2.8. In-Cell Western Assay. The cel

2.8. In-Cell Western Assay. The cells were harvested and
diluted with DMEM containing 10% FBS to 75,000 cells/mL.
Under sterile conditions, dispense 200

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.8 ในเซลล์ทดสอบตะวันตก เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและ
เจือจางด้วย dmem มี FBS 10% ถึง 75,000 เซลล์ / ml.
ภายใต้เงื่อนไขหมันแจกจ่าย 200 ไมโครลิตรของเซลล์แขวนลอย
ต่อดีในจาน microwell Nunc 96 หลังจาก 24 ชั่วโมงเรา
ออกใสและจ่าย100μlของซีรั่มฟรี
สื่อ (dmem) ต่อกันของไมโคร 96 ดีใน 4-6 ชั่วโมง.
แล้วเอาสื่อด้วยตนเองทันทีแก้ไขเซลล์ที่มี 4%
ฟอร์มาล​​ดีไฮด์ใน 1 × pbs เป็นเวลา 20 นาทีที่ roomtemperature.
ล้างห้าครั้งด้วย 1 × pbs ที่มี 0.1% Triton x-100
(การผ่านมือถือ) เป็นเวลา 5 นาทีต่อการซัก (นิพจน์
ของ Grp78 ใน เซลล์ผิวโดยไม่ต้องผ่านเข้า). บ่อ
ถูกบล็อกโดยการเพิ่ม 150 ไมโครลิตรของ li-ครโอเดสซีบล็อก
กันชนกันดีใน 1.5h ออกบัฟเฟอร์การปิดกั้นการ fromthe
การปิดกั้นการขั้นตอนและเพิ่ม 50 ไมโครลิตรของแอนติบอดีหลัก (Grp78,
1: 100, gapdh, 1: 100), บ่มค้างคืนที่ 4 ∘คและล้างจาน
ห้าครั้งด้วย 1 × pbst (0.1% ทวี-20) เพื่อ
5minutes ที่ RT ด้วยอ่อนโยนสั่นโดยใช้จำนวนเงินที่ใจดี
ของบัฟเฟอร์และเพิ่ม 50 ไมโครลิตรของแอนติบอดีรอง (irdye
800cw ติดฉลากแอนติบอดีรอง 1: 100,000) วิธีการแก้
แต่ละดีบ่ม 60minutes ด้วยอ่อนโยนสั่นที่ RT
และแผ่นป้องกันจากแสงในระหว่างการบ่มและล้างจาน
ห้าครั้งกับ 1 × pbst เป็นเวลา 5 นาทีที่ RT ด้วย
อ่อนโยนสั่นโดยใช้จำนวนเงินที่ใจดีของบัฟเฟอร์ แผ่น
ถูกสแกนที่ 800 นาโนเมตรด้วยระบบการถ่ายภาพโอเดสซี.
2.9.western blotting lysates เซลล์ที่ถูกจัดทำขึ้นในขณะที่ก่อนหน้านี้
อธิบายโปรตีน (50 ไมโครกรัม) ถูกแยกออกในวันที่ 10%
sds หน้าและโอนไปยังเยื่อ PVDF (ค,
usa). themembranes ถูกบ่มที่ roomtemperature
เป็นเวลา 2 ชั่วโมงใน 50mmtris-hcl (ph 7.4) 150mmnacl 0.1%
(v / v) ทวี-20, 0.5% (w / v) BSA แล้วค้างคืนที่ 4 ∘ c
บนแกนหมุนที่มีแอนติบอดีหลักที่เฉพาะเจาะจง (1: 1000 ใน
tbst / BSA) เยื่อหุ้มถูกล้าง 3 ครั้งด้วย
tbst และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วยมะรุมเหมาะสม peroxidase-
(HRP) แอนติบอดีรองผัน (1: 5000 ใน
tbst / BSA) สัญญาณที่มองเห็นด้วยเพิ่ม
chemiluminescence ตะวันตกสารตรวจสอบ blotting (ECL
เพียร์ซ, usa) โดยใช้ระบบ bioimaging (i-box, UVP, usa). การวิเคราะห์
densitometric ได้รับการดำเนินการโดยใช้ปริมาณหนึ่ง
ซอฟต์แวร์ (ไบโอล้อ, usa .)
2.10Δkdel transfection recombinant และการเลือกที่มั่นคง
transfectants กลายพันธุ์ Grp78 Δkdelที่เอ้อ
residentmotif kdel ถูกลบถูกสร้างขึ้นในขณะที่ก่อนหน้านี้
รายงาน [13] สำหรับการสร้างสายพันธุ์เซลล์เสถียร overexpressing
Grp78 บนพื้นผิวเซลล์ Grp78 Δkdelกลายพันธุ์
ถูก transfected เข้าไปในเซลล์ smmc7721 ใช้ lipofectamine
2000 (Invitrogen,. usa) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
pcdna3.1 เวกเตอร์ถูก transfected ยังเป็นที่ควบคุม
หลังจาก 24 ชั่วโมงเซลล์ถูก subcultured ที่ 1: 3. อัตราส่วน
Δkdel transfectants recombinant ถูกเลือกโดยการเพิ่ม
g418 (400 mg / ml ) ใน dmem มี FBS 10% และระบุ
โดย blotting ตะวันตกและภูมิคุ้มกันตามลำดับ.
2.11 การวิเคราะห์ทางสถิติ ข้อมูลจะถูกนำเสนอเป็นวิธี±
ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ข้อมูลที่ถูกวิเคราะห์ด้วย