2.1. Animals and live transport exp

2.1. Animals and live transport experiments
Animals were obtained from Lisboa Springs Hatchery, Pecos, New
Mexico. Triploid female rainbow trout (mean weight 200 g) were sampled
before (control) and after a 5-h transport event. At the hatchery,
fishwere maintained in concrete rafts using an open circulation system.
Water temperature during the experiments ranged from 10 to 13 °C.
Fish were fed with commercial dry pellets once a day ad libitum using
mechanical feeders but starved the dayswhen samplingswere conducted.
Stressed groups consist of post transport fish named PTNS (posttransport
no salt) and post transport group (named PTS), to which a
concentration of 5 g NaCl/Lwas added to the tankwater of the transport
truck. Transport water was directly obtained from the raft where the
fish were held. Fish were not sedated during transport Experiments
were conducted three independent times between themonths of October
and December. Six fish fromeach experimental groupwere sampled
each time. Sampling began at 9 amfor the control fish and 1 pm for the
stressed groups. Fishwere anesthetizedwithMS-222 and bled fromthe
caudal vein with a heparinized 3 mL syringe. Plasma samples were
collected and stored at −80 °C until use. Sampling time per fish was
approximately 3 min and performed by the same three researchers
every time.
2.2. Glucose and cortisol levels
Blood glucose was measured using the One Touch Ultra2 commercial
glucose meter. Plasma cortisol levels were measured by
radioimmune assay as explained elsewhere (Kiyma et al., 2004) at
New Mexico State University, Las Cruces.
2.3. Skin mucus bacteria isolation and plate counts
Total skin mucus was collected by scraping the body surface of the
fish with a sterile cell scraper and collected onto a sterile petri dish.
Skin-associated bacteria were isolated by a series of centrifugation
steps as explained elsewhere (Xu et al., 2013). PBS and 10 μL of the
solution were plated onto Luria Bertani (LB) agar plates and tryptic
soy agar (TSA) plates. Plateswere incubated for three days at roomtemperature
and colony forming units (cfu) were counted by two different
staff members. No further attempts to identify the bacterial isolates
were made.
2.4. Scanning electron microscopy and light microscopy
Three skin samples fromeach experimental groupwere collected for
scanning electron microscopy. Samples were fixed in 1% glutaraldehyde,
1% formaldehyde, and 1 M of sodium cacodylate solution overnight,
dehydrated and critical point dried. Processed samples were
examined under a JEOL 5800LV scanning electron microscope. Additionally,
three skin samples were fixed in 4% paraformaldehyde for
paraffin embedding. Five μm-thick paraffin sections were stained with
hematoxylin-eosin as well as with alcian blue/periodic acid-Schiff (AB/
PAS stain) at two different pH values (1 and 2.5) in order to reveal the
chemical composition of mucosal secretion and visualize different mucins
as explained elsewhere (Sarasquete et al., 2001). Themucosal contents
of goblet cells were counted under a microscope and scored as
blue or magenta. A minimum of three fish per experimental group
and six paraffin sections per fish were used for the quantification of
mucin types. Light micrographs were acquired in a Zeiss AxioSkop
using the AxioVision software.
2.5. Gene expression studies by RT-qPCR
Total RNAwas extracted from the skin of 6 control, 6 PTS and 6 PTNS
rainbowtrout using Trizol. cDNA synthesis was performed using 1 μg of
total RNA,whichwas denatured (65 °C, 5min) in the presence of 1 μL of
oligo-dT17, 1 μL of dNTP (deoxynucleoside triphosphate mix 10 mM
each (Promega) and RNA/DNA free water (Sigma) in a volume of
13 μL. Synthesis was carried out using 1 μL of Superscript III enzyme
reverse transcriptase (Invitrogen) in the presence of 5 μL of 5× first
strand buffer, 1 μL 0.1MDTT,made up to a final volume of 25 μL with
water, and incubated at 55 °C for 1 h. The resultant cDNA was stored
at −20 °C.
The expression of the main tight junction genes in fish (occluding,
claudin-7, 8d, 12 and 31), mucin genes (MUC2 and MUC5AC), antimicrobial
peptides (DB1, 2, 3 and 4, cathelicidin 1 and 2, hepcidin and
LEAP2A) and cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α, TGF-β1a and TGF-β1b)
was studied before and after transport by RT-qPCR using specific
primers (Table 1). The qPCR was performed using 3 μL of a diluted
cDNA template as described in Tacchi et al. 2013 (Tacchi et al., 2013).
