MethodsLentectomyAxolotl larvae (st

Methods
Lentectomy
Axolotl larvae (st35 and st43, pre-hatched) were supplied
from the Ambystoma Genetic Stock Center (Department
of Biology, Univ. of Kentucky, KY, USA) and kept at 27°C.
The hatched larvae were fed brine shrimp. Larvae were
anesthetized in 0.1% ethyl 3-aminobenzoate (#E10521;
Sigma, St. Louis, MO, USA) at different stages. Using a
sharp-edged blade, an incision was made in the cornea,
and then the lens was removed in its entirety. At different
time intervals after lentectomy, animals were fixed in
methanol acetic acid solution (methanol: acetic acid = 3:1)
at 4°C overnight and processed for paraffin embedding.
Similar series were also performed using zebrafish
embryos (wild-type Ekkwill strain) at different stages. Animal
care adhered to the guide lines of the Institutional
Animal Care and Use Committee (IACUC), University of
Dayton (axolotl) and of the IACUC, Cincinnati Children’s
Hospital Medical Center (zebrafish).
Hematoxylin and Eosin staining and
immunohistochemistry
Paraffin sections of 15 μm were deparaffinized and used
for H & E staining and immunohistochemistry. For H & E
staining, hematoxylin (#26754-01; Electron Microscope
Sciences, Hatfield, PA, USA) and eosin (#26762-01; Electron
Microscope Sciences) were used. To examine cell
proliferation in the iris after lentectomy, 5-bromo-2’-
deoxyuridine (BrdU; #B5002; SIGMA, 75 ug/g body
weight) was injected into larvae 3 hours before fixation.
Sections from BrdU injected larvae were treated with 1N
HCl for 5 minutes at room temperature, blocked in TNB
buffer (0.1 M Tris-HCl, pH7.5; 0.15 M NaCl; and 0.5%
blocking reagent) supplied in the TSA kit (Perkin Elmer,
Waltham, MA, USA) and incubated with mouse anti-
BrdU antibody (1/100 dilution, #MAB3510; Millipore,
Billerica, MA, USA) overnight at 4°C, and subsequently
washed and incubated with Alexa 488 conjugated antiimmunoglobulin
G (IgG) (1/100 dilution, Invitrogen,
Grand Island, NY, USA) for 90 minutes at room temperature.
To monitor lens regeneration, sections were incubated
with anti g-crystallin rabbit antibody (1/300 dilution,
source bovine crystallin) and then detected with an
anti-rabbit Cy3 conjugated antibody (1/100 dilution,
Millipore). Immunohistochemistry images were taken
using a BX51 microscope (Olympus, Tokyo, Japan) with a
CCD camera (Cool SNAP cf2; Photometrics, Tucson, AZ,
USA) and imaging software (Metamorph, Molecular
Devices, Eugene, OR, USA), or by confocal imaging
