2. Materials and methods2.1. Synthe

2. Materials and methods
2.1. Synthesis of PTRHD1 with hexahistidine tag
E. coli codon optimized DNA encoding PTRHD1 was commercially
synthesized (GenScript, NY, USA). PTRHD1 was subcloned
into the pET28b expression vector (Novagen/EMD Millipore, Billerica
MA, USA) using BamHI and NdeI restriction sites. The resulting
PTRHD1 construct had an N-terminal hexahistidine tag and
thrombin protease site directly before the first amino acid. The
integrity of the construct was confirmed by DNA sequencing.
2.2. Recombinant expression of PTRHD1
Chemically competent BL21(DE3)pLysS E. coli (Novagen/EMD4
Biosciences, Darmtstadt, Germany) were transformed with
PTRHD1-pET28b plasmid and grown on LB plates. All bacteria were
grown in the presence of 30 mg/mL kanamycin unless otherwise
noted. A single colony was selected and grown in 3 mL of LB to an
OD600 of approximately 1.0. One milliliter aliquots were briefly
centrifuged at 14,000 g and the supernatant removed. The cell
pellets were resuspended in 500 mL LB and 300 mL of 80% glycerol,
then placed at
80 C to create frozen stocks.
For small scale expression, a 4 mL LB starter culture was inoculated
with ~10 mL of PTRHD1 frozen stock and grown at 37 C
overnight. In the morning, the saturated culture was spun down
and cells resuspended in 40 mL of M9 minimal media containing
4 g/L of glucose. Minimal media was preferable due to increased
solubility of expressed PTRHD1, decreased background after purification,
and the potential for future structural studies requiring
isotope labeling. Grown at 37 C to an OD600 of approximately 0.6,
the culture was then split into 3 mL aliquots and induced with
varying concentrations of IPTG in duplicate. Cultures were grown at
14 C and gel samples were taken. Expression and solubility were
analyzed via SDS-PAGE.
For mid-scale expression in minimal media, a 3 mL LB starter
culture was inoculated with ~10 mL of the PTRHD1 frozen cell stock
and grown overnight at 37 C. The next day the culture was spun
down and cells resuspended in 150 mL of M9 containing 4 g/L
glucose to give a starting OD600 of approximately 0.1. The culture
was grown at 37 C to an OD600 of approximately 0.6, then split into
five 30 mL cultures with the culture volume no more than onefourth
of the total Erlenmeyer flask volume. Cultures were cooled
to 14 C, induced with varying concentrations of IPTG, and grown
overnight at 14 C. The cultures were subsequently harvested and
cell pellets stored at
80 C. Each cell pellet was resuspended in
750 mL of 50mMsodium phosphate, 300mMNaCl, pH 7.4 and lysed
by sonication (Branson Sonifier 250, Branson Ultrasonics, Danbury,
CT, USA) using a 10 repeat schedule of 20 s sonication at 50% power
followed by 20 s of rest on ice until the sample had the consistency
of water. The lysate was separated from cell debris by centrifugation
(16,000 g for 15 min) and soluble protein analyzed via SDSPAGE.
