ELISA protocolIgG was prepared by c

ELISA protocol
IgG was prepared by chromatography on Protein A Sepharose. Puri®ed BS1-IgG was coupled to biotin; the BS1-IgG was separated from the free biotin by gel ®ltration (Guesdon et al. 1979).
One hundred microlitre volumes were used in each well for the ELISA, unless stated otherwise, with samples loaded in duplicate and incubation stages carried out in a humid chamber at 37 C. Samples and standards were
diluted in PBST (0
05 mol lÿ1 phosphate, 0
15 mol lÿ1 NaCl, 0
01% Tween 20, pH 7
4), which was supplemented
with 1% bovine serum albumin (BSA) for the dilution of BS1-IgG-biotin and streptavidin-alkaline phosphatase. In between each stage, plates (Dyrex Technologies,Billinghurst, UK) were washed three times with PBST.
Plates were coated with BS1-IgG diluted to 5 mg mlÿ1 in50 mmol lÿ1 carbonate bicarbonate buffer, pH 9
6, and
incubated for 3 h. Plates were blocked with 1% (w/v) BSA in carbonate bicarbonate buffer (200 ml per well) and incubated for 1 h. Samples, standards and marker wells (i.e. ablank (PBST) and a positive control containing a BS1 Lform
suspension at a protein concentration of 1
7 mg mlÿ1) were loaded in duplicate. After overnight incubation at 4 C, 0
3 mg mlÿ1 BS1-IgG-biotin was added and incubated for 3 h. This was followed by streptavidin-alkaline phosphatase
(Amersham Pharmacia Biotech UK, LittleChalfont, UK) diluted to 1/1000 and incubated for 1 h.
The substrate, 2 mg mlÿ1 p-nitrophenol phosphate (Sigma,Poole, UK) in 0
1 mol lÿ1 glycine buffer with 1 mmol lÿ1 MgCl2 and 1 mmol lÿ1 ZnCl2, pH 10
4, was added. The reaction was developed in the dark at room temperature for
approximately 20±40 min and plates then read at 405 nm (MRX Microplate reader; KPL). The positive/negative threshold was the mean absorbance of control wells ‡4 standard deviations (C ‡ 4 S.D.; Sutula et al. 1986).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธี ELISA โปรโตคอล
IgG ถูกจัดทำขึ้นโดยโครมาโตในโปรตีน Sepharose Puri®ed BS1-IgG ถูกคู่กับไบโอติน; BS1-IgG ถูกแยกออกจากไบโอตินฟรีโดยเจล®ltration (Guesdon et al. 1979).
หนึ่งร้อยเล่มไมโครลิตรถูกนำมาใช้ในแต่ละดีสำหรับวิธี ELISA ยกเว้นที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่นกับกลุ่มตัวอย่างในการโหลดที่ซ้ำกันและการบ่มขั้นตอนการดำเนินการใน ห้องชื้นที่ 37 องศาเซลเซียส ตัวอย่างและมาตรฐานถูก
เจือจางใน PBST (0? 05 mol lÿ1ฟอสเฟต, 0? 15 mol lÿ1โซเดียมคลอไรด์, 0? 01% Tween 20 พีเอช 7? 4) ซึ่งได้รับการเสริม
ด้วย 1% วัวซีรั่มอัลบูมิ (BSA) สำหรับการเจือจาง ของ BS1-IgG-ไบโอตินและฟอสฟาเตอัลคาไลน์ ในระหว่างแต่ละขั้นตอน, จาน (Dyrex Technologies, Billinghurst สหราชอาณาจักร) ถูกล้างสามครั้งด้วย PBST.
แผ่นถูกเคลือบด้วย BS1-IgG ลดลงเหลือ 5 มิลลิกรัมmlÿ1 in50 มิลลิโมลlÿ1บัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนตคาร์บอเนตค่า pH 9 6 และ
บ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง . แผ่นถูกบล็อกด้วย 1% (w / v) บีเอสเอในบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนตคาร์บอเนต (200 มิลลิลิตรต่อกัน) และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตัวอย่างมาตรฐานและหลุมเครื่องหมาย (เช่น ablank (PBST) และการควบคุมในเชิงบวกที่มี BS1 Lform
ระงับที่มีความเข้มข้นของโปรตีน 1? 7 มิลลิกรัมmlÿ1) ได้รับการโหลดในที่ซ้ำกัน หลังจากการบ่มค้างคืนที่ 4? C, 0? 3 มิลลิกรัมmlÿ1 BS1-IgG-ไบโอตินได้รับการเพิ่มและบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง นี้ตามมาด้วยสเตอัลคาไลน์ฟอสฟา
(Amersham Pharmacia ไบโอเทคสหราชอาณาจักร LittleChalfont สหราชอาณาจักร) ลดลงเหลือ 1/1000 และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง.
สารตั้งต้น, 2 มิลลิกรัมmlÿ1 P-nitrophenol ฟอสเฟต (Sigma, พูล, สหราชอาณาจักร) ใน 0? 1 mol lÿ1 glycine บัฟเฟอร์ 1 มิลลิโมลlÿ1 MgCl2 และ 1 มิลลิโมลlÿ1 ZnCl2 ค่า pH 10? 4 ถูกเพิ่มเข้ามา ปฏิกิริยาที่ได้รับการพัฒนาในความมืดที่อุณหภูมิห้อง
ประมาณ 20 ± 40 นาทีและแผ่นแล้วอ่านที่ 405 นาโนเมตร (MRX ไมโครอ่าน; KPL) บวก / เกณฑ์เชิงลบคือการดูดกลืนแสงเฉลี่ยของการควบคุมหลุม ?? 4 ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (C ?? 4 SD; Sutula et al, 1986).