกายตัวอย่าง ได้มาตรฐาน ( โปรตีน , 1995 ) โปรตีนเป็นวัดโดยใช้เครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ kjeltec 2300 ( fosstecator H öกานและ s , สวีเดน ) และไขมันดิบถูกกำหนดโดยใช้วิธี Soxhlet การสกัดอีเทอร์ ( 1 ระบบการสกัด c-sh6 , โซล , เกาหลี )องค์ประกอบกรดอะมิโนของสุกรที่ได้รับการพิจารณาโดยอัตโนมัติวิเคราะห์กรดอะมิโน ( เบคแมน , 300 เบคแมน , เครื่องมือ , พาโลอัลโต , แคลิฟอร์เนีย ) ตรวจพิจารณา โดยเทคนิค microhematocrit ( สีน้ำตาล , 1980 ) ฮีโมโกลบินและระดับของพลาสมาโปรตีนกลูโคสรวมคอเลสเตอรอลและไตรกลีเซอไรด์และกิจกรรมของ ALT และ AST ถูกกำหนดโดยอัตโนมัติวิเคราะห์เลือด ( บางSEAC อิงค์ , ฟลอเรนซ์ , อิตาลี )
ออกซิเดชันผลิตโดยฟาโกไซต์ในระบบทางเดินหายใจรุนแรงระเบิดวัดผ่าน NBT ( Nitro สีฟ้า tetrazolium ) โดยอธิบายโดย Anderson และ siwicki ( 1995 ) สั้น ๆ , เลือดและ NBT ( 0.2% ) ( Sigma , St . Louis , MO , USA ) มาผสมในสัดส่วนที่เท่ากัน ( 1 : 1 ) และบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง แล้ว 50 μผมออกมาและจ่ายเข้าไปในท่อแก้วหนึ่งมิลลิลิตรของการล้างพิษ ( Sigma ) และเพิ่มระดับที่ 2 × G สำหรับ 5 นาที ในที่สุด แสงวัดความหนาแน่นสูง 540 นาโนเมตรโดยใช้ Spectrophotometer ( เจเนซิส 10uv Rochester , NY , USA ) ไอโซโทปของพลูโทเนียมถูกใช้เป็นช่องว่าง ระดับ IG
พลาสมาถูกกำหนดตามวิธีการที่อธิบายโดย siwicki แอนเดอร์สัน ( 1993 ) สั้น ๆพลาสมาโปรตีนทั้งหมดของการวัดโดยใช้ไมโครโปรตีนการหาวิธี ( c-690 ; Sigma ) ก่อนและหลังจากตกตะกอนลง IG โมเลกุลโดยใช้ 12 % สารละลายพอลิเอทิลีนไกลคอล ( Sigma ) ความแตกต่างของความเข้มข้นของโปรตีนแทน อิก
เนื้อหา .เป็นวิธีที่ใช้สำหรับการกำหนดระดับ turbidimetric ไลโซไซม์ซีรั่มโดยวิธีบรรยายโดย hultmark ( 1980 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ , Micrococcus lysodeikticus ( 0.75 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร− 1 ) ถูกระงับใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.4 ) , 200 μ L ของช่วงล่างที่ถูกวางไว้ในแต่ละดี 96 ดีแผ่น และเซรั่มผม 20 μถูกเพิ่มเข้ามาในภายหลังการลดการดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ถูกบันทึกไว้ 570 nm หลังการบ่มที่อุณหภูมิห้อง 0 และ 30 นาทีในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน 340 biochrom uvm , Cambridge , UK ) การลดการดูดกลืนแสง 0.001 มิน− 1 ก็ถือว่าเป็นหน่วยหนึ่งของกิจกรรมไลโซไซม์ .
