Individual excysted metacercariae p

Individual excysted metacercariae preserved in 96% ethanol
were air-dried and lysed at 55 C in 30 mL of lysis reagent [Tween 20
(0.45%), proteinase K (60 mL/mL) 10 mMTris and 1 mM EDTA].
Complete lysis was confirmed by microscopy, whereafter the proteasewas
inactivated at 95 C for 10 min (Thuy, Kania, & Buchmann,
2010). PCR reactions were performed in a volume of 60 mL containing
2 mL lysate as template, 1 unit of BIOTAQ™DNA polymerase
(DNA-Technology), 1 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, and 1 mM of the
primers. In order to amplify the ITS region the primers Diplost_F3
(50- AGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGe30)/Diplost_R4 (50- TATGCTTAA
ATTCAGCGGGTe30) were used (Galazzo, Dayanandan, Marcogliese,
& McLaughlin, 2002), and to amplify the mt DNA-Cox1 region the
primers COI2575F (50-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-30)/COI302
1R (50- TAAAGAAAGAACATAATGAAAATGe30) were used (Bowles,
Blair, & McManus, 1992). PCR was carried out in a Biometra T3
thermocycler (Fisher Scientific) using the following cycling parameters:
ITS primers - pre-denaturation at 94 C for 5 min, 45
cycles of 94 C for 30 s, 57 C for 30 s, 72 C for 1 min and postelongation
of 72 C for 7 min. COI primers e pre-denaturation at
94 C for 5 min, 35 cycles of 94 C for 30 s, 50.9 C for 30 s, 72 C for
40 s and post-elongation of 72 C for 7 min. The products were
analyzed by ethidium bromide-stained 1.5% agarose gel electrophoresis.
PCR products were purified using the illustra™GFX™PCR
DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) and sequenced
at Macrogen Inc. (South Korea) using the PCR primers.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Metacercariae ละ excysted ใน 96% เอทานอลถูก air-dried และนาทีที่ 37uc ที่ 55 C ใน 30 mL ของรีเอเจนต์ lysis [โลก 20(0.45%), proteinase K (กรัม/มิลลิลิตร) 10 mMTris และ 1 mM EDTA]กล้องจุลทรรศน์ whereafter proteasewas การยืนยัน lysis สมบูรณ์ยก c 95 เป็นเวลา 10 นาที (Thuy, Kania, & Buchmann2010) ดำเนินการในปริมาณ 60 มล.มีปฏิกิริยา PCR2 mL lysate เป็นแม่ BIOTAQ™ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส 1 หน่วย(ดีเอ็นเอเทคโนโลยี), dNTP 1 มิลลิเมตร 1.5 มม. MgCl2 และ 1 มม.ของการไพรเมอร์ เพื่อขยายพื้นที่ของไพรเมอร์ Diplost_F3(50 - AGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGe30) / Diplost_R4 (50-TATGCTTAAATTCAGCGGGTe30) ถูกใช้ (ของ Galazzo, Dayanandan, Marcoglieseและแม็กลาฟลิน 2002), และ การขยายภาค mt Cox1 ดีเอ็นเอไพรเมอร์ COI2575F (50-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-30) / COI3021R (50-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATGe30) ถูกใช้ (Bowlesแบลร์ & เดมบาบา 1992) PCR ได้ดำเนินการใน T3 Biometrathermocycler (Fisher วิทยาศาสตร์) โดยใช้พารามิเตอร์การขี่จักรยานต่อไปนี้:ไพรเมอร์ - แปรสภาพก่อนที่ 94 C 5 นาที 45รอบของ 94 C 30 s, 57 C s, 72 C 30 นาทีและ postelongationของ C 72 สำหรับ 7 นาที COI ไพรเมอร์ e ก่อนแปรสภาพที่94 C 5 นาที 35 รอบ 94 C 30 s, C 50.9 30 s, C 72 สำหรับ40 s และดึงหลังของ C 72 7 นาที ผลิตภัณฑ์ได้วิเคราะห์ โดย ethidium ย้อมโบรไมด์ 1.5% agarose เจลอิผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์โดยใช้การ illustra™ GFX™ PCRดีเอ็นเอและชุดฟอกวงเจ (GE สุขภาพ) และตามลำดับที่ Macrogen Inc. (เกาหลีใต้) โดยใช้ไพรเมอร์ PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บุคคล metacercariae excysted เก็บรักษาไว้ใน 96% เอทานอล
ได้รับอากาศแห้งและ lysed ที่ 55 องศาเซลเซียสใน 30 มลสลายสาร [Tween 20
(0.45%) โปร K (60 มิลลิลิตร / มิลลิลิตร) 10 mMTris และ 1 mM EDTA].
สลายสมบูรณ์ ได้รับการยืนยันโดยกล้องจุลทรรศน์ whereafter proteasewas
การใช้งานที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที (Thuy, Kania และ Buchmann,
2010) ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในปริมาณ 60 มิลลิลิตรมี
2 lysate มลเป็นแม่, 1 หน่วย BIOTAQ ™ DNA Polymerase
(DNA-Technology) 1 มิ dNTP 1.5 มิลลิ MgCl2 และ 1 มิลลิของ
ไพรเมอร์ เพื่อขยายพื้นที่ของไพรเมอร์ Diplost_F3
(50- AGGAATTCCTGGTAAGTGCAAGe30) / Diplost_R4 (50- TATGCTTAA
ATTCAGCGGGTe30) ถูกนำมาใช้ (Galazzo, Dayanandan, Marcogliese,
& กิ้น, 2002) และจะขยายภูมิภาคมอนแทนาดีเอ็นเอ Cox1
ไพรเมอร์ COI2575F (50 TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-30) / COI302
1R (50- TAAAGAAAGAACATAATGAAAATGe30) ถูกนำมาใช้ (โบว์ลส์
แบลร์และ McManus, 1992) PCR ได้ดำเนินการใน Biometra T3
thermocycler (Fisher Scientific) โดยใช้พารามิเตอร์การขี่จักรยานต่อไปนี้:
? ไพรเมอร์ของ - ก่อน denaturation ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, 45
? รอบ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที 57 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ postelongation
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที ไพรเมอร์ COI E ก่อน denaturation ที่
94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, 35 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 50.9 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที 72? C เป็นเวลา
40 วินาทีและหลังการยืดตัวของ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาที ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการ
วิเคราะห์โดย ethidium bromide เปื้อน 1.5% agarose ข่าวคราว.
ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์โดยใช้ภาพประกอบ™ GFX ™ PCR
DNA และวงดนตรีเจลฟอก Kit (GE Healthcare) และลำดับขั้นตอน
ที่ Macrogen อิงค์ (เกาหลีใต้) โดยใช้ไพรเมอร์ PCR .