For large scale expression in minimal media, it was found that
starting from cells scraped from plates improved yields compared
to overnight starter cultures. To that end, cells were grown from
PTRHD1 frozen stocks in 1mL of LB media for 1.5 h at 37 C. Roughly
200 mLwas spread onto LB agar plates. Incubated overnight at 37 C,
cells from two plates were scraped into 1 L of M9 minimal media
containing 4 g/L glucose to yield a starting OD600 of approximately
0.1. Cells were grown at 37 C in Erlenmeyer flasks of volume
greater than four times the culture media volume (e.g. no more
than 500 mL of media in a 2 L flask) to an OD600 of 0.6. The culture
was then cooled to 14 C and overexpression of PTRHD1 was
induced with 250 mM IPTG. PTRHD1 was expressed overnight at
14 C before the cells were harvested by centrifugation and cell
pellets stored at
80 C. Verification of PTRHD1 overexpression and
solubility was determined via SDS-PAGE.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. การสังเคราะห์ของ PTRHD1 ด้วยแท็ก hexahistidineE. coli ดีเอ็นเอรหัสพันธุกรรมที่ดีที่สุด PTRHD1 การเข้ารหัสในเชิงพาณิชย์ได้สังเคราะห์ (เจนสคริปต์ นิวยอร์ก สหรัฐอเมริกา) PTRHD1 เป็น subclonedเป็นเวกเตอร์นิพจน์ pET28b (มิลลิพอร์ Novagen/EMD, BillericaMA, USA) BamHI และ NdeI เว็บไซต์จำกัดใช้ ผลสร้าง PTRHD1 มีแท็ก hexahistidine ขั้ว N และเว็บไซต์โปรติเอส thrombin โดยตรงก่อนที่กรดอะมิโนตัวแรก การความสมบูรณ์ของโครงสร้างได้รับการยืนยัน โดยลำดับดีเอ็นเอ2.2. recombinant นิพจน์ของ PTRHD1อำนาจทางเคมี BL21 (DE3) pLysS E. coli (Novagen EMD4ออก Darmtstadt เยอรมนี) ถูกเปลี่ยนด้วยPTRHD1 pET28b plasmid และเติบโตบนแผ่นปอนด์ แบคทีเรียทั้งหมดได้ปลูกในกานามัยซิน 30 มิลลิกรัม/มิลลิลิตรเว้นแต่ว่ามิฉะนั้นตั้งข้อสังเกต เลือกอาณานิคมเดียว และเติบโตใน 3 mL ของปอนด์เพื่อการOD600 ประมาณ 1.0 หนึ่งมิลลิเมตร aliquots ได้สั้น ๆก. 14,000 และ supernatant ออกเหวี่ยง เซลล์เม็ดถูก resuspended ปอนด์ขนาด 500 มล.และ 300 มล.ของกลีเซอรอล 80%แล้ว วางไว้ที่ 80 C เพื่อสร้างหุ้นแช่แข็งInoculated วัฒนธรรม starter mL 4 ปอนด์สำหรับนิพจน์ขนาดเล็กด้วย ~ 10 mL ของ PTRHD1 แช่แข็งสต็อก และเติบโตที่ 37 Cพักค้างคืน ในตอนเช้า วัฒนธรรมอิ่มตัวปั่นลงและ resuspended ใน 40 มล. M9 สื่อน้อยที่สุดประกอบด้วยเซลล์4 g/L ของกลูโคส น้อยสื่อได้ดีกว่าเนื่องจากการเพิ่มขึ้นละลายของ PTRHD1 แสดง พื้นหลังลดลงหลังจากทำให้บริสุทธิ์และศักยภาพในการศึกษาโครงสร้างในอนาคตที่ต้องการติดฉลากไอโซโทป เติบโตที่ 37 C OD600 มีของประมาณ 0.6วัฒนธรรมแบ่งออกเป็น 3 mL aliquots และเกิดด้วยแล้วเข้มข้นแตกต่างกันของ IPTG ซ้ำ วัฒนธรรมถูกปลูกที่ตัวอย่าง 14 C และเจที่ถ่าย นิพจน์และละลายวิเคราะห์เพ SDSสำหรับนิพจน์ระดับกลางในสื่อน้อยที่สุด เริ่ม mL 3 ปอนด์วัฒนธรรมคือ inoculated กับ PTRHD1 แช่แข็งเซลล์สต็อก ~ 10 mLและปลูกหลายที่ 37 c ในวันถัดไปที่วัฒนธรรมถูกปั่นลงและ resuspended ใน 150 mL ของ M9 ที่ประกอบด้วย 4 แยกเซลล์กลูโคสจะให้ OD600 การเริ่มต้นของประมาณ 0.1 วัฒนธรรมถูกปลูกที่ 37 C การ OD600 ของประมาณ 0.6 แล้ว แบ่งออกเป็นห้า 30 มล.