(Olympus FV500 confocal microscope).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการLentectomyตัวอ่อนแอกโซลอเติล (st35 และ st43 ก่อนฟัก) ได้ให้จาก Ambystoma พันธุหุ้นศูนย์ (กรมชีววิทยา มหาวิทยาลัยเคนทักกี KY สหรัฐอเมริกา) และเก็บไว้ที่ 27 องศาเซลเซียสตัวอ่อนขีดถูกเลี้ยงกุ้งในน้ำเกลือ ตัวอ่อนได้ด้วยใน 0.1% เอทิล 3-aminobenzoate (#E10521ซิก St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ในระยะต่าง ๆ โดยใช้การขอบคมใบมีด ทำในกระจกตา แผลเป็นและเลนส์ถูกเอาออกทั้งหมดแล้ว ที่แตกต่างกันช่วงเวลาหลังจาก lentectomy สัตว์ที่ถาวรในแก้ปัญหากรดอะซิติกเมทานอล (เมทานอล: กรดอะซิติก = 3:1)ที่ 4° C ค้างคืน และประมวลผลพาราฟินฝังตัวชุดคล้ายยังดำเนินใช้ปลาม้าลายโคลน (ต้องใช้ Ekkwill ป่าชนิด) ในระยะต่าง ๆ สัตว์ดูแลปฏิบัติตามใบแนะนำ Institutionalใช้กรรมการ (IACUC), มหาวิทยาลัยและดูแลสัตว์เดย์ตัน (แอกโซลอเติล) และการ IACUC เด็กซินซินนาติของศูนย์การแพทย์โรงพยาบาล (ปลาม้าลาย)Hematoxylin และย้อมสี Eosin และimmunohistochemistryพาราฟินส่วนของ 15 μm deparaffinized และใช้ย้อมสี H & E และ immunohistochemistry H และ Eการย้อมสี hematoxylin (#26754-01 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนวิทยาศาสตร์ แฮทฟิลด์ PA สหรัฐอเมริกา) และ eosin (#26762-01 อิเล็กตรอนใช้กล้องจุลทรรศน์วิทยา) การตรวจสอบเซลล์แพร่หลายในดิไอริสหลัง lentectomy, 5-โบรโม-2'-deoxyuridine (BrdU; #B5002 ซิก ร่างกายยู จี/g 75น้ำหนัก) ถูกฉีดเข้าไปในตัวอ่อน 3 ชั่วโมงก่อนเบีส่วนจาก BrdU ฉีดตัวอ่อนได้รับการรักษา ด้วย 1NHCl 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง บล็อกใน TNBบัฟเฟอร์ (0.1 M ทริสเรทติ้ง HCl, pH7.5; 0.15 M NaCl และ 0.5%บล็อกรีเอเจนต์) จัดอยู่ในชุด TSA (เพอร์เอลเมอWaltham, MA, USA) และ incubated กับเมาส์ต่อต้าน -BrdU แอนติบอดี (1/100 เจือจาง #MAB3510 มากBillerica, MA, USA) นอน ที่ 4 ° C และในเวลาต่อมาหิน และ incubated กับ antiimmunoglobulin Alexa 488 กลวงG (IgG) (1/100 เจือจาง Invitrogenเกาะแกรนด์ NY, USA) 90 นาทีที่อุณหภูมิห้องมี incubated ส่วนการตรวจสอบเลนส์ฟื้นฟูมีป้องกัน g crystallin กระต่ายแอนติบอดี (เจือจาง 1/300แหล่งวัว crystallin) และจากนั้น ตรวจพบการกระต่ายป้องกัน Cy3 กลวงแอนติบอดี (เจือจาง 1/100มาก) Immunohistochemistry ภาพที่ถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ BX51 (โอลิมปัส โตเกียว ญี่ปุ่น) เป็นกล้อง CCD (SNAP เย็น cf2 Photometrics ทูซอน AZสหรัฐอเมริกา) และภาพซอ (Metamorph โมเลกุลอุปกรณ์ Eugene, OR สหรัฐอเมริกา), หรือภาพ confocal(การกล้องจุลทรรศน์ confocal FV500 โอลิมปัส)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธี
Lentectomy
Axolotl ตัวอ่อน (ST35 และ st43 ก่อนฟัก) ถูกให้มา
จากพันธุกรรม Ambystoma ศูนย์สต็อก (ภาควิชา
ชีววิทยา Univ. เคนตั๊กกี้, เคนทักกี, USA) และเก็บไว้ที่ 27 ° C.
ตัวอ่อนที่ฟักออกมาเป็นอาหารกุ้งทะเล ตัวอ่อนที่ถูก
วางยาสลบใน 0.1% เอทิล 3 aminobenzoate (# E10521;
Sigma, St. Louis, MO, USA) ในขั้นตอนที่แตกต่างกัน การใช้
ใบมีดคมขอบแผลที่ถูกสร้างขึ้นในกระจกตา
และเลนส์นั้นจะถูกลบออกอย่างครบถ้วน ที่แตกต่างกัน
ในช่วงเวลาหลังจาก lentectomy สัตว์ได้รับการแก้ไขใน
เมทานอลสารละลายกรดอะซิติก (เมทานอล: กรดอะซิติก = 3: 1)
ที่ 4 ° C ค้างคืนและประมวลผลสำหรับการฝังพาราฟิน.