กิจกรรมสักนิดวัดและตามเควดรอธ ( 1997 ) สั้น ๆ20 μผม เซรั่ม เจือจางด้วย hbss ( แฮงค์สมดุลแคลเซียมหรือเกลือ ) โดยไม่ mg2 ( Sigma , USA ) 96 ด้วยแผ่น แล้ว 35 μ l ’’สำหรับ , - 5 , 5 tetramethylbenzidine ไฮโดรคลอไรด์ ( หรือ 20 มม. ) ( Sigma , USA ) และแบตเตอรี่ ( 5 มม. ) ถูกเพิ่มเข้ามา เปลี่ยนสีปฏิกิริยาหยุดหลังจาก 2 นาที โดยเพิ่ม 35 μผม 4 M กรดกำมะถัน ในที่สุด ซิกแซ็กได้อ่าน 450 nm ในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย
อ่าน .กิจกรรมสดวัดจากค่าอัตราปฏิกิริยายับยั้งเอนไซม์กับ wst-1 ( ละลายน้ำ tetrazolium ย้อม ) ( oxidase แซนทิน โดยใช้ SOD ( Kit ( Sigma , 19160 ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตอาจถูกตรวจสอบโดยแต่ละการทดสอบการดูดกลืนแสงที่ 450 nm ( ความยาวคลื่นค่าสำหรับผลิตภัณฑ์สีของ wst-1 ปฏิกิริยากับซุปเปอร์ ) หลังจาก 20 นาทีของเวลาปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 37 องศา C เปอร์เซนต์เป็นปกติ โดยแสดงเป็นหน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนกิจกรรมสด เซรั่ม antiprotease
กิจกรรมได้ตามวิธีการที่อธิบายโดย Ellis et al , . ( 1990 )กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ( magnad ó ttirtable 3et al . , 1999 ) สั้น ๆ , 20 μผม เซรั่ม ถูกบ่มกับ 20 μ L ของสารละลายเอนไซม์มาตรฐาน ( ชนิด ii-s จาก porcine pancreas , 5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร− 1 , sigmaaldrich ) สำหรับ 10 นาทีที่ 22 องศา แล้ว 200 μลิตร ( 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 7.0 ) และ 250 μผม azocasein ( 2 % ) ( Sigma ) ถูกเพิ่มและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่ 22 องศาห้าร้อยตัวเลขของกรดไตรคลอโรอะซิติก ( 10% ) เพิ่มอีก 30 นาที ที่อุณหภูมิ 22 องศา ส่วนผสมระดับ 6000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและ 100 μ L ของที่นำไปเป็นบ่อของ 96 ก็แบน bottomed พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( 100 μ L 1 N NaOH ความหนาแน่นของแสงคืออ่านที่ 430 nm . สำหรับควบคุม 100% บวก บัฟเฟอร์ แทนที่ เซรั่มในขณะที่สำหรับบัฟเฟอร์ควบคุมลบแทนที่ทั้งเซรั่ม และเอนไซม์ . โดยการยับยั้งเอนไซม์ร้อยละคำนวณได้โดยใช้สมการต่อไปนี้ : trypsininhibition ðÞ¼ % A1 และ A2 = A1 ðÞ 100
ที่ A1 = ควบคุมเอนไซม์กิจกรรม ( เซรั่ม ) ; A2 = ทริปกิจกรรมยังคงอยู่หลังจากการเพิ่มเซรั่ม
เซรุ่มรวม nitric oxide synthase ( t-nos ) คือการวัดโดยใช้ชุดกิจกรรมเชิงพาณิชย์ ( calbiochem novabiochem Corporation , USA ) หลักการของวิธีนี้ขึ้นอยู่กับวัด NO2 ผลิตในตัวอย่าง ไนเตรตรีดักเทส คือ ใช้สำหรับลดเอนไซม์ของไนเตรทไนไตร์ท เซลล์ ) ของไนไตรท์เป็น griess โดยใช้สารเคมีที่ไนจะถูกแปลงเป็นกรดไนตรัส ( hno2 ) ซึ่ง diazotizes sulfanilamide . นี้ sulfanilamidediazonium ทำปฏิกิริยากับเกลือแล้ว - ( 1-naphthyl ) - ลลีนไดแอมผลิตที่มีสีซึ่งเป็นวัดที่ 540 nm .