วัฒนธรรมกับวัฒนธรรมระดับเสียงไม่เกิน onefourthวอลุ่มรวม Erlenmeyer ขวด วัฒนธรรมได้ระบายความร้อนด้วยถึง 14 C เกิดกับความเข้มข้นแตกต่างกันของ IPTG และการเติบโตคืนที่ 14 c วัฒนธรรมต่อมาได้เก็บเกี่ยว และเซลล์ขี้เก็บที่ 80 c แต่ละเซลล์เม็ดถูก resuspended ใน750 mL ของฟอสเฟต 50mMsodium, 300mMNaCl, pH 7.4 และนาทีที่ 37ucโดย sonication (Branson Sonifier 250, Branson Ultrasonics เที่ยวCT สหรัฐอเมริกา) ใช้กำหนดการซ้ำ 10 ของ 20 s sonication 50% กำลังตาม ด้วย 20 s ที่เหลือบนน้ำแข็งจนกว่าตัวอย่างมีความสอดคล้องของน้ำ Lysate ที่ถูกแยกออกจากเศษเซลล์ โดยการหมุนเหวี่ยง(16,000 g 15 นาที) และโปรตีนที่ละลายน้ำได้วิเคราะห์ผ่าน SDSPAGEสำหรับขนาดใหญ่นิพจน์สื่อน้อยที่สุด พบว่าเริ่มต้นจากเซลล์ที่ขูดจากแผ่นอัตราผลตอบแทนที่ดีขึ้นเมื่อเทียบการวัฒนธรรมที่เริ่มต้น ไปที่จุดสิ้นสุด เซลล์ที่ปลูกจากPTRHD1 แช่แข็งหุ้นใน 1 มิลลิลิตรของสื่อปอนด์สำหรับ 1.5 ชั่วโมงที่ 37 เซลเซียสประมาณ200 mLwas ประดับลงบนแผ่นวุ้นปอนด์ ได้รับการกกค้างคืนที่ 37 Cเซลล์จากทั้งสองแผ่นมาขูดเป็น 1 L ของ M9 สื่อน้อยที่สุดประกอบด้วยกลูโคส 4 g/L ให้ผล OD600 การเริ่มต้นของประมาณ0.1. เซลล์ที่ปลูกที่ 37 C ใน Erlenmeyer ขวดของไดรฟ์ข้อมูลมากกว่า 4 ครั้งปริมาณสื่อวัฒนธรรม (เช่นไม่มากกว่าสื่อในแบบขวด 2 ลิตร 500 มิลลิลิตร) ไป OD600 ของ 0.6 วัฒนธรรมแล้วความร้อน 14 C และแสดงออกของ PTRHD1 คือเกิด ด้วย IPTG 250 มม. PTRHD1 ได้แสดงออกในชั่วข้ามคืนC 14 ก่อนเซลล์ถูกเก็บเกี่ยว โดยการหมุนเหวี่ยงและเซลล์แสดงออกของการยืนยัน PTRHD1 C. 80 เม็ด และละลายพิจารณาผ่านทาง SDS-หน้า

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การสังเคราะห์ PTRHD1 ที่มีแท็ก hexahistidine
อี coli codon ดีเอ็นเอเพิ่มประสิทธิภาพการเข้ารหัส PTRHD1 ถูกในเชิงพาณิชย์
สังเคราะห์ (เจนสคริปต์, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) PTRHD1 ถูก subcloned
เข้าไปใน pET28b แสดงออกเวกเตอร์ (Novagen / เมอร์ค, บิลเลริกา
MA, USA) โดยใช้ BamHI และ NdeI เว็บไซต์ข้อ จำกัด ส่งผลให้
PTRHD1 สร้างมีแท็ก hexahistidine และ n- ขั้ว
เว็บไซต์น้ำย่อย thrombin โดยตรงก่อนที่จะมีกรดอะมิโนเป็นครั้งแรก
ความสมบูรณ์ของโครงสร้างได้รับการยืนยันโดยลำดับดีเอ็นเอ.
2.2 การแสดงออกของ recombinant PTRHD1
เคมี BL21 อำนาจ (DE3) pLysS E. coli (Novagen / EMD4
ชีววิทยาศาสตร์ Darmtstadt, เยอรมนี) ถูกเปลี่ยนด้วย
PTRHD1-pET28b พลาสมิดและเติบโตบนจาน LB แบคทีเรียทั้งหมดถูก
ปลูกในการปรากฏตัวของ 30 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรกานามัยซิเว้นแต่จะ
ตั้งข้อสังเกต อาณานิคมเดียวได้รับการคัดเลือกและปลูกใน 3 มล LB ไปยัง
OD600 ประมาณ 1.0 หนึ่ง aliquots มิลลิลิตรในเวลาสั้น ๆ
หมุนเหวี่ยงที่ 14,000 กรัมและใสออก เซลล์
เม็ดถูก resuspended ใน 500 มล LB และ 300 มล 80% กลีเซอรอล
อยู่แล้วที่? 80? C เพื่อสร้างหุ้นแช่แข็ง.