The relative expression level of the genes was determined using the
Pfaffl method (Pfaffl, 2001) as previously described (Tacchi et al., 2013).
2.6. Bacterial translocation experiments
Liver and spleen tissue samples from each fish were collected under
sterile condition, weighted and then homogenized using a syringe needle.
After homogenization, the spleen and liver were separately resuspended
in 400 μL of sterile PBS, and 20 μL of the resulting solution was
plated onto LB and TSA plates. Plates were incubated at room temperature
for two days, and cfu numbers were counted by two different staff
members. Bacterial counts were standardized to original weight of the
tissue, and final volume of the homogenized solution.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1 สัตว์และการทดลองการขนส่งสดสัตว์ที่ได้รับจากโรงเพาะฟัก Lisboa สปริงส์, คอส, นิวเม็กซิโก เรนโบว์เทราท์หญิง Triploid (หมายถึงน้ำหนัก 200 กรัม) เป็นตัวอย่างก่อน(ควบคุม) และหลังจากเหตุการณ์การขนส่ง 5 ชั่วโมง ในโรงเพาะฟักที่fishwere เก็บรักษาไว้ในแพคอนกรีตใช้ระบบการไหลเวียนเปิด. อุณหภูมิของน้ำในช่วงการทดลองอยู่ในช่วง 10-13 องศาเซลเซียส. ปลาที่ถูกเลี้ยงด้วยอาหารเม็ดแห้งเชิงพาณิชย์วันละครั้งกินอย่างเต็มที่โดยใช้ดูดกล แต่หิวโหย dayswhen samplingswere ดำเนินการ เน้นกลุ่มประกอบด้วยปลาขนส่งโพสต์ชื่อ PTNS (posttransport เกลือไม่ได้) และโพสต์กลุ่มขนส่ง (ชื่อ PTS) เพื่อที่ความเข้มข้นของ 5 กรัมโซเดียมคลอไรด์ / Lwas เพิ่มไปยัง tankwater ของการขนส่งรถบรรทุก การขนส่งทางน้ำที่ได้รับโดยตรงจากแพที่ปลาถูกจัดขึ้น ปลาที่ไม่ได้ผ่อนคลายในระหว่างการทดลองการขนส่งได้ดำเนินการครั้งที่สามที่เป็นอิสระระหว่าง themonths ของเดือนตุลาคมและธันวาคม หกปลา fromeach groupwere ทดลองชิมในแต่ละครั้ง การเก็บตัวอย่างเริ่มต้นที่ 9 amfor ปลาควบคุมและ 01:00 สำหรับกลุ่มเน้น Fishwere anesthetizedwithMS-222 และเลือด fromthe หลอดเลือดดำหางมี heparinized 3 เข็มฉีดยามิลลิลิตร ตัวอย่างพลาสมาถูกเก็บรวบรวมและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสจนถึงการใช้งาน เวลาการเก็บตัวอย่างต่อปลาประมาณ 3 นาทีและดำเนินการโดยสามนักวิจัยทุกครั้ง. 2.2 กลูโคสและระดับคอร์ติซอน้ำตาลในเลือดวัดโดยใช้ One Touch Ultra2 เชิงพาณิชย์เครื่องวัดระดับน้ำตาล ระดับ cortisol พลาสม่าถูกวัดโดยการทดสอบradioimmune ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น (Kiyma et al., 2004) ที่มหาวิทยาลัยรัฐนิวเม็กซิโก, Las Cruces. 