ชุดที่คล้ายกันได้ดำเนินการยังมีการใช้ zebrafish
ตัวอ่อน (ป่าชนิดสายพันธุ์ Ekkwill ) ในขั้นตอนที่แตกต่างกัน สัตว์
การดูแลปฏิบัติตามแนวทางของสถาบัน
การดูแลสัตว์และการใช้คณะกรรมการ (IACUC) มหาวิทยาลัย
เดย์ (Axolotl) และ IACUC, ซินซินเด็ก
ที่โรงพยาบาลศูนย์การแพทย์ (zebrafish).
Hematoxylin และการย้อมสี Eosin และ
immunohistochemistry
ส่วนพาราฟิน 15 ไมโครเมตร ถูก deparaffinized และใช้
สำหรับการย้อมสี H & E และ immunohistochemistry สำหรับ H & E
ย้อมสี, hematoxylin (# 26754-01; Electron Microscope
วิทยาศาสตร์, ฮัท, PA, USA) และ Eosin (# 26762-01; Electron
Microscope วิทยาศาสตร์) ถูกนำมาใช้ เพื่อตรวจสอบเซลล์
ในการขยายม่านตาหลังจาก lentectomy, 5-Bromo-2'-
deoxyuridine (BrdU; # B5002; SIGMA 75 ไมโครกรัม / กรัมร่างกาย
น้ำหนัก) ได้รับการฉีดเข้าไปในตัวอ่อน 3 ชั่วโมงก่อนที่จะตรึง.
ส่วนจาก BrdU ฉีดตัวอ่อนได้รับการรักษาด้วย 1N
HCl เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องถูกบล็อกใน TNB
บัฟเฟอร์ (0.1 M Tris-HCl, pH7.5; 0.15 M NaCl และ 0.5%
ปิดกั้นสาร) ที่ให้มาในชุด TSA (Perkin Elmer,
เคมบริดจ์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) และ บ่มกับต่อต้านเมาส์
แอนติบอดี BrdU (1/100 เจือจาง # MAB3510; ค
บิลเลริกา, MA, USA) ค้างคืนที่ 4 ° C และต่อมา
ล้างและบ่มกับ Alexa 488 ผัน ​​antiimmunoglobulin
G (IgG) (1/100 เจือจาง Invitrogen,
Grand Island, NY, USA) เป็นเวลา 90 นาทีที่อุณหภูมิห้อง.
ในการตรวจสอบการฟื้นฟูเลนส์ส่วนถูกบ่ม
กับการป้องกัน G-crystallin แอนติบอดีกระต่าย (1/300 เจือจาง
แหล่ง crystallin วัว) และตรวจพบแล้วกับ
Cy3 ต่อต้านกระต่าย แอนติบอดีผัน (1/100 เจือจาง
ค) ภาพ immunohistochemistry ถูกนำมา
ใช้กล้องจุลทรรศน์ BX51 (Olympus, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ด้วย
กล้อง CCD (คู CF2 SNAP; Photometrics, Tucson, AZ,
USA) และซอฟแวร์การถ่ายภาพ (Metamorph โมเลกุล
อุปกรณ์ Eugene, OR, USA) หรือโดยการ การถ่ายภาพ confocal
(โอลิมปั FV500 กล้องจุลทรรศน์ confocal)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีการ lentectomy

( st35 ตัวอ่อนแอกโซลอเติล และ st43 ก่อนฟัก ) ได้จัด
จาก ambystoma พันธุกรรม Stock ศูนย์ ( แผนก
ของชีววิทยา มหาวิทยาลัยเคนตั๊กกี้ , KY , USA ) และเก็บไว้ที่ 27 ° C .