สำหรับการแสดงออกขนาดเล็กวัฒนธรรมเริ่มต้น 4 มล LB ถูกเชื้อ
ด้วย ~ 10 มล PTRHD1 หุ้นแช่แข็ง และการเติบโตที่ 37 องศาเซลเซียส
ในชั่วข้ามคืน ในตอนเช้าวัฒนธรรมอิ่มตัวก็หมุนตัวลง
และเซลล์ resuspended ใน 40 มล M9 สื่อน้อยที่สุดมี
4 กรัม / ลิตรของกลูโคส สื่อน้อยที่สุดก็ยังดีกว่าเนื่องจากการเพิ่มขึ้นของ
การละลายของแสดง PTRHD1 ลดลงพื้นหลังหลังจากที่บริสุทธิ์
และมีศักยภาพสำหรับการศึกษาในอนาคตโครงสร้างที่กำหนดให้
ติดฉลากไอโซโทป การเติบโตที่ 37 องศาเซลเซียสไปยัง OD600 ประมาณ 0.6
วัฒนธรรมจากนั้นก็แบ่งออกเป็น 3 aliquots มิลลิลิตรและเหนี่ยวนำให้มี
ความเข้มข้นแตกต่างของ IPTG ในที่ซ้ำกัน วัฒนธรรมที่มีปลูกอยู่ที่
14 องศาเซลเซียสและเจลถูกนำตัวอย่าง การแสดงออกและการละลายถูก
วิเคราะห์ผ่านระบบ SDS-PAGE.
สำหรับการแสดงออกขนาดกลางในสื่อน้อยที่สุดเริ่มต้นที่ 3 มล LB
วัฒนธรรมเชื้อด้วย ~ 10 มิลลิลิตรของหุ้นที่ถือ PTRHD1 แช่แข็ง
และเติบโตขึ้นในชั่วข้ามคืนที่ 37 องศาเซลเซียส วันรุ่งวัฒนธรรมก็หมุนตัว
ลงและเซลล์ resuspended ใน 150 มล M9 มี 4 กรัม / ลิตร
น้ำตาลกลูโคสที่จะให้เริ่มต้น OD600 ประมาณ 0.1 วัฒนธรรม
เติบโตเป็นผู้ใหญ่ที่ 37 องศาเซลเซียสไปยัง OD600 ประมาณ 0.6 แล้วแบ่งออกเป็น
ห้า 30 มลวัฒนธรรมวัฒนธรรมที่มีปริมาณไม่เกิน onefourth
รวมปริมาณขวด Erlenmeyer วัฒนธรรมที่ถูกระบายความร้อน
ถึง 14? C, เหนี่ยวนำที่มีความเข้มข้นของ IPTG ที่แตกต่างกันและเติบโตขึ้น
ในชั่วข้ามคืนวันที่ 14 องศาเซลเซียส วัฒนธรรมเก็บเกี่ยวและต่อมา
เซลล์เม็ดเก็บไว้ที่? 80? C ตะกอนเซลล์แต่ละ resuspended ใน
750 มล 50mMsodium ฟอสเฟต 300mMNaCl ค่า pH 7.4 และ lysed
โดย sonication (แบรนสัน Sonifier 250, Ultrasonics แบรนสัน, เบอรี,
CT, USA) โดยใช้ตารางเวลา 10 ซ้ำ 20 s sonication ที่กำลังไฟ 50%
ตามมาด้วย 20 ของส่วนที่เหลือบนน้ำแข็งจนกลุ่มตัวอย่างมีความสอดคล้อง
ของน้ำ lysate ถูกแยกออกจากเศษเซลล์โดยการหมุนเหวี่ยง
(16,000 กรัมเป็นเวลา 15 นาที) และโปรตีนที่ละลายน้ำได้วิเคราะห์ผ่าน SDSPAGE.