2.3 เมือกผิวการแยกเชื้อแบคทีเรียและแผ่นนับเมือกผิวทั้งหมดถูกเก็บรวบรวมโดยขูดพื้นผิวของร่างกายของปลาที่มีมีดโกนเซลล์ผ่านการฆ่าเชื้อและรวบรวมลงบนจานPetri หมัน. แบคทีเรียที่ผิวหนังที่เกี่ยวข้องถูกแยกโดยชุดของการหมุนเหวี่ยงขั้นตอนตามที่อธิบายไว้ที่อื่น ๆ (เสี่ยว et al., 2013) พีบีเอส 10 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาที่ถูกเคลือบลงบนLuria Bertani (LB) แผ่นวุ้นและ tryptic ถั่วเหลืองวุ้น (TSA) แผ่น Plateswere บ่มเป็นเวลาสามวันที่ roomtemperature และสร้างอาณานิคมหน่วย (cfu) นับที่แตกต่างกันสองสมาชิกในทีม ไม่มีความพยายามที่จะระบุแบคทีเรียได้ทำ. 2.4 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสแกนและกล้องจุลทรรศน์สามตัวอย่างผิว fromeach groupwere ทดลองเก็บไว้สำหรับการสแกนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ตัวอย่างการแก้ไขใน glutaraldehyde 1% ไฮด์ 1% และ 1 M ของสารละลายโซเดียม cacodylate ค้างคืนที่จุดแห้งและที่สำคัญแห้ง ตัวอย่างการประมวลผลได้รับการตรวจสอบภายใต้ JEOL 5800LV สแกนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน นอกจากนี้สามตัวอย่างผิวได้รับการแก้ไขใน paraformaldehyde 4% สำหรับการฝังพาราฟิน ห้าส่วนพาราฟินไมครอนหนาถูกย้อมด้วยสีhematoxylin-Eosin เช่นเดียวกับ Alcian ฟ้า / ธาตุกรดชิฟฟ์ (AB / PAS คราบ) ที่สองค่าพีเอชที่แตกต่างกัน (1 และ 2.5) เพื่อที่จะแสดงให้เห็นถึงองค์ประกอบทางเคมีของการหลั่งเยื่อเมือกและเห็นภาพที่แตกต่างกัน mucins ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น (Sarasquete et al., 2001) เนื้อหา Themucosal ของเซลล์ถ้วยนับภายใต้กล้องจุลทรรศน์และคะแนนเป็นสีฟ้าหรือสีม่วงแดง อย่างน้อยสามปลาต่อกลุ่มทดลองและหกส่วนพาราฟินต่อปลาถูกนำมาใช้สำหรับปริมาณของประเภทmucin ไมโครไลท์ที่ได้มาใน Zeiss AxioSkop ใช้ซอฟต์แวร์ AxioVision ได้. 2.5 การศึกษาการแสดงออกของยีนโดย RT-qPCR รวม RNAwas สกัดจากผิวของการควบคุม 6, 6 และ 6 PTS PTNS rainbowtrout ใช้ Trizol ยีนสังเคราะห์ได้รับการดำเนินการโดยใช้ 1 ไมโครกรัมของอาร์เอ็นเอรวมwhichwas เอทิลแอลกอฮอล์ (65 องศาเซลเซียส 5 นาที) ในการปรากฏตัวของ 1 ไมโครลิตรของOligo-dT17 1 ไมโครลิตรของ dNTP (deoxynucleoside ผสม triphosphate 10 มิลลิแต่ละ(Promega) และ RNA / DNA ฟรี น้ำ (ซิกม่า) ปริมาณของ13 ไมโครลิตร. การสังเคราะห์สารที่ถูกนำออกมาใช้ 1 ไมโครลิตรของเอนไซม์ยกที่สามกลับtranscriptase (Invitrogen) ในการปรากฏตัวของ 5 ไมโครลิตร 5 ×แรกบัฟเฟอร์สาระ1 ไมโครลิตร 0.1MDTT ทำถึงขั้นสุดท้าย ปริมาณ 25 ไมโครลิตรกับน้ำและบ่มที่55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง. โดยยีนผลที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ-20 องศาเซลเซียส. การแสดงออกของยีนชุมแน่นหลักในปลา (ย้อนกลับ, claudin-7, 8, 12 และ 31 ) ยีน mucin (MUC2 และ MUC5AC) ยาต้านจุลชีพเปปไทด์(DB1, 2, 3 และ 4 cathelicidin 1 และ 2 hepcidin และLEAP2A) และไซโตไคน์ (IL-1β, IL-6, TNF-α, TGF-β1aและทีจี -β1b) ได้ศึกษาก่อนและหลังการขนส่งทาง RT-qPCR ใช้เฉพาะไพรเมอร์(ตารางที่ 1). โดย qPCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ 3 ไมโครลิตรของเจือจางแม่แบบของยีนที่อธิบายไว้ในTacchi et al. 2013 (Tacchi et al., 2013) ระดับการแสดงออกของยีนที่สัมพันธ์กันถูกกำหนดโดยใช้วิธี Pfaffl (Pfaffl, 2001) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Tacchi et al., 2013). 