ตัวอ่อนฟักเลี้ยงกุ้งน้ำเค็มชนิดหนึ่ง ~ i )
ยาสลบใน 0.1% เอทิล 3-aminobenzoate ( # e10521 ;
Sigma , St . Louis , MO , USA ) ที่ระยะต่าง ๆ ใช้
คมขอบใบการผ่าตัดทำในกระจกตา
แล้วเลนส์จะถูกลบออกอย่างครบถ้วน ในช่วงเวลาที่แตกต่างกัน เวลา lentectomy
หลังจากที่สัตว์ได้รับการแก้ไขในสารละลายเมทานอล ( เมทิลแอลกอฮอล์กรดน้ำส้ม
: กรด = 3 : 1 )
4 ° C ในชั่วข้ามคืน และประมวลผลสำหรับพาราฟินฝังตัว .
ชุดคล้ายกันยังดำเนินการใช้ปลาม้าลาย
ตัว ( ของ ekkwill สายพันธุ์ ) ที่ระยะต่าง ๆ สัตว์
การยึดติดกับแนวทางของสถาบัน
ดูแลสัตว์และใช้คณะกรรมการ ( iacuc ) มหาวิทยาลัย
เดย์ ( แอกโซลอเติล ) และของ iacuc cincinnati เด็กศูนย์การแพทย์ , โรงพยาบาล ( ปลาม้าลาย )
.
ย้อมและ eosin คราบ

ส่วนพาราฟินและหลอด 15 μเมตรและใช้สำหรับ deparaffinized
H & E staining และหลอด . สำหรับ& E
. H ,ย้อม ( # 26754-01 ; กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
วิทยาศาสตร์ , ฮัท , PA , USA ) และ eosin ( # 26762-01 ;
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนวิทยาศาสตร์ ) สถิติที่ใช้ ตรวจสอบเซลล์
proliferation ในไอริสหลังจากที่ lentectomy 5-bromo-2 , ' -
deoxyuridine ( brdu ; # b5002 ; Sigma 75 ไมโครกรัม / กรัมน้ำหนักร่างกาย
) ฉีดเข้าไปในตัวอ่อน 3 ชั่วโมงก่อนการตรึง .
ส่วนจาก brdu ฉีดตัวอ่อนได้รับการรักษากับ 1n
กรดไฮโดรคลอริกสำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง บล็อกใน tnb
บัฟเฟอร์ ( 0.1 M HCl ph7.5 ; อย่างไรก็ตาม , 0.15 M NaCl 0.5%
บล็อก และ 3 ) จัดอยู่ในชุด ( เพอร์กินเอลเมอร์
TSA , วอลแทม , MA , USA ) และบ่มด้วยเมาส์ anti -
brdu แอนติบอดี ( 1 / 100 #เจือจาง mab3510 มิลลิ ,
; บิลเลริกา , MA , USA ) ค้างคืนที่ 4 ° C และต่อมา
ล้างโดย Alexa 488 conjugated antiimmunoglobulin
จี ( IgG ) ( 1 / 100 ( Invitrogen
, , เกาะแกรนด์ , นิวยอร์ก , สหรัฐอเมริกา ) 90 นาที ที่อุณหภูมิห้อง
ตรวจสอบการฟื้นฟูเลนส์ บางส่วนถูกบ่ม
กับแอนติบอดีต่อต้าน g-crystallin กระต่าย ( 1 / 300 เจือจาง
แหล่งวัวคริสตัลลิน ) และตรวจพบว่ามี cy3 ป้องกันกระต่ายเป็น
และแอนติบอดี ( 1 / 100 เจือจาง
มิลลิ ) หลอดภาพถ่าย
ใช้ bx51 กล้องจุลทรรศน์ ( Olympus ,โตเกียว , ญี่ปุ่น ) กับ
กล้อง CCD ( เย็นตะครุบ cf2 ; photometrics Tucson , AZ
สหรัฐอเมริกา ) และซอฟแวร์ภาพ ( metamorph โมเลกุล
อุปกรณ์ , ยูจีน , หรือ , USA ) หรือตามด้วยการถ่ายภาพ
( Olympus fv500 กล้องจุลทรรศน์ด้วย )