สำหรับการแสดงออกขนาดใหญ่ในสื่อน้อยที่สุดก็พบว่า
เริ่มต้นจากเซลล์ที่คัดลอกจากแผ่นปรับปรุงอัตราผลตอบแทนเมื่อเทียบ
กับวัฒนธรรมเริ่มต้นในชั่วข้ามคืน ไปสิ้นสุดที่เซลล์เติบโตขึ้นจาก
หุ้นแช่แข็ง PTRHD1 ใน 1 mL ของสื่อ LB 1.5 ชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียส ประมาณ
200 mLwas แพร่กระจายลงบนแผ่นวุ้น LB บ่มค้างคืนที่ 37? C,
เซลล์จากแผ่นเปลือกโลกสองแผ่นถูกคัดลอกลงใน 1 ลิตรของสื่อน้อยที่สุด M9
มี 4 กรัม / ลิตรน้ำตาลกลูโคสเพื่อให้เริ่มต้น OD600 ประมาณ
0.1 เซลล์ที่ถูกปลูกที่ 37 องศาเซลเซียสใน Erlenmeyer ขวดของปริมาณ
มากกว่าสี่ครั้งปริมาณสื่อวัฒนธรรม (เช่นไม่เกิน
กว่า 500 มลของสื่อในกระติกน้ำ 2 ลิตร) เพื่อ OD600 0.6 วัฒนธรรม
ถูกระบายความร้อนแล้วถึง 14 องศาเซลเซียสและแสดงออกของ PTRHD1 ถูก
เหนี่ยวนำให้เกิดกับ 250 มิลลิ IPTG PTRHD1 ถูกแสดงออกมาค้างคืนที่
14 องศาเซลเซียสก่อนที่เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและเซลล์
เม็ดเก็บไว้ที่? 80? C การตรวจสอบของ PTRHD1 แสดงออกและ
การละลายถูกกำหนดโดยผ่านระบบ SDS-PAGE

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ2.1 . การสังเคราะห์ ptrhd1 กับการแท็กE . coli รหัสพันธุกรรม DNA ptrhd1 การเข้ารหัสที่เหมาะสมในเชิงพาณิชย์สังเคราะห์ ( genscript , NY , USA ) ของ ptrhd1 คือใน pet28b นิพจน์เวกเตอร์ ( novagen / EMD มิลลิ , โตเกียวMA , USA ) ด้วย BamHI และเว็บไซต์ข้อ จำกัด ndei . ที่เกิดขึ้นptrhd1 มีแท็กการสร้างกรดอะมิโนและโปรทรอมบินเว็บไซต์โดยตรงก่อนกรดอะมิโนที่แรก ที่ความสมบูรณ์ของโครงสร้างที่ได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับดีเอ็นเอ2.2 . การแสดงออกของยีน ptrhd1ต่อพนักงานเจ้าหน้าที่ BL21 ( DE3 ) plyss E . coli ( novagen / emd4ชีววิทยา darmtstadt , เยอรมนี ) ถูกเปลี่ยนด้วยptrhd1-pet28b สายพันธุ์ปลูกในปอนด์และจาน แบคทีเรียทั้งหมดคือโตต่อหน้า 30 มก. / มล. เว้นแต่เหตุผลตั้งข้อสังเกต กลุ่มเดียวที่ปลูก 3 มล. ของปอนด์เป็นod600 ประมาณ 1.0 หนึ่งมิลลิลิตรเฉยๆได้สั้น ๆระดับที่ 500 กรัมและนำออก เซลล์อัตรา resuspended 500 ml ปอนด์และ 300 มล. 80 % กลีเซอรอลแล้วอยู่ที่ 80 C เพื่อสร้างหุ้นแช่แข็งสำหรับการแสดงออกขนาดเล็ก 4 ml ปอนด์กล้าเชื้อเป็นเชื้อกับ ~ 10 มิลลิลิตร ptrhd1 แช่แข็งและหุ้นเติบโตที่ 37 องศาเซลเซียสเพียงชั่วข้ามคืน ในตอนเช้า , ไขมันอิ่มตัววัฒนธรรมถูกปั่นลงและเซลล์ resuspended 40 มล. M9 น้อยที่สุดสื่อที่มี4 g / L ของกลูโคส สื่อน้อยที่สุด คือเพิ่มขึ้นจากกว่าการละลายของแสดง ptrhd1 ลดลงพื้นหลังการฟอกและศักยภาพในการศึกษาโครงสร้างอนาคตที่ต้องการไอโซโทปของการติดฉลาก ปลูกที่อุณหภูมิ 37 เป็น od600 ประมาณ 0.6 ,วัฒนธรรม คือ แยกเป็น 3 ml เฉยๆและกระตุ้นด้วยความเข้มข้นแตกต่างกันของโปรตีนในที่ซ้ำกัน วัฒนธรรมที่ถูกปลูกอยู่14 C และตัวอย่างเจลแล้ว การแสดงออกและละลายคือวิเคราะห์โดย SDS-PAGE .สำหรับการแสดงออกระดับกลางในสื่อน้อยที่สุด เริ่มต้นปอนด์ 3 มล.วัฒนธรรมเป็นเชื้อ ~ 10 ml ของ ptrhd1 เซลล์สินค้าแช่แข็งและเติบโตค้างคืนที่ 37 องศาเซลเซียสรุ่งวัฒนสานลงและเซลล์ resuspended 150 มิลลิลิตรบรรจุใน M9 4 กรัมต่อลิตรกลูโคส เพื่อให้เริ่ม od600 ประมาณ 0.1 วัฒนธรรมปลูกที่อุณหภูมิ 37 เป็น od600 ประมาณ 0.6 แล้วแบ่งเป็น5 30 ml วัฒนธรรมกับวัฒนธรรมปริมาณไม่เกิน onefourthทั้งหมดของเออร์เลนเมเยอร์ขวดปริมาตร วัฒนธรรมที่ถูกระบายความร้อนด้วย14 องศาเซลเซียส และความเข้มข้นของโปรตีนที่แตกต่างกัน และโตค้างคืนที่ 14 C เก็บต่อมาวัฒนธรรมและเซลล์เม็ดไว้ที่ 80 องศาเซลเซียส แต่ละเซลล์มี resuspended ในเม็ด750 มิลลิลิตร 50mmsodium ฟอสเฟต 300mmnacl lysed pH 7.4 และโดย sonication แบรนสันแบรนสันอัลตราโซนิกส์ ( sonifier 250 , ด้วย , ,CT , สหรัฐอเมริกา ) โดยใช้ตาราง 10 ย้ำ 20 S sonication 50% พลังงานตามด้วย 20 S ที่เหลือบนน้ำแข็งจนตัวอย่างมีความสอดคล้องกันของน้ำ การ lysate แยกจากเศษเซลล์ โดยการปั่นเหวี่ยง( 16 , 000 กรัม 15 นาที ) และโปรตีนที่ละลายน้ำได้ วิเคราะห์ข้อมูลทาง sdspage .สำหรับการแสดงขนาดใหญ่ในสื่อน้อยที่สุด พบว่าเริ่มจากเซลล์ขูดแผ่นการปรับปรุงผลผลิต เทียบวัฒนธรรมเริ่มต้นในชั่วข้ามคืน ไปสิ้นสุดที่เซลล์เติบโตจากptrhd1 แช่แข็งหุ้นใน 1ml สื่อของปอนด์ 1.5 H ที่ 37 องศาเซลเซียส ประมาณ200 ปอนด์ต่อ mlwas กระจายลงบนจาน บ่มค้างคืนที่ 37 องศาเซลเซียสเซลล์จากสองจานถูกขูดไป 1 ลิตร M9 น้อยที่สุด มีเดียประกอบด้วย 4 กรัมต่อลิตรและกลูโคสให้ผลผลิตเริ่ม od600 ประมาณ0.1 เซลล์มีการโตขึ้นที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ในเออร์เลนเมเยอร์ขวดปริมาตรมากกว่าสี่เท่าของวัฒนธรรมสื่อเสียง ( เช่นไม่มีกว่า 500 ml ของสื่อใน 2 ลิตรขวด ) กับ od600 0.6 . วัฒนธรรมมันเย็นแล้วถึง 14 องศาเซลเซียส และ overexpression ของ ptrhd1 คือกระตุ้นด้วยโปรตีน 250 มิลลิเมตร ptrhd1 ได้ค้างคืนที่14 C ก่อนเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงและเซลล์เม็ดไว้ที่ 80 C . การตรวจสอบ ptrhd1 overexpression และโดยถูกกำหนดผ่านทางเอนไซม์ .