2.6 การทดลองโยกย้ายแบคทีเรียตับและตัวอย่างเนื้อเยื่อม้ามจากปลาแต่ละถูกเก็บภายใต้สภาพปลอดเชื้อถ่วงน้ำหนักและปั่นแล้วใช้เข็มเข็มฉีดยา. หลังจากที่เป็นเนื้อเดียวกัน, ม้ามและตับถูก resuspended แยกต่างหากใน400 ไมโครลิตรของพีบีเอสผ่านการฆ่าเชื้อและ 20 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาที่เกิดขึ้น ถูกเคลือบลงบนLB และแผ่น TSA แผ่นถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาสองวันและหมายเลข cfu นับสองพนักงานที่แตกต่างกันของสมาชิก นับแบคทีเรียได้รับมาตรฐานน้ำหนักเดิมของเนื้อเยื่อและเล่มสุดท้ายของการแก้ปัญหาหดหาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1 . สัตว์มีชีวิตการทดลอง
การขนส่งสัตว์ได้จาก Lisboa สปริงโรงเพาะฟักคอสใหม่
เม็กซิโก ทริพลอยด์หญิงปลาเรนโบว์เทราท์ ( หมายถึงน้ำหนัก 200 กรัม ) จำนวน
ก่อน ( ควบคุม ) และหลังจาก 5-h การขนส่งงาน ที่โรงเพาะฟัก
fishwere รักษาในแพคอนกรีตโดยใช้การไหลเวียนระบบเปิด อุณหภูมิน้ำในระหว่างการทดลองมีค่า

จาก 10 ถึง 13 องศาปลาเลี้ยงด้วยการค้าบริการเม็ดวันละครั้งอย่างเต็มที่โดยใช้
เครื่องกลดูดแต่หิว dayswhen samplingswere ) .
เน้นกลุ่มประกอบด้วยโพสต์การขนส่งปลาชื่อ ptns ( posttransport
ไม่มีเกลือ ) และกลุ่มขนส่งไปรษณีย์ ( ชื่อ pts ) ที่ความเข้มข้น 5 กรัมของเกลือ
/ ข้าเพิ่มให้ tankwater ของ รถบรรทุกขนส่ง

ขนส่งทางน้ำได้โดยตรงได้จากแพที่
ปลาถูกจัดขึ้น ปลาไม่สงบในระหว่างการทดลอง
การขนส่งจำนวน 3 ครั้ง themonths อิสระระหว่างเดือนตุลาคม
และธันวาคม ปลาหกของตัวอย่างทดลอง groupwere
แต่ละครั้ง คนเริ่มที่ 9 amfor ควบคุมปลาและ 1 : 00 สำหรับ
เน้นกลุ่ม fishwere anesthetizedwithms-222 และเบลดจาก
เส้นเลือดที่หางด้วยกลุ่ม 3 ml หลอดฉีดยา ตัวอย่างพลาสมา
รวบรวม และจัดเก็บที่− 80 °องศาเซลเซียสจนใช้ ตัวอย่างเวลาต่อปลา
ประมาณ 3 นาทีโดยเดียวกันสามนักวิจัย
ทุกครั้ง
2.2 . กลูโคสและระดับ cortisol
ระดับน้ำตาลในเลือด การวัดหนึ่งสัมผัส ultra2 พาณิชย์
กลูโคสเมตร ระดับ cortisol พลาสม่าถูกวัดโดย
radioimmune ( ตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น ( kiyma et al . , 2004 ) ที่
มหาวิทยาลัย รัฐนิว เม็กซิโกลาสครูเซส .
2.3 ผิวเมือกแบคทีเรียแยกจานนับ
รวมผิวเมือกเพื่อขูดผิวของร่างกายของ
ปลาด้วยมีดโกนเซลล์ที่เป็นหมันและเก็บใส่จาน Petri เป็นหมัน ที่แยกได้จากแบคทีเรียผิว

3 ชุดขั้นตอนตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น ( Xu et al . , 2013 ) พีบีเอสและ 10 μ l
โซลูชั่นถูกชุบลงลุเรียแบร์ตานิ ( ปอนด์ ) แผ่นวุ้น และวุ้นถั่วเหลืองอาหาร
( TSA ) จาน plateswere บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 วัน และเป็นหน่วย ( โคโลนีอาณานิคม
) นับจากสองสมาชิกที่แตกต่าง

ไม่มีความพยายามต่อไปเพื่อหาแบคทีเรียที่คัดเลือกได้
